DAĻAⅠ: Pahimīnskābes ietekme un molekulārais mehānisms uz nieru išēmijas reperfūzijas traumu
Mar 25, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG un XIAO-HUI LIAO
Ievads
Akūts nieru bojājums (AKI)ir izplatīta klīniska slimība, ko izraisa vairākas etioloģijas un kurai ir sarežģīts patofizioloģisks process (1). AKI saslimstības un mirstības rādītāji pieaugušajiem un bērniem ir augsti, tādējādi radot ievērojamas hospitalizācijas izmaksas (2,3). AKI globālās sastopamības metaanalīzē atklājās, ka AKI sastopamības rādītāji bija 21,6 procenti pieaugušajiem un 33,7 procenti bērniem, un ar AKI saistītās mirstības rādītāji bija 23,9 procenti pieaugušajiem un 13,8 procenti bērniem (4). AKI rodas ~20 procentiem stacionāro pacientu, no kuriem 10 procentiem nepieciešama nieru aizstājterapija, un pat 50 procentiem pacientu intensīvās terapijas nodaļās, tādējādi būtiski palielinot hospitalizācijas ilgumu un izmaksas (5).AKI raksturo straujš glomerulārās filtrācijas ātruma samazinājums īstermiņā, ko pavada kreatinīna līmeņa paaugstināšanās serumā, oligūrija vai abi; šīs izmaiņas var izraisīt hronisku nieru slimību vai beigu stadijas nieru slimību (6). Ņemot vērā nieru bojājumu mainīgumu, uzticamu agrīnu biomarķieru trūkumu un patofizioloģijā iesaistīto ceļu neviendabīgumu, pašlaik nav efektīvu profilakses un iejaukšanās līdzekļu, izņemot konservatīvu ārstēšanu un nieru aizstājterapiju (7). Tādējādi ir īpaši svarīgi identificēt jaunas AKI ārstēšanas shēmas un zāles. Pēdējo desmit gadu laikā ir veikti daudzi pētījumi, kas paplašina tradicionālo skatījumu uz nekrozi. Jaunākie pētījumi ir apstrīdējuši tradicionālos uzskatus par šūnu nāvi, identificējot jaunus ceļus, kuros šūnas mirst regulētā veidā, bet uzrāda nekrozes morfoloģiskās pazīmes (7-9). Šai regulētajai nekrozei ir vairākas formas: nekroptoze, ferroptoze, piroptoze, mitohondriju caurlaidības pārejas izraisīta nekroze un partanatos (10). Nekroptoze un ferroptoze ir visvairāk pētītās regulētās nekrozes formas, kas rodas nierēs (11). Iepriekšējais pētījums parādīja, ka ferroptozes inhibēšana efektīvi uzlabo AKI (12).
cistanche pharma specialpriekšnieres
Ferroptoze ir jauns regulējošās šūnu nāves veids, ko pirmo reizi ierosināja Diksons et al 2012. gadā (13). Šāda veida šūnu nāve ir atkarīga no dzelzs, un to pavada masīva dzelzs uzkrāšanās un lipīdu peroksidācija šūnu nāves laikā (13). Ferroptozei ir svarīga regulējoša loma vairāku slimību, tostarp audzēju, neiroloģisko slimību un AKI (14) rašanās un attīstības procesā. In vivo pētījumā ferostatīns 1 vai 16-86 tika ievadīts 15 minūtes pirms išēmijas pelēm ar smagasišēmijas-reperfūzijas bojājums(IRI)-AKI un nieru audu bojājumi, seruma kreatinīns un urīnviela pelēm samazinājās 48 stundas pēc išēmijas, tādējādi liekot domāt, ka ferroptozei ir izšķiroša nozīme IRI patoģenēzē.išēmijas-reperfūzijas bojājums)(15). Tāpēc dzelzs homeostāzes regulēšana, pretošanās lipīdu peroksidācijai un ferroptozes inhibēšana var nodrošināt daudzsološu AKI terapeitisko stratēģiju.
