2. daļa:6-brom-indirubīna-3 ′ -oksīma (6-BIO) anti-fibrozes efekts, regulējot aktivatora proteīnu-1 (AP-1) un specifiskuma proteīnu-1 (SP-1) transkripcijas faktorus nieru šūnās

Lai skatītu 1. daļu, noklikšķiniet uzšeit.

3.3. 6-BIO vājina fibrozes marķierus un ar fibrozi saistītus signalizācijas ceļus proksimālā kanāliņa (HK-2) un intersticiālā fibroblasta (NRK49F) šūnās

Tālāk mēs apstiprinājām 6-BIO ietekmi uz proksimālām cauruļveida šūnām un intersticiālām fibroblastu šūnām. Mēs novērojām no koncentrācijas un laika atkarīgu GSK3β mRNS ekspresijas samazināšanos par 6-BIO HK-2 un NRK49F šūnās (att. S2A un B), kā arī ECM un ar EMT saistītu proteīnu ekspresiju, kas iesaistītinierešūnaFibrozetika samazināts arī (Att. S2E). Turklāt uzlabota GSK3β ekspresija, TGFβ iedarbībai uz šīm šūnām, samazinājās arī par 6-BIO ārstēšanu (att. S2C un D). 3. attēlā parādīta olbaltumvielu ekspresijaniereFibrozemarķieri HK-2 un NRK49F šūnās, kas apstrādātas ar TGFβ. Kā parādīts 3.A attēlā, PAI-1 un CTGF proteīnu ekspresija ievērojami palielinājās, reaģējot uz ārstēšanu ar 5 un 10 ng/ml TGFβ attiecīgi HK-2 un NRK49F šūnās. Tomēr to izpausme ievērojami samazinājās pēc ārstēšanas ar 6-BIO (3.B attēls).SMADun MAPK signalizācijas ceļus regulēja TGFβ ārstēšana, ko apvērsa 6-BIO ārstēšana (4. att.). Tālāk mēs pētījām AP-1 un SP-1 transkripcijas faktoru ekspresiju, kas saistīti ar TGFβ mediēto signalizāciju HK-2 un NRK49F šūnās. 4D attēlā redzams, ka TGFβ mediētais P-C-JUN un P-C-FOS pieaugums tika samazināts, reaģējot uz ārstēšanu ar 6-BIO un JNK inhibitoru SP600125 un pēc dominējoša-negatīva C-JUN transfekcijas. 4.E attēlā parādītas olbaltumvielu intensitātes izmaiņas attiecībā pret kontroli. Turklāt TGFβ mediētais SP-1 līmeņa pieaugums bija ievērojami vājinājās, reaģējot uz ārstēšanu ar 6-BIO un SP-1 siRNS (4.F attēls). 4G attēlā parādītas olbaltumvielu intensitātes izmaiņas attiecībā pret kontroli. Šie rezultāti liecināja, ka TGFβ/SMADun MAPK signalizāciju, kā arī transkripcijas faktorus AP-1 un SP-1 regulē 6-BIO.

3.4. 6-BIO vājina P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1 proteīnu kodol ekspresiju proksimālās cauruļveida un intersticiālo fibroblastu šūnās

5.A un B attēlā parādīta PAI-1 un CTGF lokalizācija ar P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1. P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1 sarkanā krāsošana liecināja par to pārmērīgu ekspresiju kodolā pēc TGFβ ārstēšanas; līdzīgi, pai-1 un CTGF zaļā krāsošana norādīja uz to pārmērīgu izpausmi citozolā. Tomēr P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1 ekspresijas līmeņi tika samazināti ar 6-BIO ārstēšanu. Šie rezultāti liecināja, ka 6-BIO tieši ietekmē AP-1 un SP-1, transkripcijas faktorus, kas regulē PAI-1 un CTGF ekspresiju.

