2. DAĻA Feniletanoīda glikozīdu izolēšana un identificēšana no Aloysia Polystachya un tās kā monoamīnoksidāzes-A inhibitoru darbība

Kāds ir iemesls, kāpēc Cistanche Actosides var kavēt enzīmu aktivitāti?

Cistanche antioksidanta iedarbības princips

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, sazinieties ar:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ir daudz efektu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Sastāvdaļu atdalīšana un identifikācija ar ultraefektīvās šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometriju

Hromatogrāfiskās analīzes tika veiktas, izmantojot Waters Acquity UPLC H klases sistēmu, kas aprīkota ar diožu matricas detektoru (DAD) un Waters Xevo TQ-S tandēma kvadrupola masas spektrometru ar Z-smidzināšanas avotu, kas darbojas negatīvo jonu režīmā. Izejas šķīdumi, kas satur 1.0mg/mL ekstrakta vai standartusakteozīds, izoakteozīds, 6'-acetilakteozīdsun 4',4''',5,5''-tetrahidroksi-6,6'',3'''-trimetoksi-[C7-O-C7'']-biflavons LC kategorijas metanolā tika sagatavoti atsevišķi, katru apstrādājot ar ultraskaņu 30minūtes, ja nepieciešams, un filtrēti caur 0.45 μm Millipore filtriem (Merck Millipore). Šķīdumi tika atšķaidīti līdz 10µg/ml ar metanolu, un alikvotas daļas (5 μL) tika ievadītas Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 kolonnā (1{{30}}0 × 4,6 mm id; 2,7 µm daļiņu izmērs). Kustīgā fāze sastāvēja no ūdens, kas satur 0,1 procentu skudrskābes (šķīdinātājs A) un metanolu, kas satur 0,1 procentu skudrskābes (šķīdinātājs B), kas tika piegādāts ar plūsmas ātrumu 0,5 ml/min saskaņā ar eluēšanas profilu: izokrātiska ar 3 procentiem B no 0 līdz 4 min, kam sekoja lineāri gradienti no 3 līdz 60 procentiem B no 4 līdz 19 minūtēm un no 60 līdz 90 procentiem B no 19 līdz 23 minūtēm, un visbeidzot atgriezās pie 3 procentiem B no 23 līdz 28 minūtēm. Notekūdeņus uzraudzīja DAD diapazonā no 210 līdz 720 nm un MS ar optimizētiem avota un darbības parametriem: kapilārais spriegums 2,50 kV, Z-smidzināšanas avota temperatūra 150 grādi, desolvatācijas temperatūra (N2) 350 grādi, desolvatācijas gāzes plūsma 600 l/h un masas diapazons no 150 līdz 600 pilnas skenēšanas režīmā.

Identificēto sastāvdaļu attīrīšana

Neapstrādāts hidroetanola ekstrakts (10 g) tika izšķīdināts ūdenī: etanols (50:50; v/v) un secīgi sadalīts pret heksānu, etilacetātu un n-butanolu. Butanola frakcija tika koncentrēta ar rotācijas iztvaicētāju un 3 g frakcionētā ekstrakta paraugs tika uzklāts uz stikla kolonnas (10 × 3 cm od), kas bija piepildīta ar C-18 RP silikagelu (230-400 acs; Sigma). -Aldrich) un eluē ar ūdeni, kam seko secīgi ūdens un metanola maisījumi (90:10, 50:50 un 10:90; v/v). Subfrakcija, kas iegūta, eluējot ar ūdeni: metanolu (90:10; v/v) tika tālāk attīrīta ar RP-HPLC, izmantojot Shimadzu LC-20AP sistēmu, kas savienota ar SPD-20A UV/Vis detektoru. un aprīkots ar Phenomenex Luna® C-18 kolonnu (250 × 10 mm id; 5 μm daļiņu izmērs). Kustīgā fāze bija ūdens: metanols, sākot ar 90:10 (v/v) un mainoties uz 30:70 (v/v) 100 minūtēs, lai iegūtu četrus zināmos savienojumus.akteozīds(750 mg), izolēta puse (430 mg), 6'-acetilakteozīds(42 mg) un 4',4''',5,5''-tetrahidroksi-6,6'',3'''-trimetoksi-[C7-O-C7'']-biflavonu ( 13 mg). Kustīgās fāzes plūsmas ātrums bija 1 ml/min, injekcijas tilpums bija 500 μL, hromatogramma tika reģistrēta pie 340 nm, un UV spektri tika iegūti diapazonā no 240 līdz 400 nm. Attīrīto sastāvdaļu identitātes tika apstiprinātas, izmantojot to 1H- (500 MHz) un 13C-NMR (125 MHz) spektrus, kas reģistrēti ar Bruker modeļa DPX 500 spektrometru, un datu salīdzināšanu ar literatūrā pieejamajiem [18, 19, 41]. Izolēto savienojumu tīrība tika apstiprināta ar UPLC-DAD-MS (▶att. 1b–d) un KMR (▶att. S1–S12, papildinformācija).

