IV daļas pētījums par 5-Fu/5-Fu+L-OHP izraisītas kaulu smadzeņu nomākuma modeli pelēm
Oct 09, 2024
Pašlaik plaši izmantotās metodes kaulu smadzeņu nomākšanas dzīvnieku modeļu konstruēšanai ietver radiācijas modelēšanu [1,2], ciklofosfamīda intraperitoneālās injekcijas modelēšanu [3-5], 5-fluoruracilu (5-fluoruracils, { {5}}FU) intraperitoneālās injekcijas modelēšana [6,7], starojums kombinācijā arķīmijterapijas zālessavienojumu modelēšana [8,9], pretepilepsijas zāļu karbamazepīna zondes modelēšana [10] utt. Dažādas modelēšanas metodes izraisa dažādus kaulu smadzeņu nomākšanas mehānismus, un ietekme uz dažādām asins šūnām un to pakāpe ir atšķirīga; dažādām ķīmijterapijas zālēm to atšķirīgo darbības mehānismu dēļ ir arī noteiktas atšķirības to iedarbībā uz kaulu smadzeņu hematopoēzi. Tāpēc ideālam kaulu smadzeņu nomākšanas dzīvnieku modelim ir liela nozīme, pētot ķīmijterapijas zāļu ietekmi uz kaulu smadzeņu hematopoēzi.
Klīniskajā praksē,adjuvanta ķīmijterapija kolorektālā vēža ārstēšanaigalvenokārt izmanto 5-FU režīmu un 5-Fu kombinācijā ar oksaliplatīnu (oksaliplatīns, L-OHP). Ir veikti attiecīgi pētījumi par tikai 5-Fu izmantošanu, lai izveidotu kaulu smadzeņu nomākuma dzīvnieku modeli. Tomēr 5-Fu izmantošanas joma ir salīdzinoši plaša. Literatūras ziņojumi ietver 110 mg/kg, intraperitoneālu injekciju (ip) d1 un d5 modelēšanai [7, 150 mg/kg, ip, d1 modelēšanai 16, 11], 200 mg/kg, ip, d1 modelēšanai [{{ 15}}], un 250 mg/kg, ip, d1 modelēšanai [16]. Tomēr nav saņemti ziņojumi par 5-Fu kombinācijā ar L-OHP, lai izveidotu kaulu smadzeņu nomākuma dzīvnieku modeli. Yu Linghong et al. [17] izmantoja 5-Fu kombinācijā ar L-OHP, lai izveidotu aknu bojājumu dzīvnieku modeli. Atsaucoties uz ievadīšanas metodi un devām literatūrā, komanda veica iepriekšēju izpēti par 5-Fu kombināciju ar L-OHP, lai izveidotu dzīvnieku kaula modeli.smadzeņu nomākšana, un salīdzināja modelēšanas metodi 5-Fu 200 mg/kg, ip, d1 un modelēšanas metodi 5-Fu 187,5 mg/kg + L-OHP 9 mg/kg, ip, d1. Rezultāti parādīja, ka šo divu modeļu deva bija pārāk liela. Tāpēc šī pētījuma mērķis ir turpināt pētīt optimālo devu 5-Fu izraisītas kaulu smadzeņu nomākuma dzīvnieku modelim un 5-Fu devu kombinācijā ar L-OHP modelēšanu, lai nodrošinātu ideālākais dzīvnieku modelisnākamais efektivitātes izpētes solisunQitu Erzhi receptes mehānisms.
Wecistanche atbalsta dienests
E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Materiāli un metodes
1 Eksperimentālie materiāli
1.1. Izmēģinājuma dzīvnieki
100 specifisku patogēnu nesaturošu (SPF) BALB/c peļu tēviņu, kas sver 20 g±2 g, iegādājās no SBEF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. un ievietoja būros Ķīnas Ķīnas Medicīnas akadēmijas Xiyuan slimnīcas Eksperimentālo dzīvnieku centrā. Zinātnes (kvalifikācijas sertifikāts: SYXK (Pekina) Nr. 2015-0011). Visas peles tika adaptīvi barotas 1 nedēļu, un barošanas periodā tām bija brīva piekļuve ūdenim un pārtikai. Barošanas apstākļi: iekštelpu temperatūra 20-26 grādi, relatīvais mitrums 40%~60%, gaišais/tumsas laiks 12h/12h. Šis eksperiments stingri atbilst attiecīgajiem Ķīnas Ķīnas Medicīnas zinātņu akadēmijas Xiyuan slimnīcas Eksperimentālo dzīvnieku pārvaldības ētikas komitejas noteikumiem un atbilst dzīvnieku ētikas standartiem.
