Paraboea Martinii feniletanoīdu glikozīdi aizsargā žurku feohromocitomas (PC12) šūnas no ūdeņraža peroksīda izraisītiem šūnu bojājumiem
Mar 04, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid
Ir zināms, ka oksidatīvajam stresam ir būtiska loma vairāku slimību patoģenēzē. Tas ir saistīts ar Alcheimera slimības (AD), Parkinsona slimības (PD), epilepsijas un citu slimību etioloģiju [1–3]. Pašlaik ir panākts nepārtraukts progress AD, PD un citu slimību patoģenēzes izpētē. Tomēr, tā kā ir ierobežotas zināšanas par AD, PD un citu slimību pamatā esošajiem molekulārajiem mehānismiem, efektīvas šo slimību profilakses vai ārstniecības stratēģijas nav realizētas [4]. H2O2 ir svarīga reaktīvo skābekļa sugu (ROS) sastāvdaļa. Attiecīgi H2O2-inducēts PC12 šūnu bojājums ir visbiežāk izmantotais oksidatīvā stresa modelis, un to plaši izmanto eksperimentālos neiroprotektīvo efektu pētījumos [5]. Hēma oksigenāze 1 (HO-1) un glutamāta-cisteīna ligāzes katalītiskā apakšvienība (GCLC) ir svarīgi šūnu antioksidantu enzīmi, un abi gēni tiek regulēti lejpus kodolfaktora eritroīda 2 (Nrf2), kas kļūst par daudzsološu terapeitisku līdzekli. neiroprotekcijas mērķis [6,7]. Feniletanoīdu glikozīdi, kas iegūti no C-6-C-3 vienības, satur daudzas fenola hidroksilgrupas, un tiem ir nozīmīgas antioksidanta un pretnovecošanās aktivitātes. Pēdējo dažu gadu laikā pētījumi liecina, ka daudzi ārstniecības augi satur feniletanoīdu glikozīdus, kuriem ir ievērojama antioksidanta aktivitāte. Piemēram, feniletanoīdu glikozīdi, kas iegūti noHerba cistancheIr zināms, ka tie iedarbojas uz kognitīvo deficītu AD gadījumā. Šajā pētījumā tika pētīts saistītais aizsardzības mehānisms, izmantojot AD novecošanās paātrinātu peles 8 (SAMP8) modeli. Rezultāti liecināja, ka feniletanoīdu glikozīdu spēja uzlabot kognitīvos trūkumus SAMP8 pelēm varētu būt saistīta ar sinaptiskās plastiskuma veicināšanu, iesaistot antioksidantu procesus [8]. Šajā pētījumā divi feniletanoīdu glikozīdi tika atdalīti un attīrīti no Tectona grandis (tīkkoka) koka mezgliem; šiem savienojumiem bija ievērojama antioksidanta iedarbība, kas tika noteikta, izmantojot amperometrisko metodi [9]. Turklāt kofeoilfeniletanoīdu glikozīdu savienojumi no Lindernia ruellioides iedarbojas no devas atkarīgi no antioksidanta un superoksīda anjonu brīvo radikāļu attīrīšanas in vitro [10]. Feniletanoīdu glikozīdu darbības mehānismi ir saistīti ar Nrf2/ARE signalizācijas ceļa regulēšanu, kas ietekmē SOD, CAT, GSH-PX un citu antioksidantu enzīmu sintēzi [11]. Gesneriaceae dzimta, kurā ir 150 ģintis un aptuveni 3700 sugas, galvenokārt ir izplatīta tropiskajos un mērenajos reģionos Austrumāzijā un Dienvidāzijā, Okeānijā, Dienvidamerikā, Āfrikā, Dienvideiropā un Meksikā [12].