Pahidermiskā skābe(PA), lanostāna tipa triterpenoīdam no Poria cocos, ir vairākas farmakoloģiskas iedarbības, piemēram, pretaudzēju, pretiekaisuma, antioksidantu, hipoglikēmisku, sedatīvu un hipnotisku darbību (16-20). Iepriekšējā pētījumā ziņots, ka PA.(Pahimīnskābe)var uzlabot nieru bojājumus sepses laikā žurkām, inhibējot iekaisuma reakcijas un aktivizējot no kodolfaktora eritroīdo atvasinātu 2 like 2(NRF2)/hēma oksigenāzes 1(HO-1) ceļu caur antioksidantu stresu (21). Turklāt porikoīnskābe A efektīvi uzlabo melatonīna inhibīciju pārejā no AKI uz hronisku nieru slimību pēc nieru išēmijas/reperfūzijas traumas (22). PA(Pahimīnskābe)aizsargā pret AKI, tomēr šis aizsardzības mehānisms vēl ir jāturpina pētīt. PA(Pahimīnskābe)ir ziņots, ka tas aktivizē NRF2 pētījumā par nieru bojājumu sepses gadījumā (21). Proti, pirmie divi ferroptozi izraisošie aģenti (RSL-3 un elastīns), kas identificēti ferroptozes pētījumos, ierosina ferroptozes kaskādi, inhibējot glutationa peroksidāzi 4 (GPX4) un cistīna/glutamāta transportera sistēmu (xC-/xCT), attiecīgi, abi ir NRF2 pakārtotie mērķi (23). PA(Pahimīnskābe)Tiek pieņemts, ka tas regulē savus pakārtotos proteīnus, GPX4 un xCT, aktivizējot NRF2 un traucējot ferroptozi AKI. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt PA ietekmi(Pahimīnskābe)par ferroptozi pelēm ar išēmijas-reperfūzijas nieru bojājumu un nosaka tā pamatā esošo molekulāro darbības mehānismu, lai sniegtu jaunas idejas klīniskās AKI ārstēšanai.
materiāli un metodes
Reaģenti un dzīvnieki.
PA(Pahimīnskābe)(balts kristālisks pulveris ar tīrību 99,9% vai lielāku) tika iegādāts no MedChemExpress (kat.nr.HY-N0371) un uzglabāts 4C temperatūrā prom no gaismas. Kopā 30 C57BL/6 peļu tēviņi (8-10 nedēļas; 20-25 g ķermeņa svara) tika iegādāti no Čuncjinas Medicīnas universitātes (Čuncjina, Ķīna). Izmitināšanas apstākļi bija šādi: 12 h gaišs/12 h tumšs, ~60 procentu mitrums, 25 grādi, brīva pieeja dzeramajam ūdenim un pārtikai, gultasveļas maiņa ik pēc 3 dienām; dzeramais ūdens un pakaišu materiāli pirms lietošanas tika dezinficēti. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatu, ko izdeva Nacionālie veselības institūti 1996. gadā (24). Šo pētījumu apstiprināja Čuncjinas Medicīnas universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (Čuncjina, Ķīna; apstiprinājuma nr.{17}}).
Išēmijas-reperfūzijas bojājums-AKI modelis.
Peles tika barotas tādos pašos apstākļos 1 nedēļu, lai izveidotu nieru modeliišēmijas-reperfūzijas bojājums, kā aprakstīts iepriekš (25). Peles tika anestēzētas ar 50-60 mg/kg pentobarbitāla nātrija (kat.nr. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA), veicot intraperitoneālu injekciju; āda ķirurģiskajā zonā tika noslaucīta ar 70 procentiem spirta. Iegriezums tika novietots mugurkaula kreisajā un labajā pusē (0,5 cm), un griezuma garums bija 1-1,5 cm gar muguru. Pēc tam nieres tika izvilktas no griezuma, lai atklātu nieres kātiņu. Mikroaneirisma klips tika izmantots, lai saspiestu kātiņu, lai bloķētu asins plūsmu nierēs un izraisītu nieru išēmiju. Pilnīga išēmija, par ko liecina nieru krāsas maiņa no sarkanas uz tumši purpursarkanu dažu sekunžu laikā. Pēc 40 minūšu išēmijas tika atbrīvoti mikroaneirisma klipi, lai katra niere varētu sākt reperfūziju, par ko liecināja nieru krāsas maiņa uz sarkanu. Muskuļu āda tika sašūta pēc tam, kad nieru krāsa normalizējās. Visa nieru išēmijas procedūra tika pabeigta uz termostata paliktņa, un peļu ķermeņa temperatūra tika uzturēta nemainīga 36.{11}} grādu līmenī. Katrai pelei intraperitoneāli ievadīja kopā 0, 8 ml silta sterila fizioloģiskā šķīduma. Katrs dzīvnieks tika novietots uz sildīšanas paliktņa, līdz tas atguva pilnu samaņu, un pēc tam tika atgriezts savā būrī. Peles tika nogalinātas ar dzemdes kakla dislokāciju 24 stundas pēc operācijas, un asinis tika savāktas no orbitālās sinusa. Viena trešdaļa nieru audu tika izmantota histopatoloģiskām analīzēm, un atlikušās divas trešdaļas tika ātri uzglabātas -80 grādu pakāpē.
