4. daļa: Epigenomiskās un transkriptomiskās mijiedarbības kartēšana atmiņas veidošanās un atsaukšanas laikā hipokampu engrammu ansamblī

ali.ma@wecistanche.com

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 3. daļu

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 5. daļu

RNS-sekv

ul ūdens bez nukleāzes), 30 minūtes 37 ° C temperatūrā, viegli šūpojot. Papildinātie DNS fragmenti tika pastiprināti un svītrkodēti, izmantojot PCR reakciju (1 cikls; 5 min – 72c, 30sek – 98c, 10 cikli; 15sek – 98c, 30sek – 60c, 3min – 72c). Ievērojot ražotāja protokolu, pastiprinātā DNS tika iztīrīta un attīrīta, izmantojot 1,8x AMPure lodītes (AmpureXP lodītes, Beckman Coulter, A63880). Pēc bioanalizatora QC bibliotēkas izmēram un izplatīšanai bibliotēkas tika sekvencētas Illumina Nextseq 550 platformā MIT BioMicro centrā.

Cistanche un Cistanches atmiņas uzlabošanai

ATAC-seq analīze — 40-bp sapārotā gala secības nolasījumu fastq neapstrādātie dati tika saskaņoti ar peles mm9 atsauces genomu, izmantojot Bowtie 2.0 pāra gala režīmā50. Samtools kolekcija51 tika izmantota, lai kārtotu, noņemtu PCR dublikātus (rmdup), indeksētu BAM failus (indeksu) un aprēķinātu bibliotēkas statistiku (flagstat, skatiet 13. papildtabulu). BAM faili tika samazināti no pareizi līdzinātiem, pārī savienotiem un unikāliem nolasījumiem līdz 50 M. Atvērtās hromatīna virsotnes tika analizētas, izmantojot programmatūru MACS252. Diffbind v1.16.353 identificēja atšķirīgi pieejamos reģionus (DAR) ar noklusējuma parametriem un iestatījumiem, lai izmantotu DESeq2 (nogrieznis; FDR < 0,01;="" locījuma="" izmaiņas=""> 1,5). Pilna normalizēto skaitļu matrica (RPKM54) tika izgūta ar pakotni DiffBind. Lielo celiņu paaudzei biogrāfijas formātā tika izveidoti pāļu signālu faili (fragmentu kopums uz miljonu nolasījumu), izmantojot MACS2 zvana maksimuma funkciju ar -B –SPMR karodziņiem. Pēc tam tika ģenerēta normalizēta locījuma bagātināšana (FE) pār ievades lambda celiņiem, izmantojot MACS2 funkciju bdgcmp ar iestatījumu - m FE. Pēc tam bedGraph faili tika pārveidoti bigwig formātā.

