2. daļa: DHHC21 deficīts mazina nieru disfunkciju septiskas traumas laikā

Sazinātiestina.xiang@wecistanche.com

Diskusija

Šajā darbā mēs ziņojam par DHHC21 kā jaunu nieru perfūzijas un funkcijas regulatoru septisku traumu laikā. Mūsu jaunie atklājumi norāda: (1) Zdhhc21devde? pelēm ir labāka nieru darbība un mazāks nieru bojājums pēc septiskas traumas, salīdzinot ar WT pelēm;(2)DHHC21 funkcionālais deficīts saglabā nieru audu perfūziju, skābekļa piesātinājumu un RBF septisku bojājumu gadījumā;(3)DHHC21-katalizēta alAR palmitoilācija ir nepieciešams, lai aktivizētu alAR signalizācijas ceļu un alAR izraisītu nieru artēriju sašaurināšanos. Šis pētījums sniedz jaunu mehānisku ieskatu nieru perfūzijas un funkcijas regulēšanā septiska trauma laikā. Mēs iesakām, ka DHHC21 funkcionālais deficīts rada aizsargājošu efektunieru darbībaseptisku traumu gadījumā un ka DHHC21 inhibīcija var kalpot kā terapeitiska stratēģija cīņainieru darbības traucējumiseptiskas traumas laikā.

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu cistanche tubulosa ekstrakta priekšrocības

Nieru audu hipoperfūzija/hipoksija ir viens no galvenajiem nieru disfunkcijas cēloņiem septiskas traumas laikā3-5. Mēs atklājām nieru hipoperfūziju pelēm pēc CLP, par ko liecina novājināta kopējā hemoglobīna MSOT signāla intensitāte, samazināts skābekļa piesātinājums nieru audos un samazināts RBF pēc septiska trauma. Saskaņā ar mūsu konstatējumiem RBF samazināšanās ir novērota sepses pacientiem ar nieru traumu, kā arī lielu dzīvnieku modeļos ar septisku traumu7,10l1. Ir vērts atzīmēt, ka vairākos pētījumos ziņots, ka nieru disfunkcija var attīstīties sepses dzīvniekiem ar nemainīgām izmaiņām. vai pat palielināts RBF334. Šos pretrunīgos atklājumus var attiecināt uz dažādiem dzīvnieku modeļiem un metodēm, ko izmanto asins plūsmas mērīšanai. Piemēram, lai gan parasti ir izmantots CLP izraisīts polimikrobiāls septisks ievainojums, dažos pētījumos tiek izmantota Escherichia coli35 intravenoza injekcija.

Nesen tika ziņots, ka olbaltumvielu palmitoilēšana ir jauns proteīna funkcijas regulators, kas ir iesaistīts daudzu slimību patoģenēzē un progresēšanā. Pirmo reizi to kā jaunu pēctranslācijas modifikāciju identificēja Schmidt et al.3637. Kopš tā laika DHHC saimes atklāšana ir veicinājusi strauju šī lauka paplašināšanos38,39. Ir ziņots par palmitoilēšanas un PAT lomu daudzos fizioloģiskos un patoloģiskos apstākļos, tostarp lipīdu metabolismā,vēzis, sirds un asinsvadu slimības, un neiroloģiski traucējumi23,0,4. Lai gan jau iepriekš ziņots par palmitoilācijas iesaistīšanos policistisko nieru slimību un nieru vēzē23, ir bijuši ļoti ierobežoti pētījumi, kuros pētīta PAT funkcionālā loma.nieru slimības, īpaši nieru disfunkcijas gadījumā septiskas traumas laikā. Cik mums ir zināms, mēs esam pirmie, kas izpēta DHHC2l lomu nieru disfunkcijā septiskā ievainojumā. Mūsu atklājumi liecina, ka DHHC21 inhibīcija lielā mērā glābj nieru darbību un saglabā nieru struktūru septiskā ievainojumā.