Gesneriaceae Ķīnā. Tika ziņots, ka aptuveni 100 sugām ir medicīniska iedarbība, un lielākā daļa no tām galvenokārt ir izplatītas Guangxi un Guizhou provincēs [13]. Pēdējos gados dažādās pasaules vietās pakāpeniski ir palielinājies Gesneriaceae augu izpēte, un ir atrastas dažas jaunas sastāvdaļas ar fizioloģisku aktivitāti [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt pieder pie Parabola (Gesneriaceae) un ir zālaugu augs. Pamatojoties uz "ķīniešu tradicionālās medicīnas resursu ierakstiem", tika reģistrēts, ka viss augs tiek izmantots kā zāles. Turklāt tas var veikt daudzas farmakoloģiskas darbības tādos apstākļos kā hematemēze, tūska, dizentērija, traumatisks ievainojums un lūzums [15]. Bai pierādīja, ka feniletanoīdu glikozīdi ir viena no galvenajām Gesneriaceae augu ķīmiskajām sastāvdaļām [16]. Daži pētnieki ir arī atklājuši, ka feniletanoīdu glikozīdiem ir ievērojama antioksidanta aktivitāte [17]. Li pierādīja, ka feniletanoīdu glikozīdi noCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 procenti ) no astoņiem fenilpropanoīda glikozīdiem tika mērīti ar HPLC pīķa laukuma normalizācijas metodi. Piemēram, parabozīda B un parabozīda II hromatogrāfijas diagrammas ir parādītas 1. attēlā, un tika konstatēts, ka to relatīvais saturs ir attiecīgi 98,23 procenti un 99,20 procenti. Slikti diferencētā žurku virsnieru feohromocitomas šūnu līnija (PC12) tika iegādāta no Ķīnas Zinātņu akadēmijas šūnu bankas (Šanhaja, Ķīna). Dulbecco modificētā Eagle barotne (DMEM) un zirga serums tika iegādāti no Gibco (Gaithersburg, MD, ASV). Liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāts no Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, ASV). H2O2 ieguva no Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tjaņdzjiņa, Ķīna). Trizol tika iegādāts no Invitrogen (Carlsbad, CA, ASV). PrimeScriptTM RT reaģentu komplekts (Perfect Real Time) tika iegūts no TaKaRa Biotechnology Co. (Daliana, Ķīna). Primerus HO-1, GCLC un GAPDH sintezēja uzņēmums Sangon Biotech (Šanhaja, Ķīna). CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay komplekts (MTS) tika iegūts no Promega Corp. (Madisona, ASV). HO-1 cinka protoporfirīna (ZnPP) inhibitori tika iegādāti no Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ASV). Tika izmantots arī Thermo311 CO2 inkubators (Thermo, ASV), StepOnePlusTM reāllaika PCR instrumenta termiskā riteņbraukšanas bloks (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) un xCELLigence RTCA DPlus Analyzer un E-Plate 16 (ACEA Biosciences, ASV). .
Cistanche deserticola
Šūnu kultūra un ārstēšana
PC12 šūnas tika audzētas DMEM, kas satur 5 procentus FBS un 5 procentus zirga seruma 37 grādu temperatūrā mitrinātā 5 procentu CO2 atmosfērā. PC12 šūnas tika sadalītas trīs grupās šādi: kontroles grupa, modeļa grupa un ārstēšanas grupa. Astoņi fenilpropanoīda glikozīdi tika izšķīdināti DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
H2O2 noteikšana
Mēs noteicām atbilstošu H2O2 koncentrāciju, izmantojot reāllaika šūnu analīzi (RTCA). PC12 šūnas tika iesētas CIM plāksnes -16 mikroplatē 100 µL tilpumā un pēc tam inkubētas 12 stundas 37 grādu temperatūrā 5 procentu CO2 atmosfērā. PC12 šūnas tika sadalītas kontroles un modeļa grupās. Pēc tam modeļu grupām tika pievienots 10 μL H2O2 (50, 100, 200 un 400 μM), un kontroles grupas tika apstrādātas ar 10 μL pilnīgu DMEM, kas uzstādīts trīs kompleksās iedobēs. E-Plate 16 tika ievietota xCELLigence RTCA, uzraudzīta ik pēc 15 minūtēm, un rezultāti tika reģistrēti 32 stundas. H2O2 ietekme uz PC12 šūnām tika analizēta, izmantojot xCELLigence RTCA datu analīzes programmatūru. Šūnu indeksa (CI) vērtība tika izmantota, lai noteiktu optimālo H2O2 koncentrāciju un darbības ilgumu.
Savienojumu ekstrakcija un izolēšana
Frakcijas tika atdalītas, pamatojoties uz to polaritāti, izmantojot iepriekš aprakstītās metodes. Gaisā kaltēts, pulverveida P. martini (4 kg) tika secīgi trīs reizes ekstrahēts ar 75% etanola ūdens šķīdumu [20]. Pēc tam iegūtie ekstrakti tika koncentrēti, izmantojot rotācijas iztvaicētāju, lai atdalītu etanolu, un tika iegūti neapstrādāti ekstrakti. Paraugi tika izšķīdināti dejonizētā ūdenī un pēc tam secīgi ekstrahēti ar petrolēteri, etilacetātu, n-butanolu un ūdeni. N-butanola ekstrakts (400 g) tika frakcionēts, izmantojot AB-8 makroporainu sveķu kolonnu un etanola-H2O2 šķīdumu (0, 1{{47}). }, 30, 50, 70 un 95 procenti). Visbeidzot tika iegūtas sešas frakcijas (frakcijas 1–6). 3. un 4. frakcija tika atdalīta, izmantojot MCI kolonnu ar pakāpenisku MeOH-H2O2 gradientu (10–100 procenti). Pēc tam produkti tika izolēti, izmantojot Sephadex LH-20 ar 50% MeOH kā eluentu. Savienojums 1 (41,0 mg) un 6 (15,6 mg) tika izolēts no 3. frakcijas. Savienojums 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) un 8 (26,0 mg) tika iegūts no 4. frakcijas, izmantojot Sephadex. LH-20 hromatogrāfija ar 50% MeOH kā eluentu. Galīgās izolācijas tika veiktas ar daļēji sagatavošanas, apgrieztās fāzes HPLC (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) ar 50% MeOH un UV noteikšanu pie 280 nm, lai iegūtu savienojumus 4. (39,0 mg) un 5 (9,0 mg) [20].
