Ⅱ daļa Smad3 deficīts uzlabo uz saliņām balstītu diabētu un diabētisku nieru bojājumu terapiju, veicinot šūnu proliferāciju, izmantojot E2F3-atkarīgo mehānismu
May 25, 2023
Metodes
1. Dzīvnieki
Smad{0}}null (Smad3KO) peles ir laipna dāvana no prof. Chuxia Deng un tiek uzturētas heterozigotās (Smad3 plus /- ) C57BL/6 fonā [20]. Smad3KO peles tika radītas, krustojot Smad3 plus /- peles. Db/db peles ar Lepr (leptīna receptoru) mutāciju C57BLKS fonā tika iegādātas no Honkongas Ķīnas universitātes (CUHK) Dzīvnieku eksperimentālā centra. Visi dzīvnieki tika turēti īpašā no patogēniem brīvā (SPF) telpā ar brīvu piekļuvi pārtikai un ūdenim dienas/nakts ciklā 12/12 h. Visas manipulācijas ar dzīvniekiem šajā pētījumā tika veiktas saskaņā ar CUHK dzīvnieku eksperimentu ētikas komitejas noteikumiem un to apstiprinājusi ar Ref. Nē. 18-177-MIS.
2. Streptozocīna (STZ) izraisītas diabētiskās peles modelis
C57BL/6 peļu tēviņiem 8-10 nedēļu vecumā intraperitoneāli injicēja STZ 50 mg/kg/dienā katru dienu 5 nepārtrauktas dienas. 5 dienas pēc pēdējās STZ injekcijas peles ar stabilu nejaušu glikozes līmeni asinīs, kas pārsniedz 16 mM 2 dienas pēc kārtas, tika uzskatītas par veiksmīgu diabēta diagnozi un tika izmantotas kā recipienta peles saliņu transplantācijai.
3. Saliņu izolēšana, transplantācija un diabētiskā fenotipa novērtēšana
Saliņas tika izolētas no Smad3 knockout (KO) vai savvaļas tipa (WT) peļu tēviņiem vai mātītēm 8-10 nedēļu vecumā, kā aprakstīts iepriekš [21]. Lai veiktu saliņu transplantāciju, tika norādīts, ka vairākas saliņas tika pārstādītas zem nieru kapsulas db/db peļu tēviņiem 4. nedēļas vecumā vai STZ izraisītām cukura diabēta pelēm 7. dienā pēc pēdējās STZ injekcijas, ievērojot Szot et al aprakstīto protokolu. 22]. Īsumā, saņēmēja pele tika anestēzēta ar Combo anestēziju (1,5 procenti ketamīna un 0,15 procenti ksilazīna, 6 μL/g ķermeņa svara). Pēc samaņas zaudēšanas uz kreiso nieri nosedzošajā ādā tika izdarīts 1 cm griezums. Viegli izvelciet nieri un operācijas laikā turiet to mitru ar sterilu fizioloģisko šķīdumu. Ar 25 G adatu uz kapsulas izveidojiet nelielu skrāpējumu, lai izveidotu spraugu. Norādītais saliņu skaits tika ievadīts nieru kapsulā ar PE50 caurulīti. Galu galā saliņas tika pārstādītas, aizzīmogojiet niku, kauterējot ar zemu siltumu. Nomainiet nieres un aizveriet vēderplēvi ar šuvēm. Nostipriniet ādu ar skavām. Lai novērstu infekciju, intraperitoneāli injicēja 100 μL penicilīna-streptomicīna šķīduma (Gibco, kat. Nr. 15140122, ASV). Lai mazinātu sāpes, intramuskulāri injicēja 100 μL Tegmic. Dzīvnieks tika novietots siltā vidē līdz pilnīgai atveseļošanai. Tāda pati operācijas procedūra tika veikta arī fiktīvas kontroles pelēm, bet bez saliņu infūzijas. Gan nejauši, gan 6 h tukšā dūšā (RBG un FBG) asins glikozes līmenis astes galā tika pārbaudīts katru nedēļu ar pārnēsājamu glikozes mērītāju (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Insulīna rezistences tests (IPITT), glikozes tolerances tests (IPGTT), HbA1c līmenis un seruma insulīns tika mērīti, kā aprakstīts iepriekš [9].