1.2. Galvenās eksperimentālās zāles un reaģenti
5-Fu (fluoruracila injekcija) Oksaliplatīns injekcijām
0.01M fosfātu buferis (PBS buferis) Atšķaidītājs asins šūnu analīzei (MEK-640)
Tīrīšanas šķīdums asins šūnu analīzei (MEK-680) Hemolītisks līdzeklis asins šūnu analīzei (MEK-680) Tīrīšanas šķīdums asins šūnu analizatoram
Harisa hematoksilīna traips 0,5% eozīna traips
Neitrāls smaganu blīvēšanas līdzeklis
Minerālskābes tipa audu paraugu atkaļķošanas šķīdums
1.3. Galvenie instrumenti un aprīkojums
Automātiskais asins šūnu skaitītājs (MEK6318) Kapilāro asiņu savākšanas caurule (20 μL)
1000 μL pipetes uzgalis
Tissue-TEK VIP6 bioloģisko audu dehidrators Tissue-TEK TEC bioloģisko audu iegulšanas iekārta Leica RM2235 audu griezējs
Leica HI1210 šķēlumu savācējs Leica HI1220 šķēlīšu cepšanas mašīna
Leica ST5020 automātiskais krāsotājs Leica CV5030 automātiskais pārklājums Olympus Bx53 mikroskops
Path QC patoloģijas kvalitātes kontroles un datu pārvaldības sistēma
Pārējie: pipete, parastie elektroniskie svari, ķirurģiskās šķēres, pincetes, 75% spirts, medicīniskā marle, sterilas vates bumbiņas, šļirces utt.
1.4 Ķīmijterapijas zāļu sagatavošana
(1) Vienas zāles 5-Fu režīms
Izšķīdiniet {{0}}Fu (0,25 g/10 ml) 40 ml 0,9% NaCl šķīduma, lai sagatavotu šķīdumu ar koncentrāciju 5 mg/ml lietošanai gaidīšanas režīmā.
(2) 5-Fu kombinācijā ar L-OHP režīmu
Izšķīdiniet {{0}}Fu (0,25 g/10 ml) 40 ml 0,9% NaCl šķīduma, lai sagatavotu šķīdumu ar koncentrāciju 5 mg/ml gaidīšanas režīmā. izmantot. Izšķīdiniet 1 mēģeni L-OHP (50 mg) 5 ml 5% glikozes šķīduma un turpiniet atšķaidīt ar 5% glikozes šķīdumu līdz 0,5 mg/ml šķīdumam lietošanai.
Tabula 4-1 Zāļu režīma modelēšana
Saskaņā ar iepriekš minēto dozēšanas shēmu visas peles tika nosvērtas un dotas individuāli atbilstoši ķermeņa svaram. Divu zāļu grupā laika intervāls starp 5-Fu un L-OHP ievadīšanu bija vairāk nekā 5 stundas [17].
(2) Kaulu smadzeņu nomākšanas modeļa novērtēšanas rādītāji
Kaulu smadzeņu nomākšanas modeļa novērtēšanas rādītāji ietver samazinātu perifēro asins šūnu skaitu [18-22] vai perifēro asins šūnu skaitu kombinācijā ar kaulu smadzeņu kodola šūnām [9.23-25]. Šajā pētījumā tika izmantota otrā metode, lai novērtētu modelēšanas ietekmi.
2.2. Novērošanas rādītāji un materiāli
2.2.1. Peļu vispārējais stāvoklis
Eksperimenta laikā katru dienu tika novērota katras peļu grupas diēta, defekācija, aktivitāte, stāvoklis, garīgais stāvoklis un matu stāvoklis. Ja peles nomira, tās tika reģistrētas laikā.
2.2.2. Peļu svara izmaiņas katrā grupā
Nosveriet un pierakstiet katras peles svaru pirms dozēšanas modelēšanas dienā (d{0}}), un nosveriet un pierakstiet katras peles svaru katru otro dienu pēc modelēšanas.
2.2.3. Izmaiņas perifēro asins šūnu skaitā
Piestipriniet peli ar peles fiksatoru, atklājiet asti un iemērciet asti 45-50 grādu karstā ūdenī. Pēc astes žāvēšanas nogrieziet 1-2 mm astes gala. Ātri un maigi glāstiet asti no pamatnes līdz galam 2-3 reizes. Izmantojiet kapilāro asiņu savākšanas cauruli, lai savāktu 20 μL asiņu, atšķaidītu to sagatavotajā asins šūnu šķīdinātājā un aparātā veiktu asins šūnu analīzi. Savākt asinis katru dienu noteiktā laikā; visu asiņu savākšanu pabeidz viens cilvēks. Noteikšanas indikatori ietver: baltās asins šūnas, sarkanās asins šūnas, hemoglobīnu un trombocītus.
2.2.4. Izmaiņas kaulu smadzeņu kodolu šūnu skaitā
Vienu dienu pirms paraugu ņemšanas ar mikropipeti paņemiet 1000 μL PBS šķīduma un atšķaidiet to 2 ml EP mēģenē un uzglabājiet 4 grādu ledusskapī vēlākai lietošanai. d6 no katras grupas nejauši tika atlasītas 8 peles un nogalinātas ar dzemdes kakla dislokāciju. Zem sterila tīra sola tika izmantotas ķirurģiskas šķēres, lai nogrieztu kažokādu augšstilba kaula tuvumā, noņemtu labo augšstilbu un aptītu to ar medicīnisko marli, lai noņemtu atlikušos mīkstos audus. Izmantojiet 1 ml šļirces adatu (adata Nr. 4), lai ekstrahētu PBS šķīdumu EP mēģenē, urbiet vienā augšstilba kaula galā, lai izskalotu kaulu smadzenes EP mēģenē; atkārtoti skalojiet un vairākas reizes aspirējiet, lai izskalotu kaulu smadzeņu šūnas, līdz augšstilba kauls kļūst balts. Sagatavotā kaulu smadzeņu šūnu suspensija tika izlaista caur 200-tīkla neilona tīklu. Izmantojiet automātisko asins šūnu skaitītāju, lai noteiktu kaulu smadzeņu šūnas ar kodoliem. d13 atlikušās peles tika nogalinātas tādā pašā veidā un tika savākti paraugi.