Šūnu dzīvotspējas tests
PC12 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2 × 1{{10}}4 šūnas/iedobē ar galīgo tilpumu 100 µL . PC12 šūnas tika inkubētas 37 grādu temperatūrā ar 5 procentiem CO2 12 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādu koncentrāciju neapstrādātiem ekstraktiem (0,025, 0,05, 0,1, 0,2 un 0,4 mg/mL) un savienojumiem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 un 8 piecās koncentrācijās (3,125, 6,25, 12,5, 25 un 50 μM). Pēc 24 stundu ilgas pirmapstrādes šūnu dzīvotspēja tika noteikta ar MTS testiem. PC12 šūnas tika iepriekš inkubētas ar HO-1 inhibitoru vai bez tā bez ZnPP (15 μM) 30 minūtes, pēc tam inkubētas ar kaleolariozīdu B, parabozīdu B un parabosīdu II (3,125 μM) vai bez tā 12 stundas un visbeidzot inkubētas. ar 400 μM H2O2 vēl 6 stundas. Pēc apstrādes izdzīvojušo šūnu skaits tika noteikts ar MTS testu [6].
Neapstrādātu ekstraktu un monomēru savienojumu aizsargājoša iedarbība uz H2O2-apstrādātām PC12 šūnām
Šūnas tika kultivētas {{0}}iedobes plāksnē ar galīgo tilpumu 100 µL. Apstrādātajai grupai tika pievienoti neapstrādātu ekstraktu sērijveida atšķaidījumi (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 un 0,4 mg/ml). Pēc 12 stundu ilgas pirmapstrādes apstrādātajai grupai un katras iedobes H2O2 grupai tika pievienots 400 μM H2O2 šķīduma (optimālā koncentrācija) 6 stundas. Pēc tam katrai iedobei pievienoja MTS šķīdumu, un plāksnes inkubēja 3 stundas 37 °C temperatūrā. Plāksnes 5 minūtes svārstīja ar mazu ātrumu istabas temperatūrā, līdz visi kristāli bija pilnībā izšķīduši. Šūnu aizsardzība tika noteikta, pamatojoties uz MTS testa rezultātiem saskaņā ar ražotāja 2204 X. GONG ET AL. Viesi 2022. gada 27. augustā lejupielādēja no vietnes https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 instrukcijas. Optiskais blīvums tika noteikts pie absorbcijas viļņa garuma 490 nm. Mēs tālāk izsekojām savienojumu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 un 8 aktivitāti, kas izolēti no 3. un 4. frakcijas. Savienojumu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 un 8 sērijveida atšķaidījumi (3,125, 6,25, 12,5, 25 un 50 μM) tika pievienoti apstrādātajai grupai, lai noteiktu to attiecīgo aizsargājošo iedarbību uz H2O{57}}inducētām PC12 šūnām.
Cistanche deserticola feniletanoīdu glikozīdi: aizsargā neironus un novērš novecošanos
Kvantitatīvā reāllaika PCR (qRT-PCR)
PC12 šūnas tika novāktas 12 stundas pēc apstrādes ar 3, 125 μM kaleolariozīdu B, parabosīdu B un parabosīdu II. Kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot TRIzol-reaģentu, un kopējās RNS alikvotas tika reversi transkribētas, izmantojot Primescript RT Master Kit saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Eksperimentos tika izmantoti šādi primeri saskaņā ar iepriekšējo ziņojumu [21]. HO-1: uz priekšu 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, atpakaļgaitā 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: uz priekšu 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, atpakaļgaitā 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: uz priekšu 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, atpakaļgaitā 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Pēc tam iegūto cDNS alikvotas tika pastiprinātas ar PCR. Reakcijas apstākļi bija šādi: sākotnējā denaturācija pie 95 grādiem (30 s), kam sekoja 40 cikli pie 95 grādiem (5 s), 60 grādiem (34 s) un 72 grādiem (35 s). Visi primeri tika pārbaudīti un tika atklāts FL fluorescējošais signāls; pēc tam tika aprēķināta △Ct vērtība un relatīvās vērtības salīdzinātas ar kontroles grupas vērtībām, izmantojot šādu vienādojumu: △Ct=Ct (paraugs) − Ct (endogēnā kontrole), △△Ct {{36} } △Ct (paraugs) −△Ct (neapstrādāts) un locījuma maiņa=2−△△Ct. Gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāze (GAPDH) tika izmantota kā iekšējā kontrole.