Mūsu pētījums, izmantojot Zdhhc21dp/d4? peles pierāda, ka DHHC21 funkcionālā deficīta labvēlīgā ietekme uz nieru darbību ir saistīta ar tā spēju uzlabot nieru audu perfūziju septiska trauma laikā. Pamata apstākļos Zdhhc21ewaeP pelēm nav sāls/ūdens nelīdzsvarotības vai nieru strukturālo/funkcionālo bojājumu pazīmju5. Tomēr DHHC21 funkcijas zudums nomāc septisku traumu izraisītu RBF, nieru perfūzijas un nieru skābekļa piesātinājuma samazināšanos. Paaugstināta nieru asinsvadu pretestība, ko izraisa pārmērīga nieru vazokonstrikcija, tiek uzskatīta par galveno iemeslu nieru audu perfūzijas traucējumiem septisku bojājumu gadījumā6.9. Mūsu rezultāti liecina par alAR iesaistīšanos septisku traumu izraisītas nieru audu hipoperfūzijas starpniecībā, par ko liecina alAR palmitoilācijas palielināšanās un alAR signalizācijas ceļa aktivizēšana septiskā ievainojumā. Tomēr DHHC21 funkcionālais deficīts kavē alARpalmitoilāciju un samazina alAR spēju aktivizēt savu pakārtoto efektoru un mediēt fenilefrīna izraisītu vazokonstrikciju nieru artērijās.

"Joprojām ir pilnībā jānoskaidro molekulārais mehānisms, kas ir pamatā alAR funkcijas regulēšanai, izmantojot DHHC21. AlAR funkcijas defekts, ko izraisa DHHC21 funkcijas zudums, var būt saistīts ar alAR konformācijas izmaiņām. Daudzi GPCR paļaujas uz palmitoilāciju, lai to piemērotu. intracelulāra konformācija, pievienotais palmitāts GPCR C-gala astēs ievietojas plazmas membrānā, lai izveidotu ceturto intracelulāro cilpu, kas ir būtiska GPCR mijiedarbībai ar partneru proteīniem un GPCR signālu izplatībai17, 4. Iepriekšējais pētījums ir norādījis, ka Albar palmitoilēšana notiek arī tā C-gala reģionā44. Tāpēc DHHC21-mediētās lAR palmitoilācijas trūkums var mainīt alAR intracelulāro konformāciju, tādējādi bloķējot lAR signālu izplatīšanos. To var atbalstīt. ar mūsu rezultātiem, kas parāda, ka ERK aktivizēšana, kas ir pakārtots alAR aktivācijas signalizācijas notikums, tiek inhibēta Zdhhc21devider pelēm, kas pakļautas sept. ic trauma. Tomēr DHHC{11}}regulētā alAR karboksilgala topoloģija ir vēl vairāk jāapstiprina, izmantojot rentgenstaru kristalogrāfiju.

Vēl viens jauns mūsu pētījuma aspekts ir MSOT izmantošana, lai novērtētu nieru perfūziju un funkciju septiska trauma laikā. Ir ziņots, ka MSOT ir bez etiķetes metode dažādu orgānu perfūzijas mērīšanai un uzticama attēlveidošanas metode nieru darbības noteikšanai2832,45. Salīdzinājumā ar Doplera plūsmas mērītāju, kas neļauj vizualizēt mikrovaskulārus45, MSOT ģenerē attēlus ar augstu telpisko izšķirtspēju pie 150 um, vienlaikus nodrošinot kvantitatīvu perfūzijas stāvokļa novērtējumu nieru mikrovaskulārā aparātā. Ūdenī šķīstošais IRDye800CW ir drošs marķieris, ko izmantot nieru klīrensa mērīšanai, un tas neizraisa toksicitāti, ja deva ir 20 mg/kg. Mūsu novērotā IRDye800CW divu fāžu kustība atbilst iepriekš publicētajiem pētījumiem. Mūsu MSOT ieraksti liecina par lielāku Tmax aizkavi sepses nierēs, kas liecina par pavājinātu nieru klīrensu. Nefropātijas pētījums parāda, ka nieru darbības traucējumi, ko atklāja MSOT, būtiski korelē ar glomerulāro histoloģisku bojājumu30. Mūsu dati, kas atbilst iepriekšējām publikācijām, liecina, ka MSOT ir minimāli invazīva un uzticama metode nieru perfūzijas un funkcijas uzraudzībai.

Pašlaik nav pieejami DHHC{0}}specifiski inhibitori. Visbiežāk izmantotais PAT inhibitors ir 2-BP, kam ir plaša ietekme uz vairākiem DHHC, kā arī tas traucē taukskābju metabolismu47. Tādējādi daudzsološs virziens būtu tādu mazu molekulu inhibitoru izstrāde, kuru mērķis ir tieši DHHC21. Ir arī vērts norādīt, ka alAR nav vienīgais DHHC21 substrāts. Nesen ir identificēti vairāki citi DHHC21 substrāti, tostarp trombocītu endotēlija šūnu adhēzijas molekula (PFCA M-1), estrogēnu receptoru kaveolīns-1, endotēlija slāpekļa oksīda sintāze (eNOS), Fyn, superoksīda dismutāze (SOD{{). 8}}) un PLCB122, 41, 4s, 49, lai gan ārpus šī pētījuma darbības jomas mēs nevaram izslēgt iespēju, ka šie substrāti var ietekmēt arī nieru darbību septiska trauma laikā.

Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums pirmo reizi parāda, ka DHHC21 ir izšķiroša loma nieru perfūzijas regulēšanā septiska trauma laikā, izmantojot mehānismus, kas ietver alAR palmitoilāciju un alAR mediētu vazokonstrikciju. Turklāt DHHC21 inhibīcijai ir aizsargājoša iedarbība uz nieru darbību septiska ievainojuma laikā.

materiāli un metodes

Reaģenti. Visi reaģenti ir uzskaitīti S1 papildu tabulā.

Dzīvnieki. Zdhhc21depher peles un to savvaļas tipa kontroles peles (B6C3Fe) tika iegādātas no Džeksona laboratorijas. Zdhhc21dephe genotips? pelēm tika apstiprināta sekvencēšana (Genewiz, Inc., Ņūdžersija, ASV). Sekvenēšanai izmantotie praimeri bija: AGCTGACTGAAGGGCACC (uz priekšu) un AAAACCTGTAACGCATTTCCA (reverse)23. Dzīvnieki tika turēti 12/12-h gaismas/tumsas ciklā ar brīvu piekļuvi pārtikai un ūdenim. Šajā pētījumā tika izmantotas abu dzimumu peles (16-20 nedēļas). Visus eksperimentus ar dzīvniekiem ir apstiprinājusi Dienvidfloridas Universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja, un tie atbilst NIH laboratorijas kopšanas un lietošanas rokasgrāmatai.

Akls zarnas nosiešana un punkcija, peles tika anestēzētas ar izoflurānu (3% indukcija un 1% uzturēšana). Noskūtajā vēdera rajonā tika veikts viduslīnijas iegriezums, un cecum tika izgriezts ārpusē, cieši sasiets 5 mm zem ileocekālā vārsta un divreiz perforēts ar 20-mēra adatu distāli līdz nosiešanas punktam. No katra caurduršanas cauruma tika izspiests viens mm fekāliju. Pēc tam cecum tika mainīts, un vēders tika aizvērts divos slāņos. 37 C Lactated Ringer šķīdumu uzklāja lokāli, lai novērstu aklās zarnas izžūšanu. Pēc tam pelēm šķidruma atdzīvināšanai subkutāni ievadīja 37 grādu 0,9 procentu fizioloģisko šķīdumu. Pirmsoperācijas 0.5-1,5 mg/kg Buprenorphine Sustained-Release deva tika ievadīta pretsāpju mazināšanai. Fiktīvas peles tika pakļautas tai pašai ķirurģiskajai procedūrai, bet bez cecal nosiešanas un punkcijas50,51.

Multispektrālā optoakustiskā tomogrāfija. IRDye800CW izdalīšanās caur nierēm novērtējums. Peles tika anestēzijas ar izoflurānu un depilētas ap rumpja reģionu. Peles tika attēlotas, izmantojot Altera Medical MSOT attēlveidošanas sistēmu (Minhene, Vācija) ar vairākiem viļņu garumiem: 700,730,760,775,785, 800,850 nm ar ātrumu 10 kadri/s. Peles tika novietotas guļus stāvoklī turētājā un pārvietotas pa horizontālo lineāro stadiju, lai novietotu nieres uz fiksēti novietotā ieliektā devēja. Pēc sākotnējās reģistrēšanas 60 nmol RDve800CW, kas izšķīdināts 100 ul 0,9 procentu fizioloģiskā šķīduma, tika injicēts intravenozi 10 s laikā. Attēli tika rekonstruēti, izmantojot atpakaļprojekcijas formulu, un apstrādāti ar multispektrālo analīzi. Interesējošie reģioni (ROI) tika uzzīmēti ap nieru garozu un medulla/iegurņa reģionu, un tika attēlotas MSOT signāla laika izmaiņas ROI.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Nieru histopatoloģija. Nieres tika fiksētas, sagrieztas pa sagitālo plakni un apstrādātas parafīna iegulšanai. Sekcijas (5 μm) tika deparafinētas, rehidrētas un oksidētas ar periodskābi 8 minūtes istabas temperatūrā (RT), kam sekoja inkubācija ar Šifa šķīdumu 25 minūtes. Pēc tam sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu. Attēli tika uzņemti, izmantojot Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, ASV). Nieru strukturālie bojājumi tika novērtēti, pamatojoties uz šādām pazīmēm: glomerulārās anomālijas, proksimālā kanāliņu sukas robežas zudums, vakuolācija, kanāliņu epitēlija paplašināšanās, kanāliņu šūnu atslāņošanās/nekroze un neitrofilu infiltrācija. Katrs objekts tika novērtēts skalā 0-5, pamatojoties uz smaguma pakāpi.