Bigwig failu vizualizācijai tika izmantoti IGV55 rīki. ChromHMM56 tika izmantots, lai izveidotu hromatīna stāvokļa modeli no diviem neatkarīgiem pētījumiem, kuros tika izmantoti lielie hipokampa audi pirms un pēc pēdas trieciena 21, 22, un lai noteiktu, vai DAR bagātināšana ir atkarīga no stāvokļa modeļa. Motīvu bagātināšanas analīze57,58 un pīķu anotācija tika veikta ar HOMER59 rīkiem. Visi kodi ir pieejami papildu programmatūras faila RNS ekstrakcijā un bibliotēkas sagatavošanā. Tūlīt pēc fiksācijas un šķirošanas (skatīt audu sagatavošanu), gremošanas buferim tika pievienoti 4 ul proteāzes (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Life Technologies, AM1975) . Paraugus inkubēja siltuma blokos 15 minūtes 50 grādos, pēc tam 15 minūtes 80 grādos. Pēc tam katram paraugam pievienoja 0,75 ml Trizol LS (TRIzol™ LS reaģents, Thermo Fisher Scientific, 10296028) un 0,2 ml fenola: hloroforma šķīduma (fenols: hloroforms: izoamilspirts, 1 fāze, VWR International, K169), kam sekoja enerģiski kratot 5 minūtes istabas temperatūrā (RT). Suspensija tika ievietota Phase lock gēla smagajās caurulēs (PLG, 5 Prime, 2302830) un 5 minūtes centrifugēja ar ātrumu 13, 000apgr./min. Ūdens fāze ar nukleīnskābēm tika ekstrahēta no mēģenēm uz svaigu Eppendorf mēģeni ar vienādu daudzumu 100% etanola. RNS attīrīšana tika veikta ar Direct-zol™ RNA MicroPrep komplektu (Zymo Research, R2060) RNS attīrīšanai saskaņā ar ražotāja norādījumiem. RNS tika eluēta (10 ul, DEPC) un pēc tam uzglabāta -80 grādu temperatūrā. Bibliotēkas sagatavošanai un pastiprināšanai tika izmantots SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006). Bibliotēkas sagatavošanai tika izmantoti 3 bioloģiskie replikāti (N=3). Bibliotēkas tika sagatavotas saskaņā ar ražotāja norādījumiem bez papildu sadrumstalotības posma (FFPE, opcija 2, skatīt rokasgrāmatu), ar ribosomu cDNS izsīkšanu un galīgo PCR pastiprināšanu (15 cikli). Bibliotēkas tika sekvencētas Illumina HiSeq 2000 platformā MIT BioMicro centrā.

RNS-seq analīze — neapstrādātie fastq dati tika saskaņoti ar peles mm9 atsauci

genomu, izmantojot Bowtie 2.0. Kartētie nolasījumi no gēnu ķermeņiem (ieskaitot eksonu un intronu nolasījumus) tika apstrādāti ar Cufflinks 2.260 un DEseq261 ar UCSC mm9 atsauces gēna anotāciju, lai novērtētu transkriptu daudzumu. Diferenciālā gēnu ekspresija un pakārtotās analīzes tika veiktas, izmantojot DEseq2 un pielāgotos R skriptus. Relatīvais transkriptu daudzums tika mērīts ar fragmentiem uz eksona kilobāzi uz miljonu kartēto fragmentu (FPKM).

Lai analizētu transkripcijas programmas, katra gēna ekspresija tika novērtēta atšķirīgiatmiņafāzes (aktivizēts - agri, aktivizēts - vēlu, atkārtoti aktivizēts) pēc to log2 reizes maiņas (log2FC) no bazālā stāvokļa. 1095 diferencēti izteikti gēni (DEG) izturēja robežkritērijus, kuros mēs novērojām vismaz vienā P vērtības salīdzinājumā.< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

Cistanche var uzlabot atmiņu

Hromosomu konformācijas uztveršana (Hi-C)

Fiksēto šūnu kodoli (skatīt audu sagatavošanu) tika sašķiroti 1,5 ml Eppendorf mēģenēs, kas satur 500 ul svaiga ledusauksta līzes buferšķīduma (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 procenti Igepal CA{{ 9}}, Pi un PCR kvalitātes ūdens) un sasaldēti uz sausa ledus un uzglabāti -80 ° C temperatūrā, līdz tie tika izmantoti. Hi-C bibliotēkas tika sagatavotas no 100,{13}} šūnām/grupā (ievākti no diviem dzīvniekiem) divos bioloģiskos atkārtojumos, izmantojot Dovetail™ Hi-C komplekta rokasgrāmatu (v.1.03, Dovetail Genomics, Čikāga, ASV). Sešas Hi-C bibliotēkas tika sekvencētas (pārī savienotas) Illumina Nextseq 500 platformā. HOMER Hi-C cauruļvads tika izmantots, lai filtrētu eksperimentālus artefaktus, piemēram, cirkularizāciju, pašliegumus un PCR dublikātus. Filtrētie nolasījumi tika saskaņoti ar atsauces peles genomu (mm9) un tālāk apstrādāti, izmantojot HOMER HI-C cauruļvadu.

