1. daļa: Jauna pieeja endotēlija cilmes šūnu cirkulācijas reģenerācijas potenciāla uzlabošanai pacientiem ar beigu stadijas nieru slimību

Lai iegūtu vairāk informācijas. kontaktpersonatina.xiang@wecistanche.com

AbstraktsCirkulējošās no kaulu smadzenēm iegūtās endotēlija cilmes šūnas (EPC) atvieglo asinsvadu atjaunošanos vairākos orgānos, tostarp nierēs, bet beigu stadijā pakāpeniski samazinās.nieru slimība(ESKD) pacientiem, kas korelē ar kardiovaskulāriem rezultātiem un ar to saistīto mirstību. Tādējādi mēs noteicām, vai cilvēka kaulu smadzenēs iegūto mezenhimālo stromas šūnu (BM-MSC) audu reparatīvās iedarbības uzlabošana ar rekombinantā cilvēka relaksīna (RLX) vaskulogēno iedarbību varētu veicināt EPC proliferāciju un darbību. CD34 plus EPC tika izolēti no veselu un ESKD pacientu asinīm, kultivēti līdz vēlu EPC veidošanās brīdim, pēc tam stimulēti ar BM-MSC iegūto stāvokļa barotni (CM; 25 procenti o), RLX (1 vai 10 ng/ml) vai abiem. kombinētas ārstēšanas metodes. Lai gan tikai RLX stimulēja EPC proliferāciju, kapilāru caurulīšu veidošanos un brūču dzīšanu in vitro, šos pasākumus ātrāk un ievērojami uzlaboja no BM-MSC iegūta CM un RLX kombinētā iedarbība EPC, kas iegūti gan no veseliem, gan ESKD pacientiem. Šiem atklājumiem ir svarīga klīniska ietekme, jo ir identificēta jauna kombinētā terapija, kas var atjaunot un uzlabot EPC skaitu un funkcijas ESKD pacientiem.

Atslēgvārdi: endotēlija cilmes šūnas; nieru slimība beigu stadijā; no kaulu smadzenēm iegūtas mezenhimālās cilmes šūnas; relaksīns; brūču dziedēšana; angioģenēze; reģenerācija

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par pārdodamo cistanche

1. Ievads

Hroniska nieru slimība(CKD) ir globāla veselības problēma, kas definēta kā glomerulārās filtrācijas ātruma (GFR) samazināšanās, kas ir mazāka vai vienāda ar 60 ml/min/1,73 m², kas bieži noved pie beigu stadijas (V stadijas) nieru slimības (ESKD; definēts kā GFR mazāks vai vienāds ar 15 ml/min/1,73 m2)[2]. HNS patoloģiskās pazīmes ietver kanāliņu atrofiju, kas saistīta ar nieru kapilāru un podocītu samazināšanos, nieru endotēlija šūnu iznīcināšanu unnieru fibroze[3,4]. Šo procesu laikā tiek traucēts nieru endotēlijs, izraisot angioģenēzes un nieru darbības traucējumus [5]. Sekojošsnieru bojājumi, kaulu smadzenēs iegūtas endotēlija cilmes šūnas (EPC) tiek vervētas traumu vietās, lai atvieglotu audu atjaunošanos [6]. EPC ir galvenā loma nieru endotēlija šūnu nobriešanā un proliferācijā, asinsvadu integritātē un bojātā endotēlija atjaunošanā. Tomēr cirkulējošo EPC skaits ESKD pacientiem pakāpeniski samazinās [7-9], kas korelē ar nelabvēlīgiem kardiovaskulāriem iznākumiem [9,10] un ilgtermiņa mirstību.

Ir ziņots, ka mezenhimālās stromas šūnas (MSC) veicina angiogenēzi, stimulējot EPC programmēšanu. Tomēr, lai gan MSC ir novērtēti dažādos klīniskos pētījumos [13], to spēja veicināt nieru endotēlija atjaunošanos nav pētīta. Nesenie mūsu laboratorijas pētījumi ir atklājuši uzlaboto terapeitisko potenciālu, kombinējot no cilvēka kaulu smadzenēm (KM) iegūtas MSC ar antifibrotisku līdzekli, proti, rekombinanto cilvēka (gēna-2) relaksīnu (serelaksīnu; RLX[14) uzlabošanā. nieru bojājumi,iekaisumsun fibroze preklīniskajos slimības modeļos. Lai gan RLX viena pati var stimulēt no cilvēka asinīm iegūto EPC proliferāciju un slāpekļa oksīda (NO) veidošanos in vitro, kā arī vaskuloģenēzi pelēm in vivo[18], joprojām nav zināms, vai tā kombinētā iedarbība ar BM-MSC varētu paātrināt un/vai uzlabot EPC- atvasināta angioģenēze un brūču dzīšana. Tādējādi šajā pētījumā tika novērtēts terapeitiskais potenciāls, apvienojot RLX un BM-MSC atvasinātu kondicionētu barotni (CM) uz veseliem un ESKD pacientiem iegūtiem EPC proliferāciju, angioģenēzi un brūču dzīšanu in vitro.