Noklikšķiniet šeit, lai iegūtuCistanche priekšrocības
4. Kopējais urīna proteīns un kreatinīna līmenis serumā
24 stundu urīns tika savākts vielmaiņas būrī. 24 stundu kopējais urīna proteīns tika aprēķināts, reizinot urīna tilpumu un urīna olbaltumvielu koncentrāciju, ko kvantitatīvi noteica ar Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, kat. Nr. 5000201, ASV). Seruma kreatinīna līmenis tika noteikts ar kreatinīna kvantitatīvās noteikšanas komplektu (Stanbio Laboratory, kat. Nr. 0430-120, ASV).
5. Histopatoloģija
Nieru histopatoloģiskās izmaiņas tika pārbaudītas paraformaldehīdā fiksētās, parafīnā iestrādātās sekcijās (4 µm) ar Periodiskās skābes-Šifa (PAS) reaģentu, kā aprakstīts iepriekš [23]. Mezangiālās matricas izplešanās tika novērtēta, izmantojot kvantitatīvo attēlu programmu (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics), kā aprakstīts iepriekš [23].
6. Imūnhistoķīmija
Saliņas saturošas nieres vai aizkuņģa dziedzeris tika fiksēts 4% paraformaldehīdā, iestrādāts parafīnā un sadalīts 4 μm. Pēc rehidratācijas sekcijas tika apstrādātas ar mikroviļņu mediētu antigēna izgūšanu 0.01 M citrātā (pH 6.0) 10 minūtes un bloķēšanu 5 procentos BSA 1 stundu. . Primārā antivielu inkubācija tika veikta nakti 4 grādu temperatūrā. Fluorescējošai krāsošanai istabas temperatūrā (RT) 1 stundu tika uzklāta fluorescējoša sekundārā antiviela. DAB mediētajai termoģenēzei pirms antigēna izguves tika iekļauts papildu solis ar 3 procentu H2O2 bloķēšanu 15 minūtes. Pēc primārās antivielu inkubācijas tika pievienots ar HRP konjugēts polimērs (Envision plus System, Dako, ASV). E2F3 iekrāsošanai tika veikta antigēna iegūšana EDTA-Tris šķīdumā (pH 9,0). Imūnhistoķīmijā izmantotās antivielas tika detalizēti aprakstītas S2 tabulā. Krāsošanas pozitīvā zona tika kvantitatīvi noteikta ar Image J programmatūru (v1.47, NIH, ASV).
Cistanche ekstrakts
7. Uzpotēto šūnu masas mērīšana saliņas nesošajā nierē
Lai daļēji kvantitatīvi noteiktu šūnu masu saliņu transplantātā, tika izmantots vidējā šūnu laukuma indekss uz sekciju. Īsumā, saliņas saturošās nieres (iegultas ar parafīnu) tika secīgi sadalītas 4 μm gar sagitālo asi. Nepārtrauktas sekcijas ar 160 μm intervālu tika fluorescējoši imūnkrāsotas insulīnam. Katras peles šūnu laukuma aprēķināšanai tika izmantotas vismaz 6 sekcijas ar insulīna pozitīvu krāsojumu. Insulīna pozitīvo šūnu laukums katrā sadaļā tika kvantificēts ar Image J programmatūru (v1.47, NIH, ASV). Vidējā šūnu laukuma indekss uz sekciju katrā pelē tika aprēķināts, dalot kopējo insulīna pozitīvo laukumu visās sekcijās ar insulīna pozitīvo sekciju skaitu.
8. Saliņu šūnu primārā kultūra
Izolētās saliņas tika sadalītas atsevišķās šūnās un iesētas 96-iedobes plāksnē 200 μL RPMI 1640 (Gibco, ASV) plus 10% FBS (Gibco, ASV) un 1% penicilīna-streptomicīna (Gibco, ASV) papildināts ar 20 mM glikozes. Saliņu šūnas tika kultivētas norādīto laiku inkubatorā, kas iestatīts uz 37 grādiem, 5 procentiem CO2 un 100 procentu mitruma. Lai ar adenovīrusu izraisītu E2F3 iznīcināšanu, disociētās saliņu šūnas tika kultivētas barotnē, kas satur adenovīrusu, kas pārmērīgi ekspresē īsu matadata RNS (shRNS), kas vērsta pret peles E2F3 (shE2F3) vai kontroles nespecifisku shRNS (parādīts) ar titru 10 pfu uz šūnu 2 dienas, kam seko vidēja nomaiņa. shE2F3 dupleksa cilmes secība bija 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Izkliedētās šūnas no 50 saliņām tika iesētas katrā iedobē imūnkrāsošanai un RT-PCR, un 100 saliņas katrā iedobē Western blot veikšanai, kas tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [9].
