Ⅱ daļa: Dereplikācijas vadīta jaunu ar fenilpropanoīdu aizvietotu diglikozīdu izolēšana no Cistanche Salsa un to inhibējošā darbība pret ražošanu makrofāgos
Mar 04, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
3-metilbutenilgrupu, aglikona apakšstruktūru, ierosināja H-2 COZY korelācijas ar H-1a un H-1b un HMBC korelācijas starp H{{ 4}} un H-5, un olefīna oglekli pie kC 120,7 (C-2) un 136,4 (C-3). Divas cukura daļas tika noteiktas ar NMR spektra analīzi un skābes hidrolizāta HPLC spektra analīzi ar MS fragmentu modeli. To absolūtā konfigurācija tika noteikta kā D-glikoze un L-ramnoze, izmantojot skābes hidrolizāta HPLC analīzi [17]. Šīs cukura daļas tika definētas kā -glikoze un a-ramnoze, savienojot anomēru protonu konstantes. 1H-1H COZY spektrs uzrādīja secīgas korelācijas no H-13 līdz H-63 un no H-133 līdz H-633 (4. attēls).
Glikozes protonu nobīde uz leju pie kH 4,70 (H-43) liecināja par glikozes acil-aizvietotāju. No HMBC spektra korelācija starp H-43 un C-9333 apstiprināja kofeoila aizstājēja stāvokli. HMBC korelācijas starp H-13 un C-1 (kC 64,5) un starp H-33 (kH 3,68) un C-133 (kC 101,2) liecināja par katra aizvietotāja atrašanās vietu. . Attiecīgi 6 struktūra tika noteikta kā 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kofeoil- -D- glikozes piranozīds un nosaukts par cistansalsīdu B.
Cistansalsīds C (12), brūns amorfs pulveris, tika noteikts ar C26H38O13 molekulāro formulu ar (plus )-HR-ESI-QTOF-MS, kas uzrādīja maksimumu pie m/z 581,2213 [M plus Na] plus (aprēķināts C26H38O13Na, 581,2205). Raksturīgs jons pie m/z 163 liecināja, ka struktūrā pastāv kofeoila aizvietotājs. Fragmentu joni pie m/z 325 un m/z 471 liecināja par ramnozes vienības un glikozes vienības esamību.
12 KMR spektru salīdzinājums ar 6 rādīja, ka tie bija līdzīgi, izņemot aglikona struktūru. 12 KMR spektros tika novēroti divi parafīna oglekli pie kC 38.0 (C-2) un 24,4 (C-3), nevis divi olefīna oglekli pie kC 12{{16. }},7 (C-2) un 136,4 (C-3) aglikonā no 6. Dīgļu metilgrupas (kH 0.88) aglikonā no 12 tika pārvietotas uz augšu. attiecībā pret H-4 un H-5 (kH 1,71 un 1,63) 6. aglikonā (2. tabula). Tika ierosināts, ka 12. aglikons ir 3-metilbutilgrupa, ko apstiprināja 1H un COZY NMR spektri. 3-metilbutilgrupas maksimumi tika novēroti pie 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m). , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) un 0,88 (H-4, 5).
Divas cukura daļas tika atkārtoti apstiprinātas ar skābes hidrolizāta HPLC analīzi un NMR spektra analīzi, kā arī MS fragmentu modeli. Cukuru absolūtās konfigurācijas tika identificētas kā D-glikoze un L-ramnoze, izmantojot skābes hidrolizāta HPLC analīzi [17]. A-glikozes daļa un a-ramnozes daļa tika apstiprināta, savienojot anomēru protonu konstantes. 1H-1H COZY spektrs uzrādīja secīgas korelācijas no H-13 līdz H-53, no H-133 līdz H-333 un no H{{11} } uz H-433 (4. attēls).
Aizvietotāju atrašanās vieta tika apstiprināta ar HMBC analīzi. HMBC spektrā korelācijas starp H-13 un C-1 (kC 67,2), starp H-33 (kH 3,68) un C-133 (kC 101,2) un starp Tika noteiktas H-43 (kH 4,70) un C-9333 (kC 165,7). Līdz ar to 12. struktūra tika noteikta kā 3-metilbutil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D-glikozes piranozīds un nosaukts cistansalside C.