HOMER Hi-C rīki tika izmantoti, lai veiktu galveno komponentu analīzi (PCA) Hi-C datiem, lai identificētu apakškodolu nodalījumus (A un B) ar 50 Kb izšķirtspēju (skatīt papildu programmatūru). Nodalījuma slēdžu analīzei mēs vispirms atņēmām PC1 vērtības starp grupām. Tālāk mēs identificējām galvenās BtoA pārejas kā reģionus ar PC1 izmaiņām virs 90. procentiles un augstākās AtoB pārejas kā reģionus ar PC1 izmaiņām zem 10. procentiles. Tā kā apakškodolu nodalījumi tiek regulēti kā vairāku simtu kilobāzu vienības, mēs apvienojām secīgus 50 Kb AtoB vai BtoA segmentus, kas atradās 100 Kb attālumā viens no otra. Mēs atmetām konsolidētos domēnus, kuru kopējais izmērs bija mazāks par 200 KB. Nodalījuma slēdzis tika ņemts vērā tikai tad, ja negatīvā vērtība tika pārveidota par pozitīvu vērtību (un otrādi). Visbeidzot, tika salīdzinātas pirmā komponenta pozitīvās un negatīvās vērtības starp visām trim neironu populācijām (bazālais, aktivizētais - agri un aktivizētais - vēlu).

Reklāmdevēja uztveršana Hi-C

Pēc fiksācijas un šķirošanas (skatīt audu sagatavošanu) šūnas tika sašķirotas 1,5 ml Eppendorf mēģenēs, kas satur 500 ul svaiga ledusauksta līzes buferšķīduma (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 procenti Igepal CA{ {9}}, Pi un PCR kvalitātes ūdens), sasaldēti uz sausa ledus un uzglabāti -80 ° C temperatūrā, līdz tie tika izmantoti. Hi-C bibliotēkas tika sagatavotas no 10,000 šūnām/grupā (N=3–4), kā aprakstīts iepriekš62, ar dažām izmaiņām. Paraugi tika izgriezti (4 grādi, 1600 g 20 minūtes) un granulas tika atkārtoti suspendētas 400 ul 1,2x Cutsmart buferšķīdumā (New England Biolabs,

ASV). Pirmā restrikcijas šķelšana tika veikta, kā aprakstīts sākotnējā protokolā, izmantojot 1500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, ASV) kā 6-bāzes griezēju (sākotnējā protokola BglII vietā). Pēc biotīna marķēšanas un ligēšanas uz nakti (sīkāku informāciju skatiet sākotnējā protokolā), paraugi tika izgriezti (4 grādi, 1600 × g 15 minūtes) un granula tika atkārtoti suspendēta 25 ul PBS. Suspensiju inkubēja 65 ° C temperatūrā ar 3 ul proteināzes K 12–16 stundas. Hi-C DNS attīrīšana tika veikta, kā aprakstīts sākotnējā protokolā, izmantojot 100 ul streptavidīna lodītes (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Otrajam restrikcijas enzīmam mēs izmantojām 4-bāzes griezēju Hpych4V (10 U/par paraugu, R0620S, New England Biolabs, ASV). Pēc A-astes reakcijas (sīkāku informāciju skatiet sākotnējā protokolā), paraugi tika pastiprināti, izmantojot PCR (17 cikli), un attīrīti ar AMPure XP lodītēm. Hi-C bibliotēkas tika eluētas 20 ul 10 mM Tris-HCl (pH 8,5). Ēsmas uztveršanas sistēmas dizains Promoter Capture Hi-C — 5000 peles gēnu promotoru saraksts tika iegūts no iepriekš publicētā protokola Šēnfelderā. Et al.29. Sarakstā ir tikai transkripti ar proteīnu kodēšanas reģionu biotipu un HindIII restrikcijas fragmentu vietām. Tika izstrādātas divas 120 bp uztveršanas zondes, pa vienai katrā fragmenta galā. Zondes sintezēja Agilent Technologies saskaņā ar SureSelect mērķa bagātināšanas sistēmu (Agilent Technologies).