9. BrdU marķēšana in vivo un in vitro
Lai veiktu in vivo BrdU marķēšanu, pelēm intraperitoneāli injicēja 50 mg / kg dienā BrdU (PBS) 7 dienas no 2. dienas pēc saliņu transplantācijas un nogalināja 2 stundas pēc pēdējās injekcijas. In vitro BrdU marķēšanai izkliedētās saliņu šūnas tika kultivētas 48 stundas, pēc tam aizstātas ar svaigu barotni, kas satur 10 μM BrdU, un kultivētas vēl 24 stundas. Fluorescējoša imūnkrāsošana pret BrdU audos un kultivētajās šūnās tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [9].
Cistanche pulveris
10. RNS-Seq
Saliņas tika izolētas no Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m un Smad3KO-db/m pelēm. Katram genotipam RNS izolēšanai tika apvienotas saliņas no vairāk nekā 5 pelēm. RNS tika sagatavota ar miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Vācija). RNS-seq un pakārtotā datu analīze tika aprakstīta iepriekš [9]. Dotā gēna ekspresijas līmenis tika parādīts kā fragmenti uz vienu transkripta kilobāzi uz miljonu kartētu nolasījumu (FPKM). Diferenciāli ekspresēts gēns (DEG) tika definēts kā FPKM atšķirība starp divām grupām, kas ir lielāka vai vienāda ar 2 reizēm. Augšupieregulētie un pazeminātie DEG tika apvienoti un izmantoti gēnu ontoloģijas (GO) un Kioto enciklopēdijas gēnu un genomu (KEGG) ceļa bagātināšanas analīzei ar tiešsaistes DAVID bioinformātikas resursiem (v6.8) ar noklusējuma iestatījumiem. GO analīzei tika izmantota apakškategorija GOTERM_BP_DIRECT.
11. Imunoprecipitācija
Lai veiktu imunoprecipitāciju peles saliņās, aptuveni 500 svaigi izolētas saliņas tika lizētas 500 ml RIPA buferšķīduma. Tika pievienota truša anti-Smad3 antiviela (2 ug) vai truša IgG izotips un inkubēta 4 grādos nakti, viegli pagriežot. Pēc tam pievienoja 20 μL proteīna A agarozes lodītes (Beyotime, kat. Nr. P2051, Ķīna) un inkubēja 2 stundas 4 grādu temperatūrā. Pēc spēcīgas mazgāšanas ar svaigu RIPA buferšķīdumu saistītais proteīns tika atbrīvots, denaturējot 1xSDS ielādes buferšķīdumā, un tika pakļauts Western blot analīzei. Lai izvairītos no IgG smagās ķēdes ietekmes, nogulsnētā Smad3 proteīna atpazīšanai tika izmantots vieglajai ķēdei specifisks peles anti-trušu IgG (HRP konjugēts, Abmart, cat# M21006, Ķīna).
12. Hromatīna imunoprecipitācija-ChIP
Lai veiktu ChIP peles saliņās, no 8-10 nedēļas vecām C57BL/6 pelēm tika savāktas aptuveni 2000 saliņas un izmantotas kā viens ChIP preparāts. Svaigi izolētās saliņas tika stimulētas ar 10 ng/ml TGF- 1 (Gibco, ASV) 15 minūtes RPMI 1640 plus 1% FBS plus 1% penicilīna-streptomicīna. ChIP tika veikts ar SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, ASV), ievērojot ieteiktos norādījumus. ChIP testā izmantotās antivielas un primeri ir detalizēti aprakstīti S1 un S2 tabulā.