Cistansalsīda D (17), amorfa brūna pulvera, molekulārā formula tika noteikta ar C31H38O14, izmantojot pozitīvā režīma augstas izšķirtspējas ESI-QTOF-MS, kas uzrādīja adukta jonu maksimumu pie m/z 657,2147 [M plus Na] plus. (aprēķināts C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentu joni, tostarp [M plus H x Aglikons x Rha x Acetil Glc] plus jons pie m/z 147, [M plus H x Aglikons x Rha] plus jons pie m/z 351 un [M plus H x Aglikons] tika konstatēti arī plus joni pie m/z 497. Raksturīgs jons pie m/z 147 liecināja, ka tā struktūrā ir kumaroila aizvietotājs. Fragmentu joni pie m/z 351 un m/z 497 liecināja par ramnozes vienības un acetil-aizvietotas glikozes vienības esamību.
Cistansalside nocistanche augs
13C-NMR spektrs atklāja 31 oglekļa atoma klātbūtni. 1H un HSQC spektros tika novēroti divi anomēri protoni pie kH 4,61 (1H, m, H-13) un 4,60 (1H, s, H{{10}}). . 1H-NMR spektrs liecināja par metilgrupas klātbūtni pie 1,97 (3H, s, acetil-CH3), trans-olefīnu pie kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{). 25}}) un 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) un divi para-aizvietoti benzola gredzeni pie kH 7,53 (2H, d, J=6). 9 Hz, H-3333, 5333) un 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5) 0}},0 Hz, H-2, 6) un 6,65 (2H, d, J=8},0 Hz, H-3, 5) (2. tabula) . No HMBC KMR spektra korelācijas starp karbonilgrupu pie kc 165,5 (C-9333) un H-8333 un starp H-2333, 6333 un C-7333 (kc) 145.4) ierosināja (E)-kumaroilgrupu. HMBC korelācija starp metilprotona maksimumu un karboniloglekli pie kc 169,0 apstiprināja acetilgrupas klātbūtni.
4-hidroksifenilgrupa tika ierosināta, pamatojoties uz HMBC korelācijām starp H-3, 5 un kvaternārajiem aromātiskajiem oglekļiem pie kC 155,6 (C-4) un 128,6 (C-1) . Hidroksilēta etilgrupa tika apstiprināta ar COZY NMR signāliem pie kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a). ) un 3,54 (1H, m, H-8b). HMBC korelācijas starp H-7 un C-1 (kC 128,6) un C-2, 6 (kC 129,7) liecināja par 4-hidroksifeniletilgrupu kā aglikona apakšstruktūru.
Ar skābes hidrolizāta un KMR spektru HPLC analīzi atkārtoti apstiprināja divas cukura daļas, kas ierosinātas no MS fragmenta modeļa. D-glikoze un L-ramnoze tika noskaidrota, izmantojot skābes hidrolizāta HPLC analīzi [17]. A-glikozes daļa un a-ramnozes daļa tika izveidota, savienojot anomēru protonu konstantes. 1H-1H COZY spektrs uzrādīja secīgas korelācijas no H-13 līdz H-53 un no H-133 līdz H-633 (4. attēls).
No 1H-KMR spektra H-23 (kH 4,69) un H-43 (kH 4,80) nobīde uz leju liecināja par glikozes acilu aizvietoto pozīciju. Savienojumu starp glikozi un divām acilgrupām apstiprināja HMBC korelācijas starp H-43 (kH 4,80) un C-9333 un starp H-23 un acetilgrupas karbonilgrupu (kC 169,0). ). Aglikona un ramnozes pozīcijas tika noteiktas, izmantojot HMBC korelācijas starp H-33 (kH 3,95) un C-1333 un starp H-8 un C-13. Attiecīgi 17. struktūra tika piešķirta kā 4-hidroksifeniletil-2-O-acetil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)- kumaroil- -D-glikopiranozīds un nosaukts cistansalsīds D.
Cistansalsīds E (18) tika izolēts kā amorfs brūns pulveris. Tā molekulārā formula tika noteikta kā C31H38O14 pēc 13C-KMR datiem un pozitīvā režīma augstas izšķirtspējas ESI-QTOF-MS maksimums pie m/z 657,2166 [M plus Na] plus (aprēķināts C31H38O14Na, 657,2154). Turklāt tika konstatēti arī fragmentu joni, tostarp kafeoiljons pie m/z 163, [M plus H x Aglikons x Rha] plus jons pie m/z 367 un [M plus H x Aglikons] jons pie m/z 513. Fragmentu joni liecināja par ramnozes vienības un acetil-aizvietotas glikozes vienības esamību.