Promotera uztveršanas Hi-C bibliotēkas sagatavošana un sekvencēšana – lai uztvertu Hi-C ligācijas produktus, kas satur promotora sekvences, mēs izmantojām iepriekš publicēto protokolu29. Īsumā, Hi-C DNS bibliotēkām tika pievienoti hibridizācijas blokatori (Agilent Technologies). Hibridizācijas buferis un uztveršanas ēsmas RNS tika sagatavoti saskaņā ar ražotāja norādījumiem (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Pēc tam Hi-C bibliotēkas DNS/hibridizācijas blokatori tika karsēti 5 minūtes 95 grādu temperatūrā, pirms temperatūra tika pazemināta līdz 65 grādiem. Hi-C bibliotēkas DNS tika sajaukta ar hibridizācijas buferšķīdumu (iepriekš uzsildīts 5 min līdz 65 grādiem) un pēc tam ar īpaši izstrādātu uztveršanas ēsmas sistēmu (iepriekš uzsildīta 3 min līdz 65 grādos), kas sastāv no 10,000 biotinilētas. RNS, kas vērstas uz 5000 peles gēnu promotoru HindIII restrikcijas fragmentu galiem (Agilent Technologies, skatiet papildu materiālu par uztveršanas ēsmas dizainu). Pēc 24 stundām 65 grādu temperatūrā PCR iekārtā tika veikta biotīna noņemšana (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) un mazgāšana, ievērojot SureSelect Target bagātināšanas protokolu (Agilent Technologies). Pēc pēdējās mazgāšanas lodītes tika atkārtoti suspendētas 30 μL NEBuffer 2 bez iepriekšējas DNS eluēšanas, un pēc uztveršanas PCR (četri amplifikācijas cikli, izmantojot iluminācijas universālos primerus) tika veikta DNS, kas bija saistīta ar lodītēm, izmantojot biotinilētu RNS. Capture Hi-C bibliotēkas tika sekvencētas pārī (Nextseq 500, Illumina).

Veicinātāja uztveršanas Hi-C analīze — HiCUP cauruļvads63 tika izmantots, lai apstrādātu neapstrādātus fastq secības nolasījumus. Šis cauruļvads tika izmantots, lai kartētu nolasīšanas pārus pret peles (mm9) genomu, lai filtrētu eksperimentālos artefaktus (piemēram, cirkulāros nolasījumus un atkārtotas ligācijas) un noņemtu dublikātus. PC-HiC datiem iegūtie BAM faili tika samazināti un apstrādāti, izmantojot CHiCAGO versiju 1.2.064, ievērojot noklusējuma iestatījumus, lai izsauktu nozīmīgas mijiedarbības. Pilna informācija par šo cauruļvadu ir pieejama Babraham Bioinformatics

Cistanche var uzlabot atmiņu

Stereotaksiska ar adenomu saistīta vīrusa injekcija

ArcCreERT2 peles tika anestēzētas ar avertīnu un AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (5. serotips, iegūts no UNC vīrusa kodola) vīrusa infūzijas. Vispirms tika izveidots neliels caurums galvaskausā virs muguras hipokampa (attiecībā pret Bregmu: priekšējā-aizmugurējā −2.0 un viduslaterālā ± 1,5), tika nolaista Hamiltona šļirce ar 33-mēra adatu. līdz –1,8 DV un 500 ηl vīrusa tika ievadīts ar plūsmas ātrumu 50 ηl minūtē abos hipokampos. Adata tika izņemta pēc 10 minūšu pēcinjekcijas perioda, un pelēm ļāva atgūties 4 dienas.