Dzīvnieku grupas.
C57BL/6 peles tika sadalītas piecās grupās (n=6/grupa) saskaņā ar nejaušu skaitļu tabulu šādi: fiktīva grupa (fiktīva), modeļu grupa (IRI), zemas devas grupa (IRI plus PA)) , vidējas devas grupa (IRI plus PAw) un lielas devas grupa (IRI plus PAg). Dzīvnieki trīs eksperimentālajās ārstēšanas grupās saņēma intraperitoneālu injekciju ar PA(Pahimīnskābe)5, 10 un 20 mg/kg devās. bet 3 dienas, pirms modelis tika ierosināts. Viltus un IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums) grupas tika injicētas ar tādu pašu daudzumu dimetilsulfoksīda 3 dienas pirms modeļa indukcijas. Modelēšanas metode tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (25). Divpusējie nieres kātiņi fiktīvas grupas pelēm tika pakļauti un apstrādāti, kā minēts iepriekš, bet netika saspiesti. Ķirurģiskais griezums tika sašūts pēc 40 minūtēm.
Seruma bioķīmiskā analīze.
Peles tika nogalinātas 24 stundas pēc operācijas, un no orbītas sinusa tika savākti 0.8-1 ml asiņu, ļāva atpūsties 30 minūtes un centrifugēja ar ātrumu 900 x g 10 minūtes 4 ° C temperatūrā. Augšējais seruma slānis tika savākts, iesaiņots un uzglabāts -80 grādu temperatūrā. Seruma kreatinīna (Scr; cat.no.c011-2-1) un urīnvielas slāpekļa (BUN: cat.no.cO13-2-1) līmenis tika novērtēts, izmantojot reaģentu komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts). ).
Histopatoloģiskā izmeklēšana.
24 h pēc IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums), nieru audu daļas tika fiksētas 10 procentu neitrāli buferētā formalīnā 24-48 h istabas temperatūrā, regulāri apstrādājot, iestrādājot parafīnā. Ar parafīnu fiksētie audu paraugi tika sagriezti 4 μm biezās daļās, kuras tika uzstādītas uz stikla priekšmetstikliņiem un 10 minūtes krāsotas ar hematoksilīnu istabas temperatūrā un eozīnu 3 minūtes istabas temperatūrā. Lai noteiktu nieru histopatoloģiskās izmaiņas (palielinājums, x200 un x400), tika izmantots gaismas mikroskops BX51 (Olympus Corporation). Pallera rādītājs tika izmantots, lai novērtētu nieru tubulāro nekrozi nieru IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)(26). Kopā ar lielu palielinājumu, izmantojot optisko gaismas mikroskopu (palielinājums, x400), nejauši tika atlasīti 10 nepārklājošie apgabali, un katrā redzes laukā tika nejauši atlasīti 10 nieru kanāliņi. Trīs peļu nieru patoloģijas sadaļas katrā eksperimentālajā grupā tika nejauši atlasītas novērošanai. Katrai patoloģiskajai sadaļai tika nejauši atlasīti 10 redzes lauki, un katrā redzes laukā tika novērtēti 10 nieru kanāliņi. Katrai pelei kopumā tika novēroti 100 kanāliņi, kopumā katrā grupā tika novēroti 300 nieru kanāliņi. Jo augstāks rādītājs, jo nopietnāka ir nieru kanāliņu bojājuma pakāpe.