3.5. 6-BIO vājina PAI-1, CTGF, AP-1 un SP-1 promotora aktivitāti proksimālo cauruļveida un intersticiālu fibroblastu šūnās

Tālāk mēs pētījām, vai 6-BIO inhibē PAI-1, CTGF, AP-1 un SP-1 gēnu promotora aktivitātes. PAI-1 un CTGF veicinātāja aktivitāte palielinājās, reaģējot uz TGFβ, bet samazinājās ar 6-BIO ārstēšanu (6.A un B attēls). Turklāt samazinājums bija ievērojams, kad šūnas tika ārstētas tikai ar 6-BIO nekā TGFβ klātbūtnē. AP-1 un SP-1 ir saistīti ar PAI-1 un CTGF veicinātājiem. 6C un 6D attēlā parādīta AP-1 un SP-1 veicinātāja aktivitāte. Ārstēšana ar TGFβ palielināja AP-1 un SP-1 luciferāzes aktivitāti un no devas atkarīgā veidā samazinājās par 6-BIO. 6E attēlā parādīta transkripcijas faktora izpausme kodolproteīnu ekstraktos. Tādējādi mēs apstiprinājām, ka P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1 kodol ekspresija palielinājās, reaģējot uz TGFβ ārstēšanu, un to nomāca 6-BIO ārstēšana. 6F attēlā parādītas olbaltumvielu intensitātes izmaiņas attiecībā pret kontroli. Turklāt mūsu rezultāti liecina, ka 6-BIO darbojas uz veicinātāja transkripcijas faktora saistošo vietu, lai vājinātu AP-1 un SP-1 saistīšanos. Mēs veicām in vitro promotoru saistīšanas testu 6-BIO klātbūtnē, lai apstiprinātu to pašu. Kodolproteīnu un P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1 saistīšanos vājināja, pievienojot 6-BIO no koncentrācijas atkarīgā veidā (3. attēls). Šie rezultāti liecina, ka 6-BIO inhibē PAI-1 un CTGF veicinātāja aktivitātes, kā arī AP-1 un SP-1 funkcijas; tādējādi tam var būt terapeitisks potenciālsniereFibroze.

4. Diskusija

Izmantojot žurku modeli UUO un apstrādāti ar TGFβniereproksimālo kanāliņu atvasinātās un intersticiālās fibroblastu šūnu līnijas, mēs parādījām, ka 6-BIO ārstēšana var vājinātnieresabojāt. UUO modelis ir reprezentatīvs dzīvnieku modelis obstruktīvai nefropātijai, ko raksturo progresējoša tubulointerstitālaFibroze[43]. Histopatoloģiskā analīzeniereaudi, kas iegūti no UUO modeļa, parādīja, ka ECM uzkrāšanās un cauruļveida atrofija intersticiālajā telpā tika atjaunota ar 6-BIO ārstēšanu. Turklāt, izmantojot TGFβ apstrādātuniereproksimālās tubulu atvasinātās un intersticiālās fibroblastu šūnas, mēs parādījām, ka 6-BIO ārstēšana var vājinātnieresabojāt. UUO modelī un ar TGFβ apstrādātajās HK-2 un NRK49F šūnās 6-BIO inhibējaniereFibrozemarķieri, kā arī MAPK unSMADsignalizācijas ceļi. Turklāt 6-BIO apstrāde samazināja P-C-JUN, P-C-FOS un SP-1 proteīnu ekspresiju, ko inducēja UUO un TGFβ, kā arī AP-1 un SP-1 kodol ekspresiju un veicinātāja aktivitāti TGF-β apstrādātās HK-2 un NRK49F šūnās. AP-1 un SP-1 transkripcijas faktoru inhibīcija ar 6-BIO terapiju ir saistīta ar ECM uzkrāšanās inhibīciju, kas izraisaniereFibroze. Tas tiek panākts, apspiežot MAPK unSMADsignalizācijas ceļi, kas noved pie PAI-1 un CTGF izteiksmes samazināšanās. Mūsu rezultāti liecina, ka 6-BIO var būt potenciāls terapeitisks līdzeklis pretniereslimības, kā arī profilakseinierebojājumi, ko izraisījuši UUO un TGFβ.