Olbaltumvielu ekstrakcija
PC12 šūnas tika iesētas 100- mm traukos ar 1 × 107 šūnām uz trauciņu. Pēc piestiprināšanas šūnas 12 stundas attiecīgi apstrādāja ar kaleolariozīdu B, parabozīdu B un parabosīdu II (3, 125 µM). Pēc tam glikozīdi tika noņemti, un šūnas vēl 6 stundas inkubēja ar H2O2. Pēc inkubācijas šūnas divas reizes nomazgāja ar aukstu PBS un nokasīja no traukiem ar 1 ml PBS. Šūnu homogenāti tika centrifugēti ar ātrumu 1500 apgr./min 10 minūtes. Pēc apstrādes šūnu proteīni tika ekstrahēti, izmantojot Beyotime RIPA šūnu līzes buferi ar 1 mM PMSF saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Turklāt citoplazmas un kodolproteīni tika izolēti, kā aprakstīts Beyotime kodolenerģijas un citoplazmas ekstrakcijas komplekta protokolā. Proteīnu koncentrācijas paraugos tika noteiktas, izmantojot Beyotime BCA proteīna testa komplektu, un visi paraugi tika uzglabāti –80 grādu temperatūrā Western blot analīzei [6].
Western blot analīze
SDS-PAGE elektroforēze tika veikta pēc ekstrakcijas un sekojošas kopējā proteīna denaturēšanas no dažādām grupām. Pēc elektroforēzes proteīns tika pārnests uz PVDF membrānām, kuras pēc tam 4 stundas tika bloķētas ar 5% vājpiena pulvera. Pēc mazgāšanas primārā antiviela (truša poliklonālā antiviela GAPDH (1:10, 000 atšķaidījums), truša poliklonālā antiviela HO-1 (atšķaidījums 1:1000) vai truša poliklonālā antiviela GCLC (atšķaidījums 1:1000) tika pievienota membrānām, kuras inkubēja pa nakti 4 grādos. Nākamajā dienā PVDF membrānas trīs reizes mazgāja TTBS. Pēc tam tika pievienota sekundārā antiviela (konjugēta afinitāte tīra kazas anti-trušu IgG (atšķaidījums 1:1000), kas marķēta ar mārrutku peroksidāzi pievienoja membrānām, kuras pēc tam inkubēja istabas temperatūrā 2 h.. PVDF membrānas nomazgāja un pakļāva ECL hemiluminiscences noteikšanas reaģentam, lai signalizētu par ekspozīciju rentgena filmā, kas pēc tam tika fiksēta un skenēta [22].
Statistiskā analīze
Dati tika analizēti, izmantojot SPSS 19.0, un rezultāti ir parādīti kā trīs neatkarīgu eksperimentu vidējās vērtības ar standarta novirzi (SD). Tika uzskatīts, ka vērtības p < 0,05="" norāda="" uz="" statistiski="" nozīmīgām="">
Rezultāti H2O2 modeļa izveide
Kā parādīts 2. attēlā, H2O2 pie 50, 100 un 200 μM neizraisīja atbilstošu šūnu nāves līmeni. Tomēr 400 μM H2O2 iedarbojās uz PC12 šūnām 2–6 stundu laikā, un šūnu oksidatīvie bojājumi bija stabili. Tāpēc mēs uzskatījām, ka indukcija ar H2O2 koncentrācijā 400 μM 6 stundas bija piemērota, lai atdarinātu oksidatīvā stresa izraisītus bojājumus PC12 šūnām.