2. Materiāli un metodes

2.1. EPC izolēšana un kultūra no perifērajām asinīm

Pēc parakstīta pacienta piekrišanas veidlapas saņemšanas no Austrālijas Sarkanā Krusta Asins dienesta tika savākti aptuveni {{0}} ml asiņu no veseliem vīriešu kontroles grupas. Turpretim tikai ~ 5 ml ESKD vīriešu vīriešu asiņu tika savākti no Monash medicīnas centra viņu veselības stāvokļa dēļ. Visi asins paraugi tika apstrādāti 24 stundu laikā pēc savākšanas laika. Visi asins paraugi tika atšķaidīti ar 1x Henka līdzsvarotu sāls šķīdumu (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, ASV) līdz kopējam tilpumam 20 ml. Pēc tam asinis rūpīgi iebēra 15 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Upsala, Zviedrija) 50 ml Falcon mēģenē (BD Biosciences, Sanhosē, Kalifornija, ASV) un centrifugēja ar ātrumu 400x. g 40 minūtes istabas temperatūrā, lai atdalītu buffy coat no citiem komponentiem, izmantojot blīvuma gradienta atdalīšanas metodi, kā aprakstīts iepriekš [19, 20]. Pēc gradienta atdalīšanas augšējais slānis, kas satur plazmu un trombocītus, tika noņemts, uzmanīgi ievietojot seroloģisko pipeti, atstājot neskartu perifēro asiņu (PBMC) mononukleārās šūnas, kas sastāv no endotēlija cilmes šūnām (EPC). Granulas tika atkārtoti suspendētas 2 ml endotēlija šūnu augšanas barotnes (EGM)-2 Microvascular (MV) Bullet Kit (produkts #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, ASV); papildināts ar 5% liellopu augļa serumu (FBS), 0,04% hidrokortizona, 0,4% cilvēka fibroblastu augšanas faktora (hFGF) un 0,1% asinsvadu endotēlija augšanas faktora (VEGF), R3-insulīnam līdzīgā augšanas faktora (IGF). )-1, askorbīnskābi, cilvēka epidermas augšanas faktoru (hEGF) un gentamicīna sulfātu/amfotericīnu (GA-1000), lai kultivētu izolētus EPC. Šūnas tika skaitītas, izmantojot CountessM automatizēto šūnu skaitītāju (Invitrogen, Carlsbad, CA, ASV), pirms tās tika iesētas uz fibronektīna pārklājuma kultūras plāksnēm/kolbām.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 šūnas/kolonija), izmantojot koloniju veidojošās vienības (CFU) testu.

2.2. Kondicionētas barotnes (CM) sagatavošana no kultivētas BM-MSC

Tā kā BM-MSC pievienošana EPC kultūrām apdraudētu ar EPC saistītos izmērāmos galapunktus, tika nolemts, ka labāk būtu analizēt no BM-MSC atvasinātās CM ietekmi uz EPC funkciju, kā tas tika izmantots iepriekš analīzei. citiem galapunktiem [19]. Īsumā, BM-MSC tika audzēti Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Austrālija), kas papildināta ar 16 procentiem liellopu augļa seruma (FBS) un 1 procentiem 200 mM. L-glutamīns un 1 procents penicilīna/streptomicīna. Kad šūnas sasniedza aptuveni 80 procentu saplūšanas, BM-MSC tika tālāk kultivētas un izklātas 12-iedobes plāksnē ar blīvumu ~0,5 × 10 grādi uz iedobi un turētas kultūrā 24-48 h. lai nodrošinātu šūnu piesaisti. Lai sagatavotu kondicionētu barotni (CM) no BM-MSC, šūnas īsi tika mazgātas trīs reizes ar iepriekš uzsildītu 1 ml 1 × HBSS. Pēc mazgāšanas soļiem 500 μL seruma un bez augšanas faktora endotēlija šūnu bazālās barotnes (EBM); Produkts #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, ASV) tika pievienots šūnām un tika turēts kultūrā 5% CO, 37 grādu temperatūrā vēl 24 stundas. Šī inkubācijas perioda beigās CM tika savākts un centrifugēts ar ātrumu 400 × g 10 minūtes, lai noņemtu visus šūnu atlikumus. CM 500 μL alikvotās daļās tika uzglabāta -80 grādos līdz turpmākai izmantošanai.