Kreatinīna un urīnvielas slāpekļa līmeņa noteikšana asinīs. Peles asinis tika savāktas ar sirds punkciju 24 stundas pēc septiskas traumas. Plazma tika iegūta, centrifugējot asinis pie 2500 g 15 minūtes RT. Kreatinīna mērīšana: plazma tika deproteinizēta, izmantojot 10-kDa Spin Column; pēc tam kreatinīna līmenis filtrātā tika mērīts, izmantojot Creatinine Assay Kit. Urīnvielas slāpekļa (BUN) līmenis asinīs tika noteikts, izmantojot urīnvielas slāpekļa kolorimetriskās noteikšanas komplektu, ievērojot ražotāja norādījumus.

RBF un MAP mērīšana. Peles tika anestēzētas, izmantojot izoflurānu. Asinsspiediena devējs tika kanulēts miega artērijā. Vēdera zonā tika veikts viduslīnijas griezums, kam sekoja kreisais šķērsgriezums, lai atklātu nieru artēriju. RBF tika mērīts, izmantojot ultraskaņas tranzīta laika plūsmas mērītāju (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, ASV). Pēc plūsmas zondes novietošanas ap atklāto nieru artēriju pelēm ļāva stabilizēt vismaz 30 minūtes. RBF un MAP tika ierakstīti vienlaikus, izmantojot PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, ASV). Dati tika analizēti, izmantojot LabChart Pro 7. versiju4,55 programmatūru

Tveršana ar sveķu palīdzību. Nieru artērijas tika savāktas un lizētas līzes buferšķīdumā (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM palmostatīns B, proteāzes inhibitori, pH 7,4）22, 56. Audu lizātus inkubēja ar bloķējošo buferšķīdumu (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 procenti SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) 50 ° C temperatūrā 30 minūtes ar pastāvīgu virpuļošanu. Pēc izgulsnēšanas ar aukstu acetonu olbaltumvielas tika Granulēts, centrifugējot pie 5000 g 30 minūtes un mazgāts piecas reizes ar 70% aukstu acetonu. Olbaltumvielu granulas tika atkārtoti suspendētas saistīšanas buferšķīdumā (100 mM HEPES, 1,0 procenti SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4).Tika noteikta proteīna koncentrācija un normalizēta starp grupām. Katrs proteīna paraugs tika sadalīts divās vienādās daļās, katra saņēma vienādu daudzumu izopropilsefarozes 6B lodīšu, katrai daļai pievienoja attiecīgi hidroksvlamīnu (0,2 M, pH 7,4) un NaCl (0,2 M). Pēc 4 h inkubācijas istabas temperatūrā ar pastāvīgu rotāciju palmitoilētie proteīni tika eluēti ar 50 mM DTT 1 × parauga buferšķīdumā un savākti SDS-PAGE.

Western blotēšana. Palmitoilētā lAR mērīšana. No RAC savāktie paraugi tika ievietoti 4-20 procentiem Tris-Glycine gēlā un pēc elektroforēzes pārnesti uz nitrocelulozes membrānu. Pēc bloķēšanas 1 stundu RT, alAR tika pārbaudīts ar truša anti-lAR primāro antivielu (1:500) nakti 4 grādos. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar TBST, membrāna tika inkubēta ar IRDye800CW ēzeļa sekundāro anti-trušu antivielu (1:20, 000) 45 minūtes RT.

ERK fosforilācijas mērīšana. Nieru artērijas tika lizētas 1 × RIPA, kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. Membrāna tika pārbaudīta ar trušu anti-ERK(1:1000) un peles anti-fosforilētām ERK (1:1000) antivielām. Sekundārajai inkubācijai tika izmantotas IRDye800CW ēzeļu anti-peles un IRDye680RD ēzeļu anti-trušu antivielas (1:20 000). Membrānas tika attēlotas un analizētas, izmantojot Li-COR Odyssey CLx.