1H-NMR spektrs liecināja par divu anomēru protonu klātbūtni pie kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) un 4,60 (1H, s, H-133). ) un divi ar acilu aizvietoti glikozes protoni pie kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) un 4,81 (1H, dd, J=9.7). , 9,5 Hz, H-43). 1H un HMBC spektri liecināja par acetilgrupas esamību pie kH 1,94 (3H, s, acetil-CH3), (E)-kafeoilgrupas esamību pie kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) un 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) un monoaizvietots benzola gredzens pie kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) un 7,20 (1H, m, H-4) (2. tabula). Fenilmetilgrupu, aglikona apakšstruktūru, ierosināja HMBC korelācijas starp H-7 (2H, kH 2,80, m) un C-1 (kC 138,8) un starp H-7 un C. -2, 6 (kC 128,9) un H-7 COZY KMR signāli ar H-8a (1H, kH 3,99, m) un H-8b (1H, kH 3,63, m).
Divas cukura daļas tika atkārtoti apstiprinātas ar skābes hidrolizāta HPLC analīzi un KMR spektra analīzi. Cukuru absolūtās konfigurācijas tika noskaidrotas, izmantojot skābes hidrolizāta HPLC analīzi, kas tika apstiprināts kā D-glikoze un L-ramnoze [17]. Glikozes daļa un ramnozes daļa tika izveidota, savienojot anomēru protonu konstantes. 1H-1H COZY spektrs uzrādīja secīgas korelācijas no H-13 līdz H-53, no H-133 līdz H-233 un no H{{11} } uz H-333 (4. attēls).
No HMBC spektra korelācijas starp H{{0}} un C-8 (kC 69,4), starp H-23 un acetilgrupas karboniloglekli (kC 169,1), starp H-33 (kH 3,95) un C-133 (kC 102,0) un starp H-43 (kH 4,81) un C-9333 (kC 165,6) apstiprināja aizvietotāju stāvokli struktūra. Tāpēc tika noteikts, ka 18. struktūra ir feniletil-2-O-acetil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kofeoil- -D-glikopiranozīds un nosaukts cistansalside E.
Lielākā daļa trans-cinnamoil aizvietotāju tika izomerizēti uz cis-izoformu in vitro. Ir ziņots, ka gaisma pārvērš trans-kanēļskābes atvasinājumus cis-izoformās [18, 19]. Tika novērots, ka kanēļa aizvietotāju trans-cis konversijas līdzsvars saglabā aptuveni 70 procentus izolātu trans-izoformā. Cis formas olefīna protoniem maksimums ir pie aptuveni 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) un 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) bija piešķirami 1H-KMR spektros, savukārt maksimumi pie aptuveni 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) un 6,40 ppm (d, J { Transformācijai [20] tika novēroti {28}}.8 Hz, H-8333). Trans-cis maisījumu 1H-NMR spektrā tika novēroti maksimumi diviem olefīna protoniem (H-7333 un H-8333) attiecībā 7:3 (trans:cis). Cis formas 13C-KMR pīķi bija līdzīgi transformācijas virsotnēm.
Efektīvas sastāvdaļas no cistanche: akteozīdi
Visi izolāti tika pārbaudīti, lai noteiktu to inhibējošo ietekmi uz LPS izraisītu NO ražošanu RAW
Visi izolāti tika pārbaudīti, lai noteiktu to inhibējošo ietekmi uz LPS izraisītu NO ražošanu RAW 264.7 šūnās. Deksametazons tika izmantots kā pozitīva kontrole, un tā IC50 bija 7.0 uM. No pārbaudītajiem savienojumiem savienojumi 5 (IC50 42,7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37,3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) un 18(IC50 27,9 o 0,8 uM) uzrādīja mērenu inhibējamu NO sintāzi, savukārt pārējie savienojumi šajā testā bija neaktīvi (IC50). vērtības > 100 uM). Lai pārbaudītu, vai šiem savienojumiem ir citotoksicitāte, šūnu dzīvotspēja tika mērīta, izmantojot MTT testu. Rezultātā nevienam no tiem nebija ievērojamas citotoksicitātes (papildu attēls S6-1). Šie četri savienojumi tika izvēlēti, lai novērtētu to inhibējošo aktivitāti pret NF-λB ceļu LPS stimulētajās RAW 264.7 šūnās. RAW 264.7 šūnu stimulēšana ar LPS izraisīja I入B un NF-入B (p65) fosforilēšanos pēc 0,5 h inkubācijas. NF-入 B (p65) fosforilēšanās tika ievērojami samazināta, iepriekš apstrādājot ar savienojumiem 11, 13 un 18, kā liecina Western blot analīze (5. attēls). Tāpēc savienojumiem 11, 13 un 18 var būt pretiekaisuma iedarbība, inhibējot NF-΅B makrofāgos.
