Feniletanoīdu glikozīdi izraisa apoptozi Eca-109 šūnās, izmantojot no mitohondrijiem atkarīgo ceļu

Ievads

Barības vada vēzis ir viens no visizplatītākajiem vēža veidiem ar 11. augstāko saslimstības līmeni un 6. vietu augstāko mirstības līmeni pasaulē, un 2015. gadā tas izraisīja aptuveni 439,000 mirstības gadījumus. Barības vada vēža sastopamība dažādos reģionos ievērojami atšķiras, un austrumu daļā Āzijā un Austrumāfrikā un Dienvidāfrikā, kur 2012. gadā bija visaugstākais saslimstības līmenis, un Rietumāfrikā ar viszemāko saslimstības līmeni. Ķīnā aptuvenie barības vada vēža gadījumi un mirstība bija attiecīgi 477,000 un 375,000. , 2015. Lai gan saslimstības līmenis ar barības vada vēzi ir samazinājies vidēja un augsta vidēja sociāldemogrāfiskā indeksa valstīs laikā no 2005. līdz 2015. gadam, mirstības līmenis joprojām ir augsts sliktās prognozes dēļ. Ķirurģiskās rezekcijas kombinācija ar ķīmijterapiju vai staru terapiju ir izmantota barības vada vēža ārstēšanai, tomēr ir ziņots, ka no 2003. līdz 2014. gadam 5-gadu izdzīvošanas rādītājs saglabājās.<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyto pierādījaCistanche tubulosa feniletanoīdu glikozīdi(CTPG) varētu nomākt melanomas B16-F10 šūnu augšanu in vitro un in vivo (24). Tomēr iepriekš izmantotā CTPG sliktā šķīdība ūdenī ierobežo zāļu izstrādi. Tāpēc tika izmantots ūdenī šķīstošs CTPG (CTPG-W) un pētīta pretvēža iedarbība uz barības vada vēža šūnām (Eca-109). Tika noteikts, ka CTPG-W var no devas atkarīgi inhibēt Eca-109 šūnu dzīvotspēju, inducējot apoptozi caur mitohondriju atkarīgu ceļu.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiāli un metodes

Dzīvnieki.

Peļu mātītes C57BL/6 (6-8 nedēļas, ~25 g) tika iegādātas no Pekinas laboratorijas dzīvnieku pētniecības centra (Pekina, Ķīna) un tika izmitinātas kontrolētā temperatūrā (25˚C), gaismas ciklā (12/ 12) Sjiņdzjanas Universitātes dzīvnieku komplekss (Urumči, Ķīna). Visi dzīvnieki saņēma ūdeni un pārtiku bez patogēniem.

Šūnu līnija un kultūra.

Cilvēka barības vada karcinomas šūnu līniju (Eca-109) saglabāja Sjiņdzjanas galvenā bioloģisko resursu un gēnu inženierijas laboratorija (Dzīvības zinātnes un tehnoloģiju koledža, Sjiņdzjanas Universitāte, Urumči, Ķīna) un kultivēja RPMI{{1} } barotne (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ASV), kas papildināta ar 10% termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Ķīna), 1% L -glutamīns (100 mM), 100 U/ml penicilīna un 100 µg/ml streptomicīna 37 ˚C mitrinātā atmosfērā, kas satur 5% CO2.

Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC).

CTPG-W (kat. Nr. SGJG20170410) tika iegādāts no Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna). Galvenie CTPG savienojumi tika kvalificēti un kvantificēti ar HPLC saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu (24). Īsumā, HPLC tika veikta uz ZORBAX SB-C18 kolonnas (250x4,6 mm; 5 µm) 30 °C temperatūrā un eluēja ar 0,2% skudrskābes šķīdumu un metanola gradientu, sākot no 23%, jo katru minūti pievienoja 1 ml. 45 minūtes, līdz tiek sasniegts 31%. Kopā tika ievadīts 10 µl paraugs un noteikts pie 330 nm. Ehinakozīda standarts tika iegādāts no Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna), bet akteozīda standarts tika iegādāts no Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmštate, Vācija). Standarti tika izmantoti, lai analizētu CTPG-W komponentus.

MTT tests.