Transmisijas elektronu mikroskopija (TEM).
Nieru audi tika savākti 24 stundas pēc operācijas. Pēc anestēzijas 1 mm² nieru audi tika izņemti in vivo un iemērc audu fiksācijas šķīdumā, kas sastāv no 2,5% glutaraldehīda un fosforskābes buferšķīduma (kat.nr.G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 2 stundas 4 grādu temperatūrā, dehidrēts pakāpenisks etanols (50-100 procenti) un propilēna oksīds, kas iestrādāts Epon 812 (kat. Nr. GP18{{20}}10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. 1 stundu 35 grādu temperatūrā un cieta 24 stundas 60 grādu temperatūrā. Īpaši plānas sekcijas (biezums, 50-70 nm) uzlika uz 200-tīkla vara režģiem un 30 minūtes krāsoja ar 2% uranilacetātu istabas temperatūrā un 0,04% svina citrāta. 15 minūtes istabas temperatūrā. Paraugi tika skatīti elektronu mikroskopā (JEM-1400 plus, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; palielinājums, x5,000 un x10,{{27} }). Attēli tika iegūti, izmantojot SlowScan ar uzlādi savienotu ierīces kameru un TEM analySIS5.0 programmatūru (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Antioksidanta glutationa (GSH) un lipīdu peroksidācijas malondialdehīda (MDA) noteikšana.
Tika savākti nieru audi (50-100mg), un audiem tika pievienots fizioloģiskais sāls šķīdums (kat.nr. B020; Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts) svara (g): tilpuma (ml) attiecībā 1:9. Audi tika homogenizēti, lai iegūtu 10 procentu audu homogenātu, kas tika centrifugēts ar ātrumu 13 800 xg 15 minūtes 4 grādu temperatūrā. Supernatants tika noņemts, un kopējais olbaltumvielu saturs supernatantā tika noteikts, izmantojot bicinhonīnskābes metodi (21). GSH (kat.nr.A006-2-1) un MDA (kat.nr.A003-2-2) tika novērtētas, izmantojot reaģentu komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts).
Western blotēšana.
Kopējais proteīns tika ekstrahēts no peles nieru audiem, izmantojot RIPA šūnu līzes buferi (kat. Nr. WO{{0}}; Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts), un proteīna koncentrācijas tika noteiktas, izmantojot BCA testu (kat.nr. A{). {1}}; Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts). Ar SDS-PAGE(Cox-2,10) tika atdalīts vienāds olbaltumvielu daudzums (50μug).0 ;NRF2,10.0;xCT,12.5;HO-1, 12.5; GPx4.15.0 procenti ) un pārnest uz PVDF membrānām (GE Healthcare Life Sciences). Pēc tam membrānas tika bloķētas ar 5 procentiem sausā vājpiena pulveris 1 stundu istabas temperatūrā un inkubēts ar primārajām antivielām pret: ciklooksigenāzi 2(COX-2;1:1,000; kat. nr.ab179800;Abcam), GPX4( 1:5,000;kat.nr.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;kat.nr.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 kat.nr.101147;Gentex)un NRF2 (1:1,000;kat.nr.D1Z9C;CST)pa nakti 4 grādos .Pēc tam membrānas nomazgāja ar TBST (0,1% Tween) -20)trīs reizes. Pēc primārā iec ubācija, membrānas tika inkubētas ar mārrutku peroksidāzi konjugētām sekundārajām antivielām (1:10, 000;40295G; BIOSS) 1 stundu istabas temperatūrā. Membrānas tika atkārtoti mazgātas trīs reizes ar TBST un vizualizētas ar BeyoECLPlus (kat. Nr. P00185; Beyotime Biotehnoloģijas institūts), izmantojot Chemi Doc attēlveidošanas sistēmu (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Olbaltumvielu joslu intensitāte tika noteikta, izmantojot ImageJ v1.8.0 programmatūra (Nacionālie veselības institūti). Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros.
Reversās transkripcijas kvantitatīvā (RT-g) PCR.