2.3. Funkcionālie testi

2.3.1. Kultivēto Late EPC ārstēšana

Kad vēlīnās EPC tika novāktas, tika veikti funkcionālie testi. Visi eksperimenti tika veikti fragmentos 3-6. Funkcionālās pārbaudes tika veiktas, lai izpētītu (i) 25 procenti no BM-MSC iegūtas kondicionētas barotnes (25 procenti CM)[20]; (ii) 1 [RLX-1] vai 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX (attēlo H2 relaksīna līmeni, kas konstatēts grūtniecēm [21]); vai(i) 25% CM un 1 vai 10 ng/ml RLX kombinētā iedarbība; (iv) 20% FBS tika izmantota kā pozitīva kontrole attiecībā uz proliferācijas un caurulītes veidošanās (angiogēno) potenciālu vēlīnās EPC, kas iegūtas no kontroles pacientiem. . Ārstēšanas grupas tika salīdzinātas ar neapstrādātām šūnām.

2.3.2. Dzīvotspējas un izplatīšanas tests

Vēlīnā EPC dzīvotspēja un proliferācijas potenciāls tika noteikts, izmantojot {{0}}(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolija bromīda (MTT) tests saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Austrālija). Īsumā, ~ 5 × 103 šūnas katrā iedobē tika iesētas 96- iedobju plāksnēs (BD Falcon, North Ryde, NSW, Austrālija), pēc tam šūnas tika apstrādātas ar BM-MSC atvasinātu CM, RLX (10 ng/ ml) vai CM un RLXat 1 vai 10 ng/ml kombinācija 24 stundas. Inkubācijas perioda beigās pievienoja 10 μL MTT marķēšanas reaģenta (0,5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Austrālija) un inkubēja 37 grādu Cand 5% CO2 temperatūrā vēl 4 stundas. Šūnas tika izšķīdinātas, pievienojot 100 μL šķīdināšanas šķīduma (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia), un vēlo EPC proliferācijas potenciāls tika noteikts, mērot katra parauga absorbciju pie 590 nm, izmantojot mikroplati. lasītājs (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Austrālija) un analizēts ar SoftMax Pro programmatūru operētājsistēmai Windows (versija 7.3, Molecular Devices LLC, CA, ASV). Katra no ārstēšanas grupām tika veikta un analizēta sešos atkārtojumos.

2.3.3. Caurules veidošanās tests

Dažādu ārstēšanas metožu ietekme, lai veicinātu vēlīnās EPC angiogēno potenciālu, izmantojot caurulītes veidošanās testu, tika noteikta, izmantojot μ-angioģenēzes testu (Abidi, Fitchburg, WI, USA). Īsumā, 10 μl augšanas faktora samazināta (GFR) Matrigel (produkts Nr. 356231, Corning, Tewksbury, MA, ASV) tika pievienoti angioģenēzes testa komplekta μ-slaida (Abidi, USA Fitchburg, WI, WI) iekšējā iedobē. ). Vēlīnās EPC saplūstošās kultūras tika iesētas uz pārklātajām šūnām un apstrādātas ar BM-MSC iegūto CM, RLX (10 ng / ml) vai CM un RLX kombināciju ar 10 ng / ml. Katrai iedobei tika uzklāts kopējais tilpums 50 μL šūnu suspensijas, kas satur ~ 1 × 104 šūnas. Attēli tika nekavējoties uzņemti un atzīmēti kā 0-stunda laika punkts. Šūnu spēja dažādu apstrādi ietekmē

tika novērotas formas caurules un attēli tika uzņemti 2-24 h pēc šūnu iesēšanas, izmantojot gaismas mikroskopu. Cauruļu skaits, caurules garums un atzarojuma punktu skaits tika noteikts, izmantojot ImageJ programmatūru.