Standartizēta Cistanche
13. Duālās luciferāzes reportiera tests
Peles E2F3 promotors (no -1000 līdz plus 451 bp) tika klonēts pGL3- pamata vektorā (pGL3-E2F3.Pro). Vienlaikus tika veikta Smad3 saistīšanās vietas punktveida mutācija, lai ģenerētu pGL3- E2F3.Pro. Mut. Lai veiktu duālās luciferāzes reportiera testu, HEK293T šūnas tika iesētas 24-iedobes plāksnē ar blīvumu 5 x 104 šūnas/iedobē. Nākamajā dienā šūnas tika transficētas ar 500 ng pGL3-Basic vai pGL3-E2F3.pro vai pGL3-E2F3.pro.mut kombinācijā ar pcDNA3.1-Smad3, kas pārmērīgi ekspresē peles Smad3, vai ne (kā parādīts 10F attēlā) ar fosfāta kalcija metodi. PEGFP-C1 vektors tika papildināts, lai līdzsvarotu transfekcijas devu katrā ārstēšanā. Lai normalizētu transfekcijas efektivitāti, katrā ārstēšanā tika iekļauti 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vektora, kas ekspresē reniļas luciferāzi. 6 stundas pēc transfekcijas barotne tika nomainīta, kam sekoja inkubācija vēl 48 stundas. Šūnas tika lizētas, un luciferāzes aktivitāte tika noteikta ar Dual-Luciferase ® Reporter Assay System (Promega, ASV) un kvantitatīvi noteikta luminometrā (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, ASV). Klonētā E2F3 promotora transkripcijas aktivitāte tika parādīta kā ugunskura luciferāzes un renilla luciferāzes vērtību attiecība. Katra apstrāde tika veikta trīs eksemplāros.
14. Statistika
Dati tika parādīti kā vidējais ± SD un analizēti ar SPSS programmatūru (16.0). Datu normalitāte tika pārbaudīta ar One-Sample Kolmogorova-Smirnova testu. Grupu dispersiju viendabīgums tika pārbaudīts ar Levēna statistiku. Salīdzinājumam starp abām grupām tika izmantots Stjudenta t-tests. Salīdzinājumam starp vairākām grupām tika izmantota vienvirziena ANOVA ar LSD testu, ja tika pieņemta vienāda dispersija. Vienādai dispersijai, kas netika pieņemta, tika izmantota alternatīva Velča testa statistika, kam sekoja vairāki salīdzinājumi ar Tamhane T2 testu. P < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.
Cistanche piedevas
Secinājumi
Smad3 deficīts lielā mērā uzlabo saliņu aizstājterapiju gan T1DM, gan T2DM un aizsargā pret diabētisku nieru bojājumu. Uzlabota E2F3-atkarīgā šūnu proliferācija var būt galvenais Smad3KO saliņu terapijas mehānisms gan T1DM, gan T2DM gadījumā. Tādējādi Smad3KO šūnu aizstājterapija var būt labāka diabēta terapeitiskā stratēģija klīniski.
Atsauces
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klīniskā aizkuņģa dziedzera saliņu transplantācija. Nat Rev Endokrinols. 2017. gads; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Cilvēka pluripotentu cilmes šūnu diferenciācija uz funkcionālām aizkuņģa dziedzera šūnām diabēta terapijai: jauninājumi, izaicinājumi un nākotnes virzieni. J Biol Eng. 2017. gads; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S u.c. Histoloģiskais transplantāta novērtējums pēc klīniskās saliņu transplantācijas. Transplantācija. 2009. gads; 88: 1286-93.
4. Lan HY. TGF-beta / Smads dažādās lomas nieru fibrozē un iekaisumā. Int J Biol Sci. 2011. gads; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta / Smad signalizācija nieru fibrozes gadījumā. Priekšējā fiziol. 2015. gads; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K u.c. Smad signalizācijas tīkls regulē saliņu šūnu proliferāciju. Diabēts. 2014. gads; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. TGF-beta signalizācijas inhibīcija veicina cilvēka aizkuņģa dziedzera beta šūnu replikāciju. Diabēts. 2016. gads; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V u.c. Kombinētā DYRK1A, SMAD un Trithorax ceļu inhibīcija sinerģē, lai izraisītu spēcīgu replikāciju pieaugušo cilvēka beta šūnās. Šūnu Metab. 2019. gads; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH u.c. Smad3 deficīts veicina beta šūnu proliferāciju un darbību db / db pelēm, atjaunojot Pax6 ekspresiju. Teranostika. 2021. gads; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metode peles saliņu izolēšanai un subkapsulārai nieres transplantācijai. J Vis Exp. 2011. gads.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH u.c. Saliņu izotransplantāta transplantācija uzlabo jutību pret insulīnu 2. tipa diabēta peļu modelī. Endokrīnās sistēmas. 2021. gads; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. P16ink4a un p19ARF indukcija ar TGFbeta1 veicina augšanas apstāšanos un novecošanās reakciju peles keratinocītos. Mols karcinogs. 2009. gads; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Regulē proliferāciju tīklenes attīstības laikā. Nat Rev Neurosci. 2001. gads; 2: 333-42.