Kvantifikācijaakteozīdsar HPLC-diožu matricas detektoru

Žāvēta hidroetanola ekstrakta paraugs (1 mg) tika atkārtoti izšķīdināts 1 ml maisījuma (80:20; v/v) metanola (JT Baker HPLC pakāpe) un Milli-Q. Īpaši tīrs ūdens (Merck Millipore), apstrādāts ar ultraskaņu 30 minūtes un filtrēts caur 0.45-μm Millipore filtru. Šī šķīduma alikvotas (20 µL) tika analizētas ar Shimadzu LC-10APvp sistēmu, kas savienota ar SPD-M10Avp DAD un aprīkota ar Phenomenex Luna C18 kolonnu (250 × 4,6 mm id, 5 µm), kas aizsargāta ar Phenomen. C18 priekškolonna (4,0 × 3,0 mm id, 5 µm). Atdalīšana tika veikta istabas temperatūrā (22 ± 1 grāds), izmantojot kustīgo fāzi, kas satur 0,1% etiķskābi ūdenī (šķīdinātājs A) un metanolu (šķīdinātājs B;

JT Baker HPLC pakāpe) tiek piegādāts ar nemainīgu plūsmas ātrumu 1.0 ml/min saskaņā ar programmu: lineārais gradients no 10 līdz 70 procentiem B no 0 līdz 32 minūtēm, no 70 līdz 10 procenti B no 32 līdz 35 minūtēm un galīgā izokrātiskā eluēšana ar 10 procentiem B no 35 līdz 40 minūtēm. Noteikšanas viļņa garums tika iestatīts uz 330 nm.

Satursakteozīdsekstraktā tika novērtēts, izmantojotakteozīds(Sigma-Aldrich; CAS nr. 61276-17-3) kā ārējo standartu. Tika sagatavoti šķīdumi, kas satur 500, 250, 125, 62,5, 31,2 un 15,6 ug/mL atsauces standarta, un tika izveidotas kalibrēšanas līknes, katru šķīdumu pakļaujot HPLC analīzei trīs eksemplāros [42]. Standarta pīķa laukuma attiecībaakteozīdslīdz atbilstošajai analizējamās vielas koncentrācijai tika noteikta, izmantojot standarta līkņu lineāro regresiju (▶att. S13, papildinformācija). Analītiskie dati tika apstiprināti attiecībā uz linearitāti, precizitāti un precizitāti saskaņā ar vadlīnijām, ko izdevusi Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Noteikšanas robežas (LoD) un kvantitatīvas noteikšanas (LoQ) noakteozīdsbija attiecīgi {{0}},30 un 0,92 µg/ml.

Monoamīnoksidāzes-A inhibīcijas testi

Rekombinantais cilvēka MAO-A, tiramīns, klorgilīns, vanilskābe, 4-aminoantipirīns un mārrutku peroksidāze tika iegādāti no Sigma-Aldrich. MAO-A inhibīcijas testi tika veikti, izmantojot 96-iedobju plates, izmantojot modificētu López et al. aprakstītās metodes versiju. [43]. Katrā iedobē tika ievietoti 50 μL hromogēna šķīduma (0,8 mM vanilskābes, 2,5 mM 4-aminoantipirīna un 4 U/mL mārrutku peroksidāzes fosfāta buferšķīdumā pie pH 7,6), 100 μL 3. mM tiramīna un 50-μL neapstrādāta hidroetanola ekstrakta vai viena no attīrītiem feniletanola alikvotiem, kas izšķīdināti metanolā. Visbeidzot, katrai iedobei pievienoja 50 μL alikvotas 8 U / ml MAO-A un plāksni inkubēja 37 grādos 30 minūtes, un šajā laikā absorbcijas tika reģistrētas ik pēc 5 minūtēm, izmantojot mikroplašu lasītāju. Klorgilīns (lielāks vai vienāds ar 97 procentiem GC; Sigma-Aldrich) un metanols tika iekļauti attiecīgi kā pozitīvas un negatīvas kontroles katrā testa plāksnē.