2.3.4.Brūču dzīšanas tests

Dažādu ārstēšanas metožu ietekme uz vēlu EPC reģeneratīvo potenciālu tika noteikta, izmantojot brūču dzīšanas testu. Lai veiktu testu, ~ 1 × 10 šūnas tika suspendētas 50 μL augšanas barotnē un iesētas 2 iedobēs silikonā 35 mm traukā brūču dzīšanas testam (Abidi Inc., Fitchburg, WI, ASV). Mākslīgās brūces traukos tika izveidotas, uzmanīgi noņemot silikona iedobes ar sterilu pinceti (attālums starp =500±100 μm）). Trauki tika papildināti ar 2 ml 50 procentu EGM-2, pievienojot dažādas ārstēšanas metodes, tostarp BM-MSC atvasinātas CM, RLX (10 ng/ml) vai CM un RLX kombinācija ar 1 vai 10 ng/ml. Šūnu skaits, kas migrēja, lai aizvērtu brūci, tika novērtēts, izmantojot gaismas mikroskopiju. migrētās šūnas tika notvertas 0-24 h pēc apstrādes. Spraugas aizvēršanas laukuma procentuālā daļa tika noteikta, izmantojot Image] programmatūru.

2.3.5.Attēlu analīzes

Visas attēlu analīzes funkcionālajām pārbaudēm tika veiktas, izmantojot ImageJ operētājsistēmai MacOS (versija 1.8, Nacionālais veselības institūts, Bethesda, MD, ASV). Vēlīnās EPC caurules veidošanās potenciālam attēli tika analizēti, izmantojot angiogenēzes testa spraudni, un tika reģistrēti četri dažādi parametri, tostarp kopējais garums, acu skaits, savienojumu skaits un zaru skaits. Brūču dzīšanas testam brūces aizvēršanas zona tika analizēta, manuāli atzīmējot zonu bez šūnām katrā laika punktā. Visi mērījumi tika veikti vismaz 3 reizes, lai kontrolētu izmaiņas.

2.3.6. Imunofluorescence

Relaxin ģimenes peptīdu receptoru 1 (RXFP1; radniecīgo RLX receptoru) proteīna lokalizācija kultivētajos vēlīnās EPC tika noteikta, izmantojot imūnfluorescences krāsošanu. Pirmkārt, ~1 × 1{{20}} grādu šūnas, kas audzētas uz 13 mm stikla pārklājuma (pārklāts ar poli-D-lizīnu) 12-iedobes plāksnē, tika fiksētas 4% PFA. 15 minūtes istabas temperatūrā. Fiksētās šūnas tika bloķētas nespecifiskai olbaltumvielu saistīšanai, izmantojot 1 procentu liellopu seruma albumīna (BSA) 60 minūtes istabas temperatūrā. Inkubācijas perioda beigās šūnas tika mazgātas PBS 5 minūtes (3 reizes) un inkubētas ar truša poliklonālo RXFP1 antivielu (aa 609-624; A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Vācija ) 0,01 procentā BSA nakti 4 grādu temperatūrā. Šūnas tika mazgātas ar PBS un inkubētas ar kazu anti-trušu Alexa-fluor 594 sekundāro antivielu (1:500; Invitrogen, Scoresby, Viktorija, Austrālija) 0, 01% BSA 2 stundas istabas temperatūrā. Kodolkrāsošana tika veikta, pievienojot 40 μL DAPI Vectashield montāžas vidē (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ASV) un pārklājot. Imunoreaktīvais RXFP1 proteīns tika vizualizēts, izmantojot fluorescences mikroskopu ar palielinājumu × 40 (Olympus BX51), un attēli tika apvienoti, izmantojot ImageJ programmatūru.

2.4. Statistiskās analīzes

Visi dati ir parādīti kā vidējais ± SEM, un visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., Sandjego, CA, ASV). Tika izmantots veids-ANOVA, lai salīdzinātu dažādu ārstēšanas metožu ietekmi uz proliferāciju (MTT tests) un angiogēno (caurules veidošanās tests) potenciālu vēlīnās EPC, kam sekoja Tukey post-hoc tests, lai varētu veikt vairākus salīdzinājumus starp ārstēšanas grupām. Tika izmantots atkārtots divvirzienu ANOVA mērījums, lai salīdzinātu dažādu ārstēšanas metožu ietekmi uz brūču slēgšanu ar vēlīnām EPC laika gaitā, kam sekoja Tukey post-hoc tests, lai salīdzinātu katru no ārstēšanas grupām. P-vērtība, kas mazāka par 0,05, tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.