14. Dyson N. E2F regulēšana ar pRB ģimenes proteīniem. Genes Dev. 1998. gads; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J u.c. Pārejoša TGFbeta receptoru signālu nomākšana atvieglo cilvēka saliņu transplantāciju. Endokrinoloģija. 2016. gads; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. SMAD2 traucējumi peles aizkuņģa dziedzera beta šūnās izraisa saliņu hiperplāziju un insulīna sekrēcijas traucējumus ATP jutīgās K plus kanālu aktivitātes vājināšanās dēļ. Diabetoloģija. 2014. gads; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P u.c. E2F3 pārmērīga ekspresija veicina funkcionālo cilvēka beta šūnu proliferāciju bez apoptozes indukcijas. Šūnu cikls. 2013. gads; 12: 2691-702.
18. Džans Y, Aleksandrs PB, Vans XF. TGF-beta ģimenes signalizācija šūnu proliferācijas un izdzīvošanas kontrolē. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017. gads; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Cukura diabēts{3}}progresē un cilvēka beta šūnu proliferācijas problēmas. Nat Rev Endokrinols. 2015. gads; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H u.c. Mērķtiecīga SMAD3 pārtraukšana izraisa gļotādas imunitātes pavājināšanos un samazinātu T-šūnu reakciju uz TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokols saliņu izolēšanai no peles aizkuņģa dziedzera. Nat Protoc. 2009. gads; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Aizkuņģa dziedzera saliņu transplantācija diabēta peļu nieru kapsulā. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q u.c. Smad3 dzēšana novērš nieru fibrozi un iekaisumu 2. tipa diabētiskās nefropātijā. Vielmaiņa. 2020. gads; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 un Hui-Yao Lan2,7
1 Integrētās medicīnas pētniecības centrs un Nefroloģijas nodaļa, Dienvidrietumu medicīnas universitātes saistītā tradicionālās ķīniešu medicīnas slimnīca, Luzhou, Sichuan, 646000, Ķīna.
2. Medicīnas un terapijas nodaļa un Li Ka Shing Veselības zinātņu institūts, Honkongas Ķīnas Universitāte, Honkonga, 999077, Ķīna.
3. Guandunas-Honkongas apvienotā imunoloģisko un ģenētisko nieru slimību laboratorija, Guandunas provinces tautas slimnīca, Guandunas Medicīnas zinātņu akadēmija, Guandžou, Guanduna, 510080, Ķīna.
4. Valsts galvenā bioelektronikas laboratorija, Dzjansu galvenā biomateriālu un ierīču laboratorija, Bioloģijas zinātņu un medicīnas inženierijas skola, Dienvidaustrumu universitāte, Nanjinga, Ķīna.
5. Žandzjanas pilsētas hroniskas nieru slimības profilakses un pārvaldības galvenā laboratorija, Nefroloģijas institūts, Guandunas Medicīnas universitātes saistītā slimnīca, Džandzjana, Guanduna, 524001, Ķīna.
6. Nacionālā tradicionālās ķīniešu medicīnas klīnisko pētījumu bāze, Dienvidrietumu medicīnas universitātes saistītā tradicionālās ķīniešu medicīnas slimnīca, Luzhou, Sichuan, 646000, Ķīna.
7. CUHK-Guangdong provinces tautas slimnīcas Kopīgā imunoloģisko un ģenētisko nieru slimību pētniecības laboratorija, Honkongas Ķīnas Universitāte, Honkonga, 999077, Ķīna.