Kopējā RNS tika ekstrahēta no dažādu grupu peļu nierēm, izmantojot TRIzol reaģentu (Takara Bio, Inc.), un cDNS tika sintezēta, izmantojot PrimeScript RT reaģenta komplektu ar gDNA dzēšgumiju (kat.nr.RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) Mērķa gēnu relatīvie līmeņi tika noteikti, izmantojot qPCR, izmantojot Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.). RT-qPCR tika veikts 25 ul tilpumā ar 2 ul cDNS, 400 nM katrs sensors un antisense primer un 12,5 ul Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. uz ABI PRISM 7000 sistēmas (Applied Biosystems; Thermo Fisher). Scientific, Inc). ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' un atpakaļgaita,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 uz priekšu, 5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' un atpakaļgaita,5'-GTTGAAACTGAGGGAA {28}}';xCT uz priekšu, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' un atpakaļgaitā, 5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 uz priekšu,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'un atpakaļgaita,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 uz priekšu.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' un reverss,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; un -aktīns uz priekšu,5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' un reverss,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3”.
Gēnu ekspresijas vidējā vērtība pēc aktīna normalizācijas tika izmantota kā kalibrators, lai noteiktu mērķa gēnu relatīvos līmeņus. Mērķa gēnu relatīvie ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot 2-△C metodi (27).
Statistiskā analīze.
Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism 7.{1}}(GraphPad Software, Inc.) un SPSS 23 programmatūru (IBM Corp.. Dati tiek parādīti kā trīs neatkarīgu atkārtojumu vidējā ± standarta novirze, ja vien nav norādīts citādi. Vienvirziena Lai salīdzinātu atšķirības starp vairākām grupām, tika izmantota ANOVA, kam sekoja Tukey post hoc tests<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultāti
PA(Pahimīnskābe)samazina nieru bojājumus pelēm ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums). Scr un BUN ir divi svarīgi nieru darbības rādītāji (5). Scr un BUN līmenis IRI bija ievērojami augstāks(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupā, salīdzinot ar tiem, kas bija fiktīvajā grupā (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Pahimīnskābe)ievērojami mazināja seruma kreatinīna un urīnvielas līmeņa paaugstināšanos, salīdzinot ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa (P<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Pahimīnskābe)ārstēšanas grupa un IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums) group (P>0.05; 1A un B att.).
Kā parādīts 1. D attēlā, nieres audu H&E krāsošana fiktīvajā grupā neuzrādīja būtiskas izmaiņas nieru audu struktūrā. Un otrādi, IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupā tika novērota tūska un nieru kanāliņu epitēlija šūnu zudums, kanāliņu paplašināšanās, intersticiāls iekaisums, iekaisuma šūnu infiltrācija, kolagēna nogulsnēšanās un nogulsnēšanās caurules nekrozes materiāls (1. att. D). Pallera rādītājs, nieru audu bojājuma rādītājs (26), IRI bija ievērojami augstāks(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupas, salīdzinot ar viltus grupu (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pahimīnskābe)terapija ievērojami uzlaboja šos bojājumus, un Pallera rādītājs bija ievērojami zemāks nekā IRI.(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa (P<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums) model group and the low-dose group (P>0.05; 1C att.).
1. attēls. PA(Pahimīnskābe)mazina nieru bojājumus pēc išēmijas-reperfūzijas.(A) BUN un (B) seruma kreatinīna līmenis tika mērīts pelēm fiktīvajā, IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums), IRI plus PAL, IRI plus PAM un IRI plus PAH grupas (40 min nieru išēmija, kam seko 24 h reperfūzija; n=6/grupa). (C) Pallera rādītāji tika izmantoti, lai novērtētu nieru kanāliņu bojājumus fiktīvas, IRI, IRI plus PAL, IRI plus PAM un IRI plus PAH grupās (n=3/grupā). (D) Nieru hematoksilīna un eozīna attēli no pelēm Sham, IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums), IRI plus PAL, IRI plus PAM un IRI plus PAH grupa. Mēroga josla, 50 µm. Dati tiek parādīti kā vidējā ± standarta novirze. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Pahimīnskābe), pahidermiskā skābe; BUN, asins urīnvielas slāpeklis; IRI,išēmijas-reperfūzijas bojājums; L, zemas devas grupa; M, mērenu devu grupa; H, lielu devu grupa.