Neapstrādātu ekstraktu aizsargājoša iedarbība uz PC12 šūnām, kas apstrādātas ar H2O2
Salīdzinot ar H2O2 modeļu grupā (3. attēls), n-butanola ekstrakts koncentrācijās 0.05, 0.1, {{10} },2 un 0,4 mg/mL ievērojami uzlaboja oksidatīvos bojājumus PC12 šūnām, ko izraisīja H2O2 (p < 0.05)="" atkarībā="" no="" koncentrācijas.="" šie="" dati="" liecināja,="" ka="" n-butanola="" frakcija="" satur="" spēcīgāku="" aizsargājošo="" aktivitāti.="" tomēr="" petrolētera="" un="" etilacetāta="" ekstraktiem="" bija="" aizsargājoša="" iedarbība="" tikai="" augstās="" koncentrācijās="" (petrolēteris:="" 0,1="" un="" 0,2="" mg/ml,="" p="">< 0).{31}="" }5;="" etilacetāts:="" 0,2="" un="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" turklāt="" dažādas="" ūdens="" fāzes="" ekstraktu="" koncentrācijas="" neuzrādīja="" aizsargājošu="" efektu="" (p=""> 0,05). Turklāt mēs esam pievienojuši datus no validācijas pētījuma, izmantojot SH-SY5Y cilvēka neiroblastomas šūnu līnijas (SH-SY5Y) papildu failā. Apstrāde ar 250 μM H2O2 izraisīja šūnu dzīvotspējas samazināšanos; tomēr ārstēšana ar kaleolariosīdu B, parabozīdu B un parabosīdu II (3,125, 6,25, 12,5, 25 un 50 μM) ievērojami mazināja SH-SY5Y šūnu nāvi. Eksperimenta rezultāti pierādīja, ka kaleolariozīds B, parabozīds B un parabosīds II aizsargā SHSY5Y šūnas no H2O{52}}inducētām šūnu bojājumiem.
No n-butanola frakcijas izdalīto savienojumu struktūras
Lai apstiprinātu, ka n-butanola ekstrakts satur aktīvās sastāvdaļas, mēs tālāk frakcionējām astoņus savienojumus no ekstrakcijas. Savienojumu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 un 8 struktūras tika identificētas ar dažādiem spektrālajiem datiem (1H-NMR, 13C-NMR un ESI-MS), pamatojoties uz salīdzinājumu ar publicētajiem datiem par parabozīdu A. , attiecīgi parabosīds B, parabosīds I, parabosīds II, parabosīds III, nuomiozīds A, kaleolariozīds B un izonuomiozīds A [20]. Piemēram, dati par parabosīdu B bija šādi: brūna gumija; ½ 20 D –55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr maks. cm-1: 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm-1 [20] 1H un 13C KMR spektroskopiski detalizēti dati parādīti 20. atsaucē; HR-ESI-MS (negatīvs) m/z 741,2231 [MH]− (aprēķināts C33H41O19, 741,2242) [20]. Dati par parabosīdu II bija šādi: balti amora pulveri; ½ 20 D –80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr maks. cm-1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm-1 [20]; 1H un 13C KMR spektroskopiski detalizēti dati parādīti 20. atsaucē; ESI-MS (negatīvs) m/z 637
Izolētu savienojumu aizsargājoša iedarbība pret H2O2-inducētu toksicitāti PC12 šūnās
MTS testi tika izmantoti, lai izpētītu izolētu savienojumu ietekmi uz PC12 šūnu dzīvotspēju, kas pakļautas H2O2-inducētai toksicitātei. Kā parādīts 5. attēlā, salīdzinot ar kontroles grupu, PC12 šūnas tika iepriekš apstrādātas ar piecām dažādām kaleolariozīda B, parabozīda B, parabozīda II vai parabozīda A koncentrācijām (3,125, 6,25, 12,5, 25 un 5)0 μM) 24 stundas neuzrādīja būtiskas atšķirības šūnu dzīvotspējā (p > 0,05). Tādējādi PC12 šūnu pirmapstrāde ar kaleolariozīdu B, parabozīdu B un parabosīdu II neizraisīja citotoksicitāti. Kā parādīts 6. attēlā, 400 µM H2O2 ievērojami samazināja šūnu dzīvotspēju salīdzinājumā ar kontroles grupu. Turklāt ar H2O2- apstrādāto PC12 šūnu dzīvotspēja ievērojami palielinājās pēc PC12 šūnu pirmapstrādes ar dažādām kaleolariozīda B, parabozīda B un parabozīda II koncentrācijām; turklāt šūnu dzīvotspēja bija visaugstākā pēc apstrādes ar 50 µM kaleolariozīda B, 50 µM parabozīda B un 12,5 µM parabozīda II. Pārējie pieci savienojumi neuzrādīja būtisku aizsargājošu iedarbību uz H2O{30}}apstrādātām PC12 šūnām. Lai ilustrētu šo atradumu, mēs apspriežam vienu no tiem kā piemēru, bet pārējie manuskriptā nav aprakstīti.