Noklikšķiniet uz organiskā Cistanche nieru slimības gadījumā

Pussintētiskais šūnu caurlaidīgais indirubīna atvasinājums 6-BIO pieder bis-indolu ģimenei un dabiski sastopams ēdamos gliemežu mīkstmiešiem un augiem [12]. Indirubīns satur intramolekulāru ūdeņraža saiti starp 2-C divkāršo saiti O un N1-H grupu un citu starpmolekulāro ūdeņraža saiti starp molekulām. 6-BIO ir ķīmiski modificēta struktūra, kurā 6-pozīcija tiek aizstāta ar Br, lai pārvarētu slikto farmakokinētisko īpašību trūkumu, ko izraisa indirubīna zemā šķīdība ūdenī [44]. Daudzi indirubīni, pateicoties konkurētspējīgai saistīšanai ar ATP, darbojas kā divkārši ciklinatkarīgs kināzes (CDK) un glikogēna sintāzes kināzes-3β (GSK-3β) inhibitori, kuriem piemīt vairāk nekā 16 reizes lielāka selektivitāte salīdzinājumā ar CDK5 [12]. Turklāt 6-BIO uzrāda izteikti selektīvu GSK-3β inhibīciju ar IC50 vērtību 0,005 μM [12]. Saskaņā ar vairāku grupu ziņojumiem 6-BIO pilnībā kavē MCF-7 šūnu proliferāciju un bloķē migrāciju par aptuveni 75% 10 μM koncentrācijā un kavē PDK1 fosforilāciju. Tas parādīja, ka 6-BIO tika ievietots PDK1 saistošajā kabatā, lai izveidotu trīs ūdeņraža saites ar atlikumiem eņģu reģionā, un saistošā kabata viegli pielāgoja papildu Br atomus 6-BIO [45]. Ar šīm īpašībām 6-BIO tiek pētīts kā jaunas zāles, lai regulētu šūnu procesus, piemēram, ar novecošanu saistītu iekaisumu, oksidatīvo stresu, šūnu izdzīvošanu, proliferāciju un apoptozi vēža, diabēta un deģeneratīvu slimību gadījumā [46,47]. Tomēr pētījumi par gēnu regulāciju un molekulārajiem mehānismiem, kas saistīti arnierešūnaFibrozeir maz. Tāpēc mēs centāmies izpētīt, vai 6-BIO ir novājinātsniereFibrozeinhibējot PAI-1 un CTGF gēnu regulācijunierešūnas, tādējādi samazinot ECM uzkrāšanos.

Vairākos pētījumos ir izmantots UUO modelis, lai ziņotu par korelāciju starp ECM uzkrāšanos un hroniskuniereslimība, ko izraisa cauruļveida intersticiālaFibroze[43]. Turklāt tiek ziņots, ka pārmērīgi izteikts PAI-1 un CTGF ir saistīts ar augstu ECM uzkrāšanos hroniskas slimības progresēšanas laikāniereslimība. Tādējādi, lai efektīvi inhibētu, ir svarīgi identificēt terapeitisko molekulu, kas kavē gēnu signalizāciju un transkripciju, kas saistīta ar pastiprinātu ECM uzkrāšanos,niereFibroze. Tāpēc šajā pētījumā mēs novērtējām 6-BIO, kas ir viens no glikogēna sintāzes kināzes 3β (GSK-3β) inhibitoriem, inniereFibroze.

Mēs pētījām PAI-1 un CTGF proteīnu ietekmi uznierešūnaFibrozeun apstiprināja, ka to izteiksmi regulēja kopīgi transkripcijas faktori, AP-1 un SP-1. Transkripcijas faktors AP-1 ir heterodimērs, kas sastāv no proteīniem, kas pieder pie JUN (C-JUN, JUNB un JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1 un Fra-2), ATF (aktivācijas transkripcijas faktora) un JDP (JUN dimerizācijas proteīna) saimei [48]. Tas regulē vairākus šūnu procesus, piemēram, šūnu proliferāciju, nāvi,