Statistiskā analīze

Tika veikti trīs neatkarīgi MAO-A inhibējošo aktivitāšu novērtējumi un iegūtie dati tika analizēti, izmantojot Graph-Pad Prism programmatūru. IC₅₀hidroetanola ekstrakta, attīrīto feniletanoīdu un pozitīvās kontroles vērtības tika aprēķinātas ar nelineāru regresiju, imitējot logaritmisko (inhibitora koncentrācijas) grafikus pret normalizētu procentuālo inhibīciju.

Atbalsta informācija

H- un13C-KMR spektriakteozīds, izoakteozīds, 6'-acetilakteozīds un 4,4,5,5-tetrahidroksi-6,6,3-trimetoksi-[C7–O–C7'']-biflavons un HSQC/HMBC korelācijas analīzes trīs feniletanoīdi ir pieejami kā papildinformācija.

Atsauces

[1] Pasaules Veselības organizācija. Depresija un citi bieži sastopami garīgie traucējumi

Traucējumi: globālās veselības aplēses. Ženēva: PVO; 2017. gads

[2] Fergusons JM. SSAI antidepresanti: blakusparādības un panesamība. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Papildu un alternatīvā medicīna trauksmes un depresijas ārstēšanā. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37–42

[4] Sarriss J, Makintairs E, Camfield DA. Augu izcelsmes zāles trauksmes traucējumiem, 1. daļa: Preklīnisko pētījumu pārskats. CNS zāles 2013; 27: 207–219

[5] Sarris J, Makintairs E, Camfield DA. Augu izcelsmes zāles trauksmes traucējumiem, 2. daļa: Klīnisko pētījumu pārskats ar apstiprinošiem preklīniskiem pierādījumiem. CNS zāles 2013; 27: 301–319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (Argentīnas Republika). Galvenā daļa: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49–66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloīzija polistahija (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), cultivado en Paraguay. Rojasiana 2014; 13: 31–41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Hidroalkoholiskā ekstrakta anksiolītiskā un antidepresantiem līdzīga iedarbība noAloysia polystachyažurkām. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373–378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. The anksiolītiskā iedarbībaAloīzijapolistahija(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) pelēm. J Etnopharmacol- 2006; 105: 400–408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. The antidepresant-like effects ofAloīzijapolistahija(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) pelēm. Fitomedicīna 2008; 15: 478–483

[11] Herraizs T., Gonsaless D., Ancín-Azpilicueta C, Arāns VJ, Gillēns H.

-Karbolīna alkaloīdi Peganum harmala un cilvēka monoamīnoksidāzes (MAO) inhibīcija. Food Chem Toxicol 2010; 48: 839–845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Kvinazolīna alkaloīdu identifikācija, sastopamība un aktivitāte Peganum harmala. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261–269

[13] Herraiz T, Guillén H. Monoamīnoksidāzes-A inhibīcija un ar to saistītā antioksidanta aktivitāte augu ekstraktos ar potenciālu antidepresantu iedarbību. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektīvie MAO-B inhibitori: mācība no dabīgiem produktiem. Mol Divers 2014; 18: 219–243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Trauksmes un depresijas ārstēšana: ārstniecības augi retrospektīvā. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198–215

[16] Fišar Z. Narkotikas ir saistītas ar monoamīnoksidāzes aktivitāti. Prog Neuropsy- chopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112–124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. A tipa monoamīnoksidāze un serotonīns ir koordinēti iesaistīti depresīvos traucējumos: no neirotransmiteru nelīdzsvarotības līdz traucētai neiroģenēzei. J Neironu transmisija 2017; 125: 53–66