HO-1 un GCLC transkripcijas līmeņi
Pēc tam mēs pārbaudījām HO{{0}} un GCLC transkripcijas līmeni PC12 šūnās, kas apstrādātas ar kaleolariozīdu B, parabosīdu B un parabosīdu II. Kopējā mRNS tika savākta no apstrādātām un neapstrādātām PC12 šūnām 12 stundas un pēc tam tika pakļauta ekspresijas analīzei ar qRT-PCR. Kā parādīts 7. (a, c, e) attēlā, HO-1 transkripcijas līmenis ievērojami palielinājās pēc tam, kad PC12 šūnas tika iepriekš apstrādātas ar norādītajām kaleolariozīda B, parabozīda B un parabozīda II koncentrācijām 12 stundas (p < 0.05).="" kā="" parādīts="" 7.="" (b)="" attēlā,="" gclc="" transkripcijas="" līmeņi="" ievērojami="" palielinājās="" arī="" pc12="" šūnās,="" kas="" iepriekš="" apstrādātas="" ar="" norādīto="" kaleolariozīda="" b="" koncentrāciju="" 12="" stundas.="" tomēr="" gclc="" līmenis="" pc12="" šūnās,="" kas="" 12="" stundas="" iepriekš="" apstrādātas="" ar="" parabozīdu="" b,="" ievērojami="" samazinājās,="" salīdzinot="" ar="" modeļu="" grupā="" (p="">< 0,05;="" 7. attēls="" (d)).="" turklāt,="" apstrādājot="" ar="" parabozīdu="" ii,="" gclc="" līmeņi="" pc12="" šūnās="" būtiski="" neatšķīrās="" no="" modeļa="" grupas="" (p=""> 0,05; 7. (f) attēls).
HO-1 un GCLC izteiksme
HO{{0}} un GCLC ir svarīgi šūnu antioksidantu enzīmi, un abi ir Nrf2-regulēti pakārtotie gēni. Pēc apstrādes tika novērota arī HO-1 un GCLC olbaltumvielu ekspresija [6]. 8. attēlā parādīts HO-1 un GCLC proteīna līmenis PC12 šūnās pēc apstrādes ar 400 μM H2O2; rezultāti liecināja, ka HO-1 FL fluorescējošās intensitātes kaleolariozīda B un parabozīda B grupās bija lielākas nekā H2O2- apstrādātajās grupās (8. attēls (a, c)). Tomēr savienojumi būtiski nemainīja GCLC ekspresiju, izņemot kaleolariozīdu B (8. b) attēls. Pēc tam tika izmantoti HO-1 ķīmiskie inhibitori, lai tālāk novērtētu antioksidantu enzīmu lomu kaleolariozīda B, parabozīda B vai parabozīda II aizsargājošās iedarbības regulēšanā pret H2O2-inducēto citotoksicitāti. Kaleolariozīds B, parabozīds B un parabozīds II (3,125 µM) novērsa H2O2-inducēto citotoksicitāti, taču šādu aizsargājošo iedarbību mainīja HO-1 inhibitors ZnPP (p < 0,01)="" pie="" 15="" µm="" (8.="" attēls).="">
Cistanche ieguvums: Palieliniet vīriešu reprodukciju
Diskusija
Iedzīvotāju novecošana ir nopietna globāla problēma. Daudzas slimības ir saistītas ar senilitāti, piemēram, AD un PD, kas nopietni apdraud sabiedrības veselību. AD un PD ir kļuvušas par trešām nāvējošākajām slimībām pasaulē pēc sirds un asinsvadu slimībām un vēža. Tāpēc neirodeģenerācija ir kļuvusi par steidzamu pētniecības tēmu visā pasaulē. Tomēr AD un PD, centrālās nervu sistēmas neirodeģeneratīvo slimību, patoģenēze līdz šim ir palikusi neskaidra. Turklāt ir tikai dažas zāles, kas var efektīvi ārstēt AD vai PD to sarežģīto patogēno mehānismu dēļ [23]. Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka ROS, piemēram, superoksīda anjons (O2−) un H2O2, ir galvenie faktori, kas veicina neirodeģeneratīvas slimības. Patoloģiskās izmaiņas PD laikā ietver neironu deģenerāciju un substantia nigra un striatālā dopamīna nāvi [24, 25]. Attiecīgi ir svarīgi izstrādāt efektīvas antioksidantu zāles PD ārstēšanai, un šāda zāļu atklāšana ir kļuvusi par nozīmīgu pētniecības virzienu [26]. Pašlaik Nrf2 / ARE signalizācijas ceļš, šķiet, ir vissvarīgākais endogēnā antioksidanta stresa ceļš [27]. Ares atrodas gēnu 5′-izpildījuma ranga reģionos, piemēram, HO-1 un GCLC [28,29]. HO-1 un GCLC ir Nrf2-saistīti gēni, kas tiek regulēti lejpus šī proteīna [6]. Pēc tam ARE var ietekmēt antioksidantu līmeni un aktivizēt HO-1 un citu aizsargājošo gēnu pakārtoto ekspresiju, kas varētu uzlabot šūnu aizsardzības aktivitātes [30,31]. Turklāt atklājumi liecināja, ka resveratrola aizsargājošā iedarbība pret A {{2{{50}}}} izraisītu toksicitāti PC12 šūnās rodas, palielinot HO-1 ekspresiju, aktivizējot