diferenciācija un vaskularizācija. Agrākā pētījumā tika ziņots, ka AP-1 aktivitāte aknās un plaušās palielinās, aktivizējot VI tipa kolagēnu un fibroblastus [49,50]. Divas galvenās AP-1, C-JUN un C-FOS sastāvdaļas reaģē uz dažādiem stimuliem, piemēram, citokīniem, augšanas faktoriem un stresu [51]. Mēs novērojām paaugstinātu C-JUN un C-FOS fosforilāciju UUO žurku modelī un ar TGFβ apstrādātās HK-2 un NRK49F šūnās (2.D un 4.D att.). C-JUN un C-FOS veido heterodimērus un saistās ar AP-1 saistīšanās vietu DNS, tādējādi darbojoties kā transkripcijas faktori, lai regulētu citu gēnu ekspresiju. Turklāt ERK1/2 un JNK fosforilācija aktivizē attiecīgi C-FOS un C-JUN. Mūsu pētījumā ERK1/2 un JNK, kā arī C-JUN un C-FOS fosforilācija kodolā tika ievērojami palielināta, reaģējot uz ārstēšanu ar TGFβ. Tomēr 6-BIO ārstēšana ievērojami mainīja šo ietekmi. Mūsu pētījums parādīja, ka 6-BIO efektīvi inhibēja ERK1/2 un JNK fosforilāciju un samazināja transkripcijas faktora AP-1 aktivitāti, tādējādi inhibējot C-JUN un C-FOS fosforilāciju, kas ir tā pakārtotie efektori. SP-1 inhibīcija aknu astrocītos radaanti-fibrotisksefekts [52]. Vēl viens pētījums parādīja, ka SP-1 bija svarīga lomaFibroze[52,53]. Tāpēc mēs novērtējām, vai 6-BIO varētu inhibēt transkripcijas faktoru SP-1. Mēs novērojām, ka SP-1 proteīna ekspresija palielinājās, reaģējot uz ārstēšanu ar TGFβ, kā arī UUO modelī, bet pēc 6-BIO terapijas tā samazinājās. Turklāt TGFβ izraisīto SP-1 kodol ekspresiju nomāca 6-BIO apstrāde. Tā rezultātā PAI-1 un CTGF veicinātāju aktivitātes, kurām ir AP-1 un SP-1 saistīšanās vietas, tika samazinātas arī, apstrādājot ar 6-BIO (6. att.). Tāpēc šie atklājumi liecina, ka PAI-1 un CTGF veicinātāja aktivitātes samazināšanās ar 6-BIO terapiju pazemināja PAI-1 un CTGF proteīnu ekspresiju un samazināja ECM uzkrāšanos, tādējādi samazinotnierešūnaFibroze.

5. Secinājums

6-BIO ārstēšana samazināja PAI-1 un CTGF ekspresiju UUO modelī un ārstēto TGFβniereŠūnas. Turklāt 6-BIO inhibēja TGFβ izraisītu aktivācijuSMADun MAPK signalizācija, vienlaikus kavējot ARĪ AP-1 un SP-1 aktivitāti, divus no vairākiem transkripcijas faktoriem, kas saistās ar PAI-1 un CTGF gēnu veicinātājiem. AP-1 un SP-1 inhibīcija, šķiet, ir viens no galvenajiem mehānismiem, ar kuriem 6-BIO inhibēniereFibroze. Tādējādi mūsu rezultāti liecina, ka 6-BIO var būt potenciāls terapeitisks līdzeklis pretniereSlimībām.

CRediT autorības ieguldījuma paziņojums

Jung Sun Park: konceptualizācija, metodoloģija, datu pārraudzīšana, rakstīšana - oriģināla melnraksta sagatavošana, rakstīšana - pārskatīšana un rediģēšana, vizualizācija, finansējuma iegūšana. In Ae Jung: Datu pārraudzīšana, rakstīšana - pārskatīšana un rediģēšana. Hong Sang Choi: Datu pārraudzīšana, rakstīšana - pārskatīšana un rediģēšana. Dong-Hyun Kim: metodoloģija, datu pārraudzīšana. Hoon In Choi: metodoloģija, datu pārraudzīšana. Eun Hui Bae: Rakstīšana - pārskatīšana un rediģēšana, uzraudzība. Seong Kwon Ma: rakstīšana - pārskatīšana un rediģēšana,

6. Atsauces

Avots ir no Jung Sun Park et, al on Biomedicine & Pharmacotherapy 145 (2022) 112402