5. attēls.Četru savienojumu ietekme uz I入B un NF-入B (p65) fosforilāciju LPS stimulētās RAW 264.7 šūnās. (A) Western blots tika veikts LPS un ar paraugu apstrādātās RAW 264.7 šūnās; (B, C) Imunoblota signāli tika kvantificēti, izmantojot Molecular Analyst/PC densitometrijas programmatūru (Bio-Rad, Ričmonda, Kalifornija, ASV). Tiek ziņots par fosforilēto izoformu densitometrisko analīzi. NF-入 B RAW 264.7 šūnā tika normalizēts līdz aktīna saturam.
3. Materiāli un Metodes
3.1. Vispārējs eksperiments Procedūra
Optiskās rotācijas tika mērītas ar Jasco P-2000 digitālo polarimetru (Jasco, Tokija, Japāna). UV spektri tika reģistrēti ar Chirascan plus Circular Dichroism spektrometru (Chirascan, APL, UK). IR spektri tika reģistrēti, izmantojot Jasco FT/IR-4200 spektrofotometru. Augstas izšķirtspējas elektroizsmidzināšanas jonizācijas kvadrupola lidojuma laika masas spektrometrija (HR-ESI-qTOF-MS) tika veikta ar Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, kas aprīkots ar Agilent 1260 Infinity sēriju (Agilent Technologies, Inc. Technologies. , Palo Alto, Kalifornija, ASV), un izmantotā kolonna bija Jasco SFCpak Crest C18T-5 kolonna (id 150 4,6 mm, 5 mm). Datu iegūšanai tika izmantota MassHunter Workstation programmatūra.
1D (1H un 13C) un 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) KMR spektri tika iegūti ar Jeol LA 300 (Jeol, Tokija, Japāna), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 un Bruker AVANCE 800 HD spektrometri kopā ar kriozondi (Bruker, Etlingen, Vācija). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, ASV) tika izmantots kā KMR šķīdinātājs un atsauces maksimumi (kH 2,50 un kC 39,5). Kolonnu hromatogrāfija (CC) tika veikta, izmantojot Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Upsala, Zviedrija) vai Kieselgel 60 silikagelu (40–63 um, 230–400 acs, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Vācija). Plānslāņa hromatogrāfija (TLC) tika veikta uz iepriekš pārklātām Kieselgel 60 silikagela F254 plāksnēm (Art. 5715; Merck). Plankumi uz TLC tika atklāti, izmantojot UV lampu pie 254 nm un 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Francija). Vidēja spiediena šķidruma hromatogrāfija (MPLC) tika veikta ar RediSep 120 g silīcija dioksīda zibspuldzes kolonnu (Isco, Linkolna, NE, ASV) un Kiesegel 60 silikagelu (40–63 um, 230–400 acs, Art. 9385; Merck), izmantojot Combifllash kompanjons (Isco). Augstspiediena šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) sistēma bija Gilson HPLC, kas aprīkota ar Gilson 321 sūkni un UV.VIS 151 detektoru (Gilson, Middleton, WI, USA), izmantojot daļēji sagatavojošas ODS kolonnas (Luna 5 um C18 (2)) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, ASV; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorfa, Vācija; Inno C018 kolonna Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Koreja). Analītiskā RP-HPLC sistēma bija Waters 2695 alianses sistēma ar 996 Photodiode Array (PDA) detektoru (Waters Corp, Milford, MA, ASV), un izmantotā kolonna bija Hypersil™ BDS C18 kolonna (130 Å, id 150: 4,6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). Skudrskābe tika iegādāta no Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seula, Koreja). HPLC kvalitātes šķīdinātāji tika iegādāti no Fisher Scientific Korea Ltd. (Seula, Koreja). H2SO4, Na2CO3 un pirmās šķiras šķīdinātāji ekstrakcijai, frakcionēšanai un izolēšanai tika iegādāti no Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seula, Koreja). L- un D-cisteīna metilestera hidrohlorīds un o-tolilizotiocianāts tika iegādāti no Tokijas ķīmiskās rūpniecības (Tokija, Japāna).
3.2. Augu Materiāls
Veseli augi noCistanche salsa, kas tika savākti no Shinjang Uyghur, tika importēti caur Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Koreja). Tos identificēja prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Seula, Koreja). Kupona paraugs (SNUPH2016-03) tika deponēts Seulas Nacionālās universitātes Farmācijas koledžas Ārstniecības augu dārza herbārijā.
3.3. Ekstrakcija un Izolācija
Žāvēti veseli augi noCistanche salsa(5,7 kg) tika sasmalcināti un trīs reizes ekstrahēti ar MeOH (20 L) istabas temperatūrā ar ultraskaņu 99 minūtes. Pēc šķīdinātāja noņemšanas vakuumā neapstrādātais ekstrakts (1,35 kg) tika suspendēts ūdenī (5 L), pēc tam sadalīts ar EtOAc (5 L). EtOAc atlikums (55,3 g) tika sadalīts 16 frakcijās (E01-16) silikagela hromatogrāfijā, eluējot ar CHCl3/MeOH (50:1–0:1, pakāpeniskā gradienta sistēma).
E08 (611,7 mg) tika pakļauts silikagela vidēja spiediena šķidruma hromatogrāfijai (25 g) un eluēts ar CHCl3/MeOH (18:1–0:1, pakāpeniskā gradienta sistēma) un deva 11 frakcijas (E08a-k). No E08g savienojumi 13 (0,7 mg) un 18 (0,6 mg) tika attīrīti, izmantojot Luna 5 um HPLC kolonnu un izokrātisku eluēšanu ar 28% ūdens. MeCN. E08h (138,5 mg) HPLC attīrīšana (Hypersil GOLD, 25 procenti Aq. MeCN) nodrošināja savienojumus 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) un 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) tālāk tika attīrīts silīcija-MPLC kolonnā (20 g), eluējot ar CHCl3/MeOH (10:1–0:1, solis- gradienta sistēma), lai iegūtu 11 apakšfrakcijas (E09a-k). E09e (398,7 mg) tika pakļauts Sephadex LH-20 (MeOH), un tika iegūtas astoņas apakšfrakcijas (E09e1-8). Pēc tam E09e6 tika attīrīts, izmantojot Hypersil GOLD HPLC kolonnu (22% aq. MeCN), lai iegūtu savienojumu 11 (0,4 mg). No E09e7 savienojums 5 (0,6 mg) tika attīrīts ar izokrātisku eluēšanu no Luna 5 um HPLC kolonnas ar 40% aq. MeOH.
E10 (1,20 g) tika sadalīts deviņās frakcijās (E10ai) Sephadex LH-20 kolonnā, eluējot ar MeOH. No E10g (147,5 mg) savienojumi 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) un 15 (5,0 mg) tika izolēti ar HPLC atdalīšanu (Inno, 23 procenti MeCN ūdens). Frakcija E10h (470,0 mg) tika attīrīta Hypersil GOLD kolonnā ar izokrātisku eluēšanu (40% MeOH ūdens), lai iegūtu savienojumus 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) un 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) tika pakļauts Sephadex LH-20, eluējot ar MeOH, lai iegūtu deviņas frakcijas (E11a-i). E11e tika atdalīts ar Sep-Pak C18 kārtridžu, pakāpeniski eluējot ar 10 procentiem, 20 procentiem, 30 procentiem, 50 procentiem un 100 procentiem aq. MeOH, lai iegūtu septiņas frakcijas (E11e1-7), kam seko Luna 5 µm HPLC (28 procenti aq. MeCN), lai iegūtu savienojumus 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) un 12 (1,2 mg).
E12 (19.0 g) tika pakļauts silīcija dioksīda MPLC (120 g), izmantojot CHCl3/MeOH pakāpeniskā gradienta sistēmu, lai iegūtu sešas frakcijas (18:1–0:1). , E12a-f). E12f tika hromatografēts Sephadex LH-20 kolonnā (MeOH), iegūstot septiņas frakcijas (E12f1-7). HPLC attīrīšana (Hypersil GOLD, 25% aq. MeCN) ar E12f7 iegūto savienojumu 2 (3,3 mg). Visi HPLC izmantotie šķīdinātāji bija 0,05% skudrskābes buferšķīdums. Kopējais plūsmas ātrums HPLC un MPLC hromatogrāfijai bija attiecīgi 3 un 40 ml/min.
3.4.Raksturojums
Cistansalsīds A (5): brūns amorfs pulveris; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (tīrs) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-KMR (800 MHz) un 13C-KMR (200 MHz) datus, skatīt 2. tabulu; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (aprēķināts C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalsīds B (6): brūns amorfs pulveris; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (tīrs) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-KMR (500 MHz) un 13C-KMR (125 MHz) datus, skatiet 2. tabulu; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (aprēķināts C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalsīds C (12): brūns amorfs pulveris; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (tīrs) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-KMR (800 MHz) un 13C-KMR (200 MHz) datus skatīt 2. tabulā; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (aprēķināts C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalsīds D (17): brūns amorfs pulveris; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (tīrs) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-KMR (400 MHz) un 13C-KMR (75 MHz) datus, skatīt 2. tabulu; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (aprēķināts C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalsīds E (18): brūns amorfs pulveris; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (tīrs) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-KMR (800 MHz) un 13C-KMR (200 MHz) datus, skatīt 2. tabulu; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (aprēķināts C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analīze
Hromatogrāfiskās masas spektrometrijas analīze tika veikta ar Agilent 1260 Infinity sērijas LC sistēmu (Agilent Technologies, Inc., ASV). Analītiskā kolonna bija SFCpak Crest C18T-5 kolonna (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japāna). Mobilā fāze sastāvēja no 0,1 % (v/v) skudrskābes MeCN (A) un ūdenī (B), izmantojot gradienta eluēšanu 0–35 min (23 procenti A), 35–45 min ( 23–28 procenti A), 45–75 min (28 procenti A) un 75–80 min (90 procenti A). Plūsmas ātrums tika uzturēts 0,3 ml/min. Absorbcija tika mērīta pie 320 nm. ESI avota apstākļi bija šādi: žāvēšanas gāzes (N2) plūsmas ātrums, 10 L/min; žāvēšanas gāzes temperatūra, 350 grādi ; smidzinātājs, 30 psig; apvalka gāzes plūsmas ātrums, 12,0 l/min; apvalka gāzes temperatūra, 350 grādi; kapilārs, 4000 V; skimmer, 60 V; octapole RF, 750 V; fragmentora spriegums, 180 V; pozitīvais režīms. Sistēma tika darbināta ar Masshunter darbstacijas programmatūru. Masas diapazons tika iestatīts uz m/z 50–1000.
3.6.Skābe Hidrolīze
Savienojumi tika hidrolizēti, izmantojot 1 N H2SO4 (100 uL), kas 2 stundas karsēti ar ūdens vannu 90 grādu temperatūrā, pēc tam neitralizēti ar piesātinātu Na2CO3 ūdens šķīdumu. Pēc tam, kad šķīdumi tika žāvēti N2 plūsmā, produkti un standarta cukuri (D-Glc, L-Glc, L-Rha) tika izšķīdināti piridīnā (100 ul), kas satur L-cisteīna metilestera hidrohlorīdu (0, 5 mg). L-ramnozes paraugs tika izšķīdināts piridīnā (100 µL), kas satur D-cisteīna metilestera hidrohlorīdu (0, 5 mg). Pēc tam tos 1 stundu karsēja 60 grādos. Šķīdumus apstrādāja ar 1 ul (1, 11 mg) o-tolilizotiocianāta, ko atkal karsēja 60 grādu temperatūrā 1 stundu. Katrs gala maisījums tika tieši analizēts ar analītisko RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18 kolonna, 17% aq. MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 grādi). Pīķa tR 21, 9 un 40, 4 minūtēs sakrita ar attiecīgi D-glikozes un L-ramnozes tiokarbamoiltiazolidīna atvasinājumu.
3.7. Šūna Kultūra
Peļu makrofāgi, RAW 264.7, tika iegūti no Korejas Biozinātnes un biotehnoloģijas pētniecības institūta (Daejeon, Koreja) un audzēti RPMI barotnē, kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma un 100 U/ml penicilīna/streptomicīna sulfāta. Šūnas tika inkubētas mitrinātā 5% CO2 atmosfērā 37 grādu temperatūrā.
3.8.Narkotikas un ķīmiskās vielas
RPMI, penicilīns un streptomicīns tika iegādāti no HyClone (Logan, UT, ASV). Liellopu seruma albumīns un LPS tika iegādāti no Sigma (St. Louis, MO, ASV).
3.9. NO ražošanas mērījumi
Nitrītu koncentrācija barotnē tika mērīta kā NO ražošanas indikators saskaņā ar Griesa reakciju. Šūnas tika iesētas 96-iedobju kultūras plāksnēs ar attiecību 2:105 šūnas/iedobē. Pēc RAW 264.7 šūnu iepriekšējas inkubācijas 18 stundas, šūnas tika iepriekš apstrādātas ar savienojumiem (50 uM, 10 uM, 5 uM vai 1 uM) un stimulētas ar LPS (500 ng/ml) 24 stundas. h. Testējamie savienojumi, kas izšķīdināti DMSO. Šūnas tika apstrādātas arī ar 0,05% DMSO kā nesēja kontroli. RAW 264.7 šūnas (2: 105 šūnas/iedobē) tika kultivētas 96-iedobju plāksnēs, izmantojot RPMI bez fenolsarkanā, un iepriekš apstrādātas ar paraugiem 0,5 stundas. Šūnu NO ražošana tika ierosināta, pievienojot 500 ng/ml galīgās koncentrācijas LPS un 24 stundu inkubāciju. Pēc inkubācijas 100 uL kondicionētas barotnes tika sajauktas ar tādu pašu Griesa reaģenta daudzumu un inkubētas 15 minūtes. Maisījuma absorbcija pie 540 nm tika mērīta ar ELISA mikroplašu lasītāju (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Ričmonda, Kalifornija, ASV). Iegūtās vērtības tika salīdzinātas ar RPMI izšķīdinātā nātrija nitrīta standarta koncentrāciju vērtībām, un tika aprēķinātas nitrīta koncentrācijas ar paraugu apstrādāto šūnu kondicionētajā barotnē.
3.10.3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīda (MTT) tests šūnu dzīvotspējas noteikšanai
Šūnas tika iesētas {{0}}iedobju plāksnēs ar blīvumu 5:104 šūnas/iedobē un inkubētas ar barotni, kas nesatur serumu paraugu klātbūtnē. Testējamie savienojumi, kas izšķīdināti DMSO. Šūnas tika apstrādātas arī ar 0,05% DMSO kā nesēja kontroli. Pēc 24 stundu inkubācijas pievienoja 10 ul MTT (5 mg/ml fizioloģiskā šķīdumā) un inkubāciju turpināja vēl 4 stundas. Mitohondriju sukcināta dehidrogenāze dzīvās šūnās inkubācijas laikā pārvērš MTT redzamos formazāna kristālos. Pēc tam formazāna kristāli tika izšķīdināti dimetilsulfoksīdā, un absorbcija tika mērīta pie 540 nm, izmantojot ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu (ELISA) mikroplašu lasītāju (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relatīvā šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta, salīdzinot ar neapstrādātās kontroles grupas absorbciju. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros.
3.11. Imunoblota analīze
Olbaltumvielu ekspresija tika novērtēta ar Western blot metodi saskaņā ar standarta procedūrām. Īsumā, RAW264.7 šūnas tika kultivētas 6{{20}} mm kultivēšanas trauciņos (2:106/mL), kam sekoja 50 uM savienojumu iepriekšēja apstrāde. . Šūnas divas reizes nomazgāja ledusaukstā PBS (pH 7, 4), šūnu granulas 15 minūtes atkārtoti suspendēja līzes buferšķīdumā uz ledus, un pēc tam šūnu atliekas tika noņemtas, centrifugējot. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta, izmantojot Bio-Rad proteīna testa reaģentu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Olbaltumvielas (20–30 ug) sajauca 1:1 ar 2: parauga buferšķīdumu (20 procenti glicerīna, 4 procenti SDS, 10 procenti 2- ME, 0,05 procenti bromfenolzilā un 1,25 M Tris [pH 6,8]), kas ievietots 8 vai 15 procentu SDS-PAGE gēlos un 90 minūtes darbināts ar 150 V spriegumu. Šūnu proteīni tika pārnesti uz Immunoblot polivinilidēna difluorīda membrānām (Bio-Rad), izmantojot Bio-Rad daļēji sausu pārneses sistēmu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam membrānas nakti inkubēja ar attiecīgajām p-NF-入B, NF-入B, pI入B un -aktīna primārajām antivielām (Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) Tris buferšķīdumā, kas satur 5 procentus vājpiena un 0,1 procentus Tween. 20. Nākamajā dienā blotus trīs reizes mazgā ar Tris buferšķīdumu (0,1 procents Tween 20) un inkubēja 1 stundu ar HRP konjugētu sekundāro anti-IgG antivielu (atšķaidīts 1:2000–1). :20 000). Bloti tika atkārtoti trīs reizes mazgāti ar Tris buferšķīdumu (0, 1 procenti Tween 20), un imūnreaktīvās joslas tika izveidotas, izmantojot hemiluminiscējošo substrātu ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, ASV).
3.12.Statistikas analīze
Eksperimentālie dati ir parādīti kā vidējais o SEM. Statistiskās nozīmības līmenis tika noteikts ar dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Daneta t-tests vairākiem salīdzinājumiem. P Vērtības, kas mazākas par 0,05, tika uzskatītas par nozīmīgām.
Cistanche salsas ekstrakts
4. Secinājumi
Šajā pētījumā mēs izolējām un noskaidrojām piecu jaunu fenilpropanoīdu aizvietotu glikozīdu struktūras, kas nosauktas par cistansalsīda AE (5, 6, 12, 17 un 18), papildus 13 zināmo savienojumu izolēšanai un identificēšanai, izmantojot dereplicēšanas stratēģiju. Tika noteikts, ka zināmie savienojumi ir lipedozīds AI (1) [21], 23-acetilakteozīds (2) [22], izocistanosīds C (3) [15], osmantusīds B (4) [21], epimeridinozīds A ( 7) [15], cistanozīds D (8) [23], salsazīds B (9) [6], tubulozīds E (10) [16], cistanīds M (11) [15], izomartynozīds (13) [24], salsazīds C (14) [6], jionozīds C (15) [25] un salsasīds F (16) [6]. To struktūras tika noteiktas, analizējot plašus spektroskopiskos datus un salīdzinot ar literatūrā sniegtajiem datiem. Tika apstiprināts, ka provizoriski prognozētās fenilpropanoīdu aizvietoto glikozīdu struktūras tika pareizi saskaņotas ar to reālajām struktūrām.
Cistanche salsas ekstrakta priekšrocības
Atsauces
1. Šimamura, H.; Mijazava, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Trp-P-1 SOS-inducējošās aktivitātes nomākšana ar taukskābēm no Cistanche salsas Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu testā. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Džeons, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Cistanches salsas pretizplatīšanās ietekme uz labdabīgas prostatas hiperplāzijas progresēšanu. Var. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94., 104.–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Sju, R.; Van, Y.; Džou, Q.; Sun, S. Herba Cistanches ātra diskriminācija ar daudzpakāpju infrasarkano makro pirkstu nospiedumu nospiedumu apvienojumā ar mīkstu neatkarīgu klases analoģijas modelēšanu (SIMCA). Spectrochim. Acta A daļa Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Dzjans, J.; Li, SP; Vanga, YT; Čens, XJ; Tu, PF Herba Cistanches diferenciācija pēc pirkstu nospiedumiem ar augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas-diožu masīva noteikšanas masas spektrometriju. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobajaši, H.; Karasava, H.; Mijase, T.; Fukushima, S. Pētījumi par Cistanchis Herba sastāvdaļām. V. Divu jaunu fenilpropanoīdu glikozīdu, Cistanosides E un F, izolācija un struktūras. Chem. Pharm. Bullis. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lejs, L.; Dzjans, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Vu, L.-J.; Čens, F.-K. Jauni glikozīdi no Cistanche salsas. Helv. Čim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbajeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsaļamova, EN; Ternynko, II Kazahstānas Republikā augošās Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck fenola savienojumu sastāva izpēte. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zenga, Z.-L. Uzlabota feniletanoīdu glikozīdu uzkrāšanās, ievadot prekursorus Cistanche salsa suspensijas kultūrā. Biochem. Inž. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Marujama, S.; Akasaka, T.; Jamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsas ekstrakts darbojas līdzīgi kā ar olbaltumvielām saistītais
polisaharīds-K (PSK) uz dažāda veida šūnu līnijām. J. Tradīts. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Feniletanoīdu glikozīdi no Cistanches salsa inhibē apoptozi, ko neironos inducē 1-metil-4-fenilpiridīnija jons. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Mišels, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Jaunas koncepcijas, eksperimentālās pieejas un dereplicēšanas stratēģijas jaunu fitoestrogēnu atklāšanai no dabīgiem avotiem. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nīlsens, A.; Ingmārs, H.; Larsens, TO; Nīlsens, KF; Rodrigues-Filho, E. Depsides theaflavins ST un lecanora DF dereplication-guided izolēšana no endofītiskās sēnītes Setophoma sp. Fitoķīmija 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampiaņina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodņiks, C.; Brodijs, PJ; Blasiaks, LC; Hils, R.; TenDiks, K.; Shen, Y.; un citi. Antiproliferatīvi un antiplazmodiāli savienojumi no atlasītām Streptomyces sugām. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Vanga, Y.-M.; Li, H.-J. Dereplikācijas vadīta jaunu hepatoprotektīvo triterpenoīdu saponīnu izolēšana no Celosiae Semen ar augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju, kas apvienota ar elektrosmidzināšanas jonizācijas tandēma kvadrupola un lidojuma laika masas spektrometriju. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132., 148.–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Če, Y.; Vū, Dž.; Van, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. LTQ-Orbitrap balstīta stratēģija tradicionālajai ķīniešu medicīnai, kas vērsta uz klases atklāšanu, identifikāciju un viņas omikas pētījumiem: gadījuma izpēte par feniletanoīdu glikozīdiem trīs dažādās Herba Cistanches sugās. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Jošizava, F.; Dejama, T.; Takizava, N.; Usmangani, K.; Ahmad, M. Cistanche tubulosa (Schrenk) Āķa sastāvdaļas. f. II. Jauna feniletanoīda glikozīda un jauna neoligāna glikozīda izolācija un struktūras. Chem. Pharm. Bullis. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakašima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Vienkārša Aldozes enantiomēru diskriminācija ar apgrieztās fāzes HPLCistancheChem. Pharm. Bullis. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Vanga, XL; Iņ, ZQ; Sja, B.; Li, N. Pētījums par cis-kanēļskābi Arabidopsis thaliana. Augu fiziol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-Equilibrium of Hydroxycinnamic Acids apstarojot ūdens šķīdumus pie dažādiem pH. Fitoķīmija 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