Vazoreaktivitātes novērtējums, izmantojot stieples miogrāfu. Peļu nieru artērijas. Nieru artērijas (diametrs {{0}} μm) tika izolētas no WTand Zdhhc21dp/de pelēm un iegremdētas ledus aukstā skābekļa (95% O,/5% CO) fizioloģiskā sāls šķīdumā (PSS,13{). {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glikozes, 0,026 mM EDTA un 1,6 mM CaCl, pH 7,4 (V). 2 mm gari) tika uzstādīti uz stieples miogrāfa kameras (Living Systems Instrumentation, VT, ASV) starp diviem volframa vadiem (30 um diametrā). Izometriskais spriegums tika reģistrēts, izmantojot Living Systems signāla kondicionētāju (MYO-SC-1), kas savienots ar LabScribe v4 iWorks programmatūru. Pēc 30 minūšu līdzsvarošanas 37 grādu Cin PSS temperatūrā tika veikta normalizācijas procedūra, lai noteiktu optimālo iekšējo apkārtmēru L,=0.9×L(Lo=iekšējais apkārtmērs, kas atbilst 100 mmHg transmurālajam spiedienam). . Pēc tam trauka dzīvotspēja tika pārbaudīta ar 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glikozes, 0,026 mM EDTA, 1,6 pHM). 7.4.) Artērijas, kas nereaģēja uz KPSS, tika izmestas. Artērijas tika apstrādātas ar pieaugošu fenilefrīna koncentrāciju (10 nM{55}} μM). Pēc tam endotēlija integritāte tika novērtēta, izmantojot acetilholīnu (10 μM). Tika izveidotas koncentrācijas-atbildes līknes.

Mazas artērijas no cilvēka nierēm. No neskartām dzīvotspējīgām cilvēka nierēm tika izdalītas mazas artērijas (diametrs ~ 1000 um), kuras tika noraidītas transplantācijas operācijai. Kuģa segmenti (~ 2 mm gari) tika uzstādīti uz stieples miogrāfa kameras I-stieņiem (250 um diametrā). Līdzīgas līdzsvarošanas un normalizācijas procedūras tika veiktas arī cilvēka artērijās. Pēc tam artērijas 1 stundu inkubēja ar nesēja kontroli (0, 02 procenti DMSO PSS). Pēc tam trauki tika pārbaudīti attiecībā uz dzīvotspēju ar 60 mM KPSS un apstrādāti ar pieaugošām fenilefrīna koncentrācijām (10 nM -30 uM). Pēc mazgāšanas trauki tika inkubēti ar 2-BP (100 uM) 1 stundu; asinsvadu dzīvotspēja pēc tam tika vēlreiz pārbaudīta ar 60 mM KPSS ar 100 uM 2-BP. Mazās artērijas, kurām nebija vai bija samazināta reakcija uz KPSS, tika izmestas. Pēc tam artērijas tika pakļautas tādas pašas koncentrācijas fenilefrīnam, kam sekoja acetilholīns (10 uM). Tika konstruētas un salīdzinātas koncentrācijas-atbildes līknes ar nesēja kontroles vai 2-BP apstrādātām artērijām.

Imunofluorescence. Cilvēka nieru artērijas tika fiksētas 10 procentu formalīnā 48 stundas, iestrādātas parafīnā un sadalītas. Pēc tam priekšmetstikliņi tika deparafinēti, rehidratēti un caurlaidīgi ar PBS, kas satur 0,05 procentus Triton X-1002. Pēc bloķēšanas priekšmetstikliņi tika marķēti ar trušu anti-DHHC21 un kazu anti-lAR antivielām (1:100) nakti 4 °C temperatūrā. Pēc mazgāšanas tika veikta sekundārā antivielu inkubācija ar ēzeļa anti-trušu Alexa Fluor 488 un ēzeļa anti-lAR antivielām Alexa. Fluor 568(1:500). Pēc montāžas ar ProLong Diamond montāžas vidi ar DAPI priekšmetstikliņi tika attēloti ar Leica SP8 spektrāli apgrieztu lāzerskenēšanas konfokālo mikroskopu.

Statistiskā analīze. Sīkāka informācija (piemēram, testa nosaukums, post-hoc tests, n vērtība, alfa līmenis, p vērtība) par katru statistisko testu ir norādīta S2 papildu tabulā. Visi dati atbilst normālā sadalījuma pieņēmumam. Normalitātes tests tika veikts, izmantojot Shapiro-Wilk testu ar alfa līmeni, kas iestatīts uz 0.05. Salīdzinājumi starp divām grupām tika analizēti, izmantojot Studenta t-testu (divu zaru), un trīs vai vairāk grupas tika salīdzinātas, izmantojot vienvirziena ANOVA ar Tukey post-hoc analīzi. Stiepļu miogrāfa līkņu salīdzinājums tika veikts, izmantojot divvirzienu ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">