2.2.5. Kaulu smadzeņu patoloģija HE krāsošana
d6, pēc tam, kad peles katrā grupā tika nogalinātas ar dzemdes kakla dislokāciju, tika izmantotas ķirurģiskas šķēres, lai zem sterila tīra sola nogrieztu kažokādu pie augšstilba kaula, noņemtu kreiso augšstilbu, izveidotu vaska blokus, šķēles un HE krāsošanu.
(1) Vaska bloku sagatavošanas un sadalīšanas soļi
① Paraugu ņemšana: nostipriniet salveti ar 4% paraformaldehīdu ilgāk par 24 stundām, iemērciet atkaļķošanas šķīdumā 24-48 stundas, saduriet salveti ar tapu, sagrieziet un apgrieziet salveti, kad tie ir mīkstināti, un ievietojiet to vaska blokā. kaste;
② Dehidratācija: audus secīgi ievieto 70% spirtā (2 stundas), 80% spirtā (1,5 stundas), 95% spirtā I (1,5 stundas), 95% spirtā II (1,5). stundas), 100% spirta I (0,5 stundas) un 100% spirta II (0,5 stundas), un dehidrē gradienta veidā.
③ Caurspīdīgums: audus secīgi 40 minūtes ievieto bezūdens etanola un ksilola šķīdumā (tilpuma attiecība 1:1), ksilolā I un ksilolā II.
④ Vaska iegremdēšana: audus secīgi 20 minūtes ievieto ksilola un parafīna (1:1), parafīna I un parafīna II maisījumā. Vaska iegremdēšana tiek veikta pastāvīgas temperatūras ierīcē 58 grādos, lai parafīns būtu izkusis.
⑤ Iegulšana: pēc audu bloka marķēšanas iepriekš sasildiet pinceti, injicējiet izkusušo parafīnu veidnē, pēc tam ievietojiet audu bloku un pagaidiet, līdz parafīns sacietē.
⑥ Sagriešana: pēc iegulšanas novietojiet audu vaska bloku uz griezēja, noregulējiet griezēja leņķi un sagrieziet audu bloku šķēlēs, kuru biezums ir 4-5 μm.
⑦ Līmēšana: izklājiet parafīna šķēles 42 grādu ūdenī, paņemiet šķēles ar priekšmetstikliņu un uzlīmējiet uz priekšmetstikliņa.
⑧ Cepšana: iestrēgušo priekšmetstikliņu ievieto nemainīgas temperatūras kastē apmēram 70 grādu temperatūrā un cep 1,5 h.
(2) HE krāsošanas soļi:
① Attīriet paraugu, mērcējot ksilolā I un II 15 minūtes.
② Mērcēt 100% spirtā I un II 5 minūtes.
③ Iemērciet 95%, 85% un 75% gradienta spirtā 3 minūtes un noskalojiet ar destilētu ūdeni.
④ Krāsojiet ar hematoksilīnu 1-3 min. un noskalojiet ar destilētu ūdeni.
⑤ Sālsskābes spirta diferenciācija 2-3 s, mazgā ar destilētu ūdeni.
⑥ Iegremdējiet amonjaka ūdenī, lai tas kļūtu zils, uz 1 minūti, nomazgājiet ar destilētu ūdeni.
⑦ Eozīna krāsošana 5 minūtes.
⑧ Iegremdējiet 75%, 85%, 95% gradienta spirtā uz 2 minūtēm.
⑨ Iegremdēt 100% spirtā I, IⅡ uz 3 min.
⑩ Iegremdējiet ksilolā I, Ⅱ uz 5 minūtēm.
⑪ Noblīvējiet ar neitrālu gumiju.
2.3. Statistikas metodes
SPSS26.0 tika izmantots, lai veiktu datu statistisko analīzi. Mērījumu dati tika izteikti kā vidējā ± standarta novirze (x±s). Pirmkārt, dati tika pārbaudīti attiecībā uz dispersijas normalitāti un viendabīgumu: Normāli sadalītiem datiem vairāku grupu salīdzināšanai tika izmantota vienvirziena ANOVA: ja dispersija bija vienāda, pāru salīdzināšanai tika izmantots LSD tests; ja dispersija nebija vienāda, pāru salīdzināšanai tika izmantots Tamhane t2 tests; ja tas neatbilda normālajam sadalījumam, tika izmantots neparametrisks tests. P<0.05 was considered statistically significant.