PA ietekme(Pahimīnskābe)par morfoloģiskajām izmaiņām mitohondrijās peļu nieru audos pēc nieru IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums). TEM neuzrādīja būtiskas izmaiņas nieru audu mitohondriju struktūrā viltus grupā. Modeļu grupā nieru audos tika novērotas ar ferroptozi saistītas mitohondriju izmaiņas, piemēram, samazināts mitohondriju tilpums, palielināts membrānas blīvums un samazinātas vai vispār neesošas mitohondriju kristas (Zīm.2A). Salīdzinājumā ar modeļu grupas mitohondrijiem mērenās devas grupā galvenokārt bija tūska, un specifiskās ferroptozei raksturīgās izmaiņas bija reti sastopamas (2.A att.). Tomēr lielas devas PA(Pahimīnskābe)grupā netika novērotas raksturīgas ferroptozes izmaiņas nieru audu mitohondrijās, un tika novērota tikai viegla tūska (2.A att.). Izmaiņas mitohondrijās mazo devu grupā bija tādas pašas kā modeļa grupā (2.A att.).
PA ietekme(Pahimīnskābe)par GSH un MDA ekspresiju nieru IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums). GSH ir nepieciešams kofaktors GPX4 funkcijai.GSH sintēze tieši ietekmē GPX4 aktivitāti.MDA ir lipīdu oksidācijas produkts, kas atspoguļo intracelulārās lipīdu peroksidācijas pakāpi un netieši atspoguļo ferroptozes rašanos(28,29). Kā parādīts 2.B attēlā, nieru audos bija ievērojami zemāks GSH līmenis IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa, salīdzinot ar fiktīvo grupu. Narkotiku ārstēšanas grupās GSH ekspresija bija ievērojami augstāka IRI plus PA un IRI plus PAn grupās, salīdzinot ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)modeļu grupa (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Un otrādi, kā parādīts 2. C attēlā, audu lipīdu peroksidācija bija lielāka (pamatojoties uz MDA līmeni) IRI.(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa, salīdzinot ar fiktīvo grupu. Narkotiku ārstēšanas grupās MDA līmenis bija ievērojami zemāks IRI plus PA un IRI plus PAu grupās, salīdzinot ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa (P<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
2. attēls. PA(Pahimīnskābe)samazina ferroptozi IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)- akūts nieru bojājums.(A) Transmisijas elektronu mikroskopijas attēli Sham, IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums), IRI plus PAL, IRI plus PAM un IRI plus PAH grupas (40 min nieru išēmija, kam seko 24 h reperfūzija). Palielinājums, x20, 000; mēroga josla, 1 µm. Melnās bultiņas norāda, ka nieru audos mitohondriju tilpums samazinājās, membrānas blīvums palielinājās un samazinājās, vai arī pazuda mitohondriju kristāli. Zilās bultiņas norāda uz mitohondriju tūsku. Tika novērtēts (B) GSH un (C) MDA līmenis nieru audos (n=6/grupā). Dati tiek parādīti kā vidējā ± standarta novirze. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupai. PA(Pahimīnskābe), pahidermiskā skābe; IRI,išēmijas-reperfūzijas bojājums; L, zemas devas grupa; M, mērenu devu grupa; H, lielas devas grupa; GSH, glutations; MDA, malondialdehīds.
PA(Pahimīnskābe)regulē ar ferroptozi saistīto proteīnu ekspresiju nieru IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums). Šajā pētījumā ar ferroptozi saistīto proteīnu GPX4, xCT un HO-1 ekspresijas līmeņi tika noteikti, izmantojot Western blot (3.A un B. att.) un RT-qPCR (3.C. att.) analīzi. Rezultāti parādīja, ka GPX4, xCT un HO-1 olbaltumvielu līmenis IRI bija ievērojami pazemināts.(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa, salīdzinot ar viltus grupu (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pahimīnskābe)ievērojami palielināja GPX4, xCT un HO-1 proteīna un mRNS ekspresijas līmeni, salīdzinot ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa (P<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums)un zemas devas PA(Pahimīnskābe) treatment groups (P>0.05; 3.B un C att.).