Nrf2 intracelulāro šūnu. signalizācijas ceļš [32]. PC12 šūnas ir pieņemts neironu šūnu modelis un tiek plaši izmantotas neiroprotektīvas iedarbības pētījumos [33]. H2O2 var viegli iziet cauri šūnu membrānai un apvienoties ar dzelzi, veidojot ļoti aktīvus brīvos radikāļus, kas izraisa oksidatīvo stresu un šūnu bojājumus [34]. H2O2 ir svarīgs ROS, un brīvie radikāļi ir viegli ģenerējami un relatīvi stabili, tāpēc tos parasti izmanto, lai izveidotu oksidatīvā stresa modeli, izmantojot PC12 šūnas [5]. Šajā pētījumā PC12 šūnu pirmapstrāde ar netoksisku augu ekstrakta koncentrāciju aizsargāja šūnas no H2O2-izraisīta citotoksicitāte, samazinot ROS veidošanos. Feniletanoīdu glikozīdi satur daudzas fenola hidroksilgrupas, kurām ir antioksidanta un pretnovecošanās iedarbība. Šajā pētījumā mēs atklājām, ka n-butanola ekstrakcija nodrošina labāku aizsardzību nekā citas polaritātes frakcijas (3. attēls). Tādējādi mēs tālāk pārbaudījām astoņu savienojumu, kas izolēti no n-butanola frakcijas, aizsargājošās aktivitātes. Rezultāti pirmo reizi parādīja, ka 8. attēls. HO-1 un GCLC proteīna līmeņu analīze PC12 šūnās. (a) Kā ielādes kontrole tika izmantota HO-1 un GCLC un GAPDH ekspresijas Western blot analīze. (b) Western blot analīzes GCLC proteīna ekspresija. (c) Western blot analīzes HO-1 proteīna ekspresija. (d) HO-1 inhibitors ZnPP samazināja neiroprotektīvo efektu. Dati tiek parādīti kā vidējie ± SD, n=3. ***p < 0.001="" pret="" kontroles="" grupu;="" #p="">< 0,05="" pret="" h2o2="" grupu="" (bez="" znpp="" apstrādātas),="" ##p="">< 0,01="" pret="" h2o2="" grupu="" (bez="" znpp="" apstrādātas),="" ###p="">< 0,001="" pret="" h2o2="" grupu="" (bez="" znpp="" apstrādātas);="" un="" p="">< 0,01,="" salīdzinot="" ar="" h2o2="" grupu="" (ar="" znpp="" apstrādātu),="" un="" &p="">< 0,001,="" salīdzinot="" ar="" h2o2="" grupu="" (ar="" znpp="" apstrādātu).="" (kontroles="" grupa;="" modeļu="" grupa:="" h2o2;="" znpp="" negatīvā="" grupa:="" kaleolariozīds="" b="" plus="" h2o2,="" parabozīds="" b="" plus="" h2o2,="" parabozīds="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp="" pozitīvā="" grupa:="" znpp="" plus="" kaleolariozīds="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozīds="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozīds="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" viesi="" 2020. gada="" 27. augustā="" lejupielādēja="" no="" vietnes="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145.="" kaleolariozīdam="" b,="" parabosīdam="" b="" un="" parabosīdam="" ii="" ir="" nozīmīga="" aizsargājoša="" iedarbība="" pret="" h2o{92}}="" izraisītu="" oksidatīvo="" vielu.="" bojājumi="" pc12="" šūnās.="" rezultāti="" arī="" norādīja,="" ka="" ārstēšana="" ar="" h2o2="" izraisīja="" ievērojamu="" pc12="" šūnu="" bojājumu="" un="" samazināja="" šūnu="" dzīvotspēju,="" savukārt="" ārstēšana="" ar="" kaleolariozīdu="" b,="" parabozīdu="" b="" un="" parabozīdu="" ii="" ievērojami="" mazināja="" šīs="" sekas="" (6.="" attēls).="" iepriekšējā="" pētījumā="" ziņots,="" ka="" nrf2/are="" ceļš="" ir="" viens="" no="" svarīgākajiem="" endogēno="" antioksidantu="" ceļiem="" un="" var="" paaugstināt="" pakārtoto="" marķieru,="" piemēram,="" ho-1,="" ekspresiju,="" lai="" aizsargātu="" šūnas="" [7].="" qrt-pcr="" un="" western="" blot="" analīžu="" rezultāti="" parādīja,="" ka="" kaleolariozīds="" b,="" parabosīds="" b="" un="" parabosīds="" ii="" būtiski="" paaugstināja="" ho-1="" līmeni.="" tomēr="" gclc="" transkripcijas="" līmenis="" ievērojami="" palielinājās="" pc12="" šūnās,="" kas="" iepriekš="" apstrādātas="" ar="" kaleolariozīdu="" b,="" bet="" samazinājās="" tām,="" kas="" iepriekš="" apstrādātas="" ar="" parabozīdu="" b,="" salīdzinot="" ar="" modeļu="" grupā="" esošajām="" šūnām.