Šūnu proliferācija tika mērīta ar MTT testu. Eca{{0}} šūnas tika inokulētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 5x103 šūnas 100 µl RPMI{{5 }} barotne/iedobe un kultivēta 37˚C 24 stundas, pēc tam apstrādāta ar dažādu koncentrāciju (0, 200, 400, 600 un 800 µg/ml) CTPG-W vai 0,4% dimetilsulfoksīdu (DMSO) 24 stundas, 48 un 72 stundas. DMSO tika izmantots kā šķīdinātāja kontrole (800 µg/ml CTPG-W, kas satur 0,4% DMSO). Cisplatīns (20 µg/ml) tika izmantots kā pozitīvā kontrole. Pēc tam supernatants tika izmests pēc centrifugēšanas ar ātrumu 225 xg 5 minūtes istabas temperatūrā un katrai iedobei pievienoja 100 µl MTT šķīduma (0,5 mg/ml RPMI-1640 barotnē bez FBS) un inkubēja 37 ˚C temperatūrā 3 h. Veidotie formazāna kristāli tika izšķīdināti 200 µl DMSO. Optiskā blīvuma (OD) vērtības tika mērītas pie viļņa garuma 490 nm ar 96-iedobes mikroplašu lasītāju (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ASV). Relatīvā šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta pēc formulas: Šūnu dzīvotspēja (%)=(OD apstrādāta/ODneapstrādāta)x100%. Eca-109 šūnu morfoloģija tika novērota ar apgrieztu fluorescences mikroskopu (palielinājums, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokija, Japāna).

Splenocītu proliferācijai C57BL/6 peles tika eitanizētas ar dzemdes kakla dislokāciju, un liesas tika izolētas. Tika pagatavota vienšūnu suspensija un splenocīti tika iesēti 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 1x105 šūnas/iedobē 100 µl RPMI-1640 barotnē un pēc tam apstrādāti ar dažādām koncentrācijām. (0, 200, 400, 600 un 800 µg/ml) CTPG-W 24, 48 un 72 stundas 37˚C ar 5% CO2. Splenocītu proliferācija tika mērīta ar MTT testu saskaņā ar iepriekš minēto protokolu. Stimulējošais indekss=ODapstrādāts/ODNeapstrādāts.

Apoptozes un šūnu cikla mērīšana. Eca{{0}} šūnas tika kultivētas 60 mm trauciņos ar blīvumu 2,5x105 šūnas/trauciņā 24 stundas un apstrādātas ar dažādām koncentrācijām ({{31} }, 200, 400, 600 un 800 µg/ml) CTPG-W vai 0,4% DMSO 24 stundas 37˚C ar 5% CO2. Šūnas tika savāktas un iekrāsotas ar aneksīna V-fluoresceīna izotiocianāta (FITC) / propīdija jodīda (PI) apoptozes noteikšanas komplektu (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Šanhaja, Ķīna) saskaņā ar ražotāja protokoliem. Paraugi tika savākti ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ASV) un analizēti ar FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, ASV). Lai analizētu CTPG-W ietekmi uz šūnu ciklu, 2,5x105 Eca-109 šūnas tika iesētas 60 mm kultivēšanas trauciņos un apstrādātas ar CTPG-W (0, 100, 200 un 400 µg/ml) vai 0,4 % DMSO 24 stundas 37 °C temperatūrā ar 5% CO2. Visas šūnas tika novāktas un divas reizes mazgātas ar ledusaukstu PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), pēc tam fiksētas 70% ledusaukstā etanolā 4 °C temperatūrā 30 minūtes. Pēc divreiz mazgāšanas ar ledusaukstu PBS, šūnas tika atkārtoti suspendētas 300 µl PI/RNase krāsošanas buferšķīdumā (BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV) 10 minūtes istabas temperatūrā. Šūnu cikla sadalījums tika analizēts ar ModFit LT 3.0 programmatūru, izmantojot plūsmas citometriju (BD FACSCalibur).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSAPret nogurumuAizsargājiet aknas PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitohondriju membrānas potenciāla (Δψm) un reaktīvo skābekļa sugu (ROS) analīze.Lai analizētu Δψm, Eca{{0}} šūnas tika apstrādātas ar CTPG-W (0, 400, 600 un 800 µg/ml) vai 0,4% DMSO. 24 h 37˚C ar 5% CO2, un krāsots ar Mitohondriju membrānas potenciāla noteikšanas komplektu ar JC-1 (Beyotime Biotechnology Institute, Šanhaja, Ķīna), saskaņā ar ražotāja protokolu, 20 minūtes 37˚ temperatūrā. C. Pēc divreiz mazgāšanas ar JC-1 mazgāšanas buferi (Beyotime Institute of Biotechnology), paraugi tika atkārtoti suspendēti ar 300 µl JC-1 mazgāšanas buferi un analizēti ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur). Krāsvielas JC-1 fluorescence Eca-109 šūnās tika novērota arī ar apgrieztu fluorescences mikroskopu (palielinājums, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Lai analizētu ROS, Eca-109 šūnas tika apstrādātas ar CTPG-W (0, 400, 600 un 800 µg/ml) 2, 4, 6, 12 un 24 stundas un iekrāsotas ar reaktīvo skābekļa sugu testu. komplekts (Beyotime Institute of Biotechnology), saskaņā ar ražotāja protokolu, 20 minūtes 37˚C temperatūrā. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar ledusaukstu PBS, paraugi tika savākti ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur) un analizēti ar FlowJo 7.6 programmatūru.

1. attēls. CTPG-W kvalificēta kontrole. CTPG-W komponenti tika kvalitatīvi un kvantitatīvi analizēti ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju un salīdzināti ar ehinakozīda un akteozīda standartiem. CTPG-W, ūdenī šķīstošie feniletanoīdu glikozīdiC. tubulosa.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) radikāļu attīrīšanas aktivitāte. CTPG-W brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika noteikta ar DPPH brīvo radikāļu testu saskaņā ar publicēto protokolu ar nelielām izmaiņām, jo ​​metanols tika aizstāts ar etanolu, lai izšķīdinātu DPPH (25, 26). Līdzsvara stāvokļa mērījumiem 150 µl DPPH (100 mmol/l) etanolā tika sajaukti ar dažādām CTPG-W koncentrācijām (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 un 600 µg/ml) 50 µl PBS un inkubēja tumsā 30 minūtes istabas temperatūrā. Absorbcija pie 517 nm tika noteikta CTPG-W klātbūtnē un bez tās. Kopā kā pozitīvā kontrole tika izmantoti 50 µl C vitamīna. DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika aprēķināta, izmantojot formulu: Attīrīšana (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, kur tukšais ir kontroles absorbcija (bez DPPH), Asample ir parauga absorbcija un A0 ir PBS absorbcija ar DPPH.

Western blot analīze. Eca{{0}} šūnas tika apstrādātas ar CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) vai 0,4% DMSO 24 stundas 37 °C temperatūrā ar 5% CO2. Sekojošā mazgāšana divreiz ar PBS, šūnas 

2. attēls. CTPG-W ietekme uz Eca-109 šūnu un splenocītu augšanu. (A) Eca-109 šūnas tika apstrādātas ar dažādām CTPG-W koncentrācijām 24, 48 un 72 stundas, un pēc tam šūnu dzīvotspēja tika noteikta ar MTT testu. (B) Eca-109 šūnu morfoloģiskās izmaiņas pēc apstrādes ar CTPG-W 24 stundu laikā. (C) C57BL / 6 peļu splenocīti tika apstrādāti ar dažādām CTPG-W koncentrācijām 24, 48 un 72 stundas, un pēc tam proliferācija tika analizēta ar MTT testu.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

tika lizēti Radioimmunoprecipitation Assay Lysis buferšķīdumā (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Pekina, Ķīna) 20 minūtes uz ledus. Pēc centrifugēšanas pie 10, 000 xg 10 minūtes 4 °C temperatūrā, supernatanti tika savākti un olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar bicinhonīnskābes komplektu (Thermo Fisher Scientific, Inc.) saskaņā ar ražotāja protokoliem. Western blot analīze tika veikta saskaņā ar mūsu iepriekšējo aprakstu (24). Antivielas pret kaspāzi-7 (kat. Nr. D120077), kaspāzi-8 (kat. Nr. D155240), kaspāzi-9 (kat. Nr. D220078), B-šūnu limfomu{ Ar {13}} (Bcl-2) saistītais X (Bax) (kat. Nr. D220073) un Bcl-2 (kat. Nr. D260117) un anti-peļu IgG-mārrutku peroksidāze (HRP) ) (kat. Nr. D111050) un anti-trušu IgG-HRP (kat. Nr. D110058) tika iegādāti no BBI Life Sciences (Šanhaja, Ķīna). Antivielas pret kaspāzi-3 (kat. Nr. E-AB-10050) un aktīvo kaspāzi-3 (kat. Nr. E-AB-22115) tika iegādātas no Elabscience ( Uhaņa, Ķīna). Citas antivielas pret kaspāzi-7 (kat. Nr. 9492), poli (ADP-ribozes) polimerāzi (PARP) (kat. Nr. 9542), citohromu c (kat. Nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminālā kināze (JNK) (kat. Nr. 9252S) un -aktīns (kat. Nr. 58169) tika iegūti no Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, ASV). Visas primārās un sekundārās antivielas tika atšķaidītas attiecībā 1:1,000. Primārās antivielas tika inkubētas 4 °C temperatūrā nakti, bet sekundārās antivielas inkubētas 37 °C temperatūrā 1 stundu.