3. attēls. PA(Pahimīnskābe)palielina ar ferroptozi saistīto proteīnu GPX4, xCT un HO-1 ekspresijas līmeni.(A) Tika veikta Western blotēšana, lai noteiktu ar ferroptozi saistīto proteīnu GPX4, xCT un HO-1 ekspresijas līmeņus IRI.(išēmijas-reperfūzijas bojājums)- akūtu nieru bojājumu peles (n=3). (B) GPX4, xCT un HO-1 pelēko vērtību relatīvā izteiksme. (C) Tika veikta reversās transkripcijas kvantitatīvā PCR analīze, lai noteiktu ar ferroptozi saistīto proteīnu (n=3) mRNS ekspresijas līmeņus. Dati tiek parādīti kā vidējā ± standarta novirze. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupai. PA(Pahimīnskābe), pachydermic acid; GPX4, glutationa peroksidāze 4; xCT, glutamāta transportētāja sistēma; HO-1, hēma oksigenāze 1; IRI,išēmijas-reperfūzijas ievainojumsy; L, zemas devas grupa; M, mērenu devu grupa; H, lielu devu grupa.
Rezultāti parādīja, ka ar ferroptozi saistītā lipīdu peroksidācijas proteīna COX-2 olbaltumvielu un mRNS līmenis IRI laikā tika ievērojami paaugstināts.(išēmijas-reperfūzijas bojājums)(4. att.). Ārstēšana ar vidēji lielu un lielu PA devu(Pahimīnskābe)ievērojami samazināta COX{0}} ekspresija salīdzinājumā ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa (P<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums)un zemas devas PA(Pahimīnskābe) treatment groups (P>0.05; 4. att.).
4. attēls. PA(Pahimīnskābe)samazina ar ferroptozi saistītā proteīna COX-2 ekspresijas līmeni.(A) Tika veikta Western blotēšana, lai noteiktu ferroptozes lipīdu peroksidācijas marķiera proteīna COX-2 ekspresijas līmeni pelēm ar IRI akūtu nieru bojājumu. (B) COX-2 pelēko vērtību relatīvā izteiksme. (C) Tika veikta reversās transkripcijas kvantitatīvā PCR analīze, lai noteiktu mRNS COX-2 ekspresiju (n=3). Dati tiek parādīti kā vidējā ± standarta novirze. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupai. PA(Pahimīnskābe), pahidermiskā skābe; COX-2, ciklooksigenāze 2; IRI,išēmijas-reperfūzijas bojājums; L, zemas devas grupa; M, mērenu devu grupa; H, lielu devu grupa.
PA(Pahimīnskābe)veicina NRF2 signalizācijas ceļa aktivizēšanu nieru IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums).Izpētīt PA ietekmi(Pahimīnskābe)NRF2 signalizācijas ceļā tika novērtēts NRF2 proteīna un mRNS līmenis (5. att.). Rezultāti parādīja, ka NRF2 ekspresija bija ievērojami zemāka IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa, salīdzinot ar fiktīvo grupu. Turklāt NRF2 ekspresija bija ievērojami augstāka IRI plus PAw un IRI plus PAH grupās, salīdzinot ar IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupa (P<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Turklāt ārstēšana ar PA(Pahimīnskābe)arī palielināja NRF2 ekspresiju atkarībā no devas (5. att.).
5. attēls. PA(Pahimīnskābe)aktivizē NRF2 signalizācijas ceļu.(A) Tika veikta Western blotēšana, lai noteiktu NRF2 proteīna ekspresiju IRI(išēmijas-reperfūzijas bojājums)- akūtu nieru bojājumu peles. (B) NRF2 pelēko vērtību relatīvā izteiksme (n=3). (C) Tika veikta reversās transkripcijas kvantitatīvā PCR analīze, lai noteiktu mRNS NRF2 ekspresiju (n=3). Dati tiek parādīti kā vidējā ± standarta novirze. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(išēmijas-reperfūzijas bojājums)grupai. PA(Pahimīnskābe), pahidermiskā skābe; NRF2, no eritroīdiem iegūts kodolfaktors 2 līdzīgs 2; IRI,išēmijas-reperfūzijas bojājums; L, zemas devas grupa; M, mērenu devu grupa; H, lielu devu grupa.