="" turklāt="" parabosīds="" ii="" nemainīja="" šī="" marķiera="" izteiksmi,="" salīdzinot="" ar="" modeļu="" grupā="" (7.="" un="" 8.="" (a–c)="" attēls).="" turklāt="" ho-1="" inhibitors="" znpp="" apvērsa="" kaleolariozīda="" b,="" parabozīda="" b="" un="" parabozīda="" ii="" aizsargājošo="" iedarbību="" pret="" h2o2-inducētu="" pc12="" šūnu="" bojājumu="" (8. attēls="" (d).="" noslēgumā="" jāsaka,="" ka="" feniletanoīdu="" glikozīdi="" kaleolariosīds="" b,="" parabozīds="" b="" un="" parabozīds="" ii="" efektīvi="" aizsargāja="" pc12="" šūnas="" no="" h2o2-inducētiem="" oksidatīviem="" bojājumiem.="" attiecīgi="" šie="" savienojumi,="" kas="" izolēti="" no="" p.="" martini,="" varētu="" būt="" potenciālie="" zāļu="" kandidāti="" neirodeģeneratīvo="" slimību="">
Cistanche priekšrocības:neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanā
Atsauces
[1] Baterfīlda DA. Oksidatīvā stresa perspektīvas Alcheimera slimībā un nākotnes pētījumu uzsvaru prognozes. J Alcheimera Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D u.c. Oksidatīvais stress un amiloid-beta peptīds Alcheimera slimībā. Redox Biol. 2018; 14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y u.c. Dopamīnerģisko neironu bojājumi oksidatīvā stresa dēļ Parkinsona slimības gadījumā (pārskats). Int J Mol Med. 2018; 41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH u.c. Rs823128, rs1572931 un rs823156 polimorfismu asociācija ar samazinātu Parkinsona slimības risku. Neiroreports. 2017; 27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX u.c. 7,8-dihidroksiflavona antioksidanta darbība aizsargā PC12 šūnas pret 6-hidroksidopamīna izraisītu citotoksicitāti. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F u.c. Četru feniletanoīdu glikozīdu neiroprotektīvā iedarbība uz H2O2- izraisītu apoptozi uz PC12 šūnām, izmantojot Nrf2/ARE ceļu. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E u.c. Nrf2-ARE ceļš: jauns mērķis pret oksidatīvo stresu un neirodeģeneratīvām slimībām. Farmakoloģiskā terapija. 2016; 157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP u.c. Feniletanoīdu glikozīdu iedarbība, kas iegūta noHerba cistanche, par kognitīvo deficītu un antioksidantu aktivitātēm SAMP8 peļu tēviņiem. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE u.c. Feniletanoīdu glikozīdi no tīkkoka mezgliem un to antioksidanta aktivitāte. J Biol Active Prod Nat. 2016; 6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ u.c. Kofeoilfeniletanoīdu glikozīdu savienojumu antioksidanta aktivitāte no Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017; 15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L u.c. Nrf2-ARE ceļa loma oksidatīvā stresa ievainojumos un tā saistība ar citiem signalizācijas ceļiem. Dzīvnieku audzēšanas barība Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS u.c. Sasniegumi Gesneriaceae izpētē. Chin J Jaunas zāles. 2003; 12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Pētījumi par Gesneriaceae augu. Chin savvaļas augu resurss. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM u.c. Gesneriaceae augu triterpenoīdu izpētes gaita. Nat Prod Res Dev. 2012; 24:698–701.
[15] Ķīnas augu izcelsmes zāļu uzņēmums. Ķīniešu tradicionālās medicīnas resursu ieraksti. Ķīna: Science Press; 1994. gads.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG u.c. Feniletanoīdu glikozīdu izplatība Gesneriaceae ārstniecības augos. Chin J Chin Mater Med. 2013; 38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX u.c. Brandisia hancei feniletanoīdu glikozīdu antioksidanta aktivitāte. J Etnofarmakols. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG u.c. Pētījums par antioksidantu darbībufeniletanoīdu glikozīdi no Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y u.c. Aizsargājoša iedarbībacistanche glikozīdipar PC12 šūnu bojājumiem PARABOLA MARTINI PROTECT PC12 CELLS NO H2O2-IZRAISĪTA TRAUMA 2211