3. attēls. CTPG-W izraisītā Eca-109 šūnu apoptoze. Šūnas 24 stundas apstrādāja ar dažādām CTPG-W koncentrācijām. (A) Apoptotiskās un nekrotiskās Eca-109 šūnas tika analizētas ar plūsmas citometriju. Augšējā panelī ir attēloti atsevišķi punktu diagrammi, bet apakšējā panelī - kopsavilkuma dati. *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Mērķa olbaltumvielas tika noteiktas, izmantojot uzlabotu ķīmiskās luminiscences testa komplektu (Beyotime Biotehnoloģijas institūts), saskaņā ar ražotāja protokolu.

Statistiskā analīze. Statistisko nozīmīgumu aprēķināja, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi ar Tukey post hoc testu, un rezultāti tika analizēti, izmantojot GraphPad Prism 5.{2}} programmatūru (GraphPad Software, La Jolla, CA, ASV) ārstēšanas un kontroles grupās. Visi dati tika parādīti kā vidējā ± standarta novirze. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANČES TUBULOZAS EKSTRAKTS NIERU FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultāti

CTPG-W nomāc Eca-109 šūnu augšanu.

CTPG-W komponenti tika kvalificēti un kvantitatīvi noteikti ar HPLC (1. att.), kas tika salīdzināti ar ehinakozīda un akteozīda standartiem. Saskaņā ar maksimālo aiztures laiku un pīķu laukumiem CTPG-W saturēja 39,16% ehinakozīda un 2,44% akteozīda. Pirmkārt, CTPG-W ietekme uz Eca-109 šūnu dzīvotspēju tika noteikta ar MTT testu. CTPG-W tika izšķīdināts DMSO pie 200 mg/ml un atšķaidīts ar RPMI-1640 barotni, kas satur 10% termiski inaktivētu FBS līdz norādītajai koncentrācijai. Eca-109 šūnas tika apstrādātas ar CTPG-W, un šūnu dzīvotspēja tika analizēta ar MTT testu norādītajos laika punktos. Ārstēšana ar CTPG-W būtiski samazināja Eca-109 šūnu dzīvotspēju atkarībā no devas un laika (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

4. attēls. CTPG-W ietekme uz šūnu cikla sadalījumu Eca-109 šūnās. Eca-109 šūnu apstrādei 24 stundas tika izmantotas dažādas CTPG-W koncentrācijas, un šūnu cikla sadalījums tika analizēts ar plūsmas citometriju. *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W izraisa apoptozi Eca-109 šūnās. Lai noskaidrotu, vai CTPG-W nomāca Eca-109 šūnu augšanu, izraisot apoptozi vai nekrozi, šūnas tika apstrādātas ar dažādām CTPG-W koncentrācijām. Pēc 24 stundām Eca-109 šūnu apoptoze un nekroze tika konstatēta ar aneksīna V/PI krāsošanu. Kā parādīts 3.A attēlā, aneksīna V-/PI+ šūnas tika iedalītas kā nekrotiskās šūnas, un aneksīna V+/PI+ un aneksīna V+/PI- šūnas tika iedalītas kā apoptotiskas šūnas. CTPG-W galvenokārt izraisīja Eca-109 šūnu apoptozi atkarībā no devas, lai gan arī nekrotiskās Eca-109 šūnas ievērojami palielinājās, ārstējot 600 un 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W izraisa šūnu cikla apstāšanos S fāzē Eca-109 šūnās. Vēža šūnu cikla traucējumi nomāc šūnu augšanu un veicinās apoptozi (27). Šūnu cikla sadalījums Eca-109 šūnās tika noteikts ar PI krāsošanu pēc CTPG-W apstrādes 24 stundas. Tika novērots, ka šūnas S fāzē palielinājās un šūnas G0/G1 fāzēs liecināja par vispārēju būtisku samazināšanos pēc apstrādes ar CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W samazina Δψm un izraisa citohroma c izdalīšanos. Apoptozi var izraisīt no mitohondrijiem atkarīgs ceļš (28, 29). BCL-2 proteīnu saimes pro- un anti-apoptotiskajiem locekļiem ir svarīga loma mitohondriju membrānas integritātes regulēšanā (30, 31). Pēc 24 stundu ilgas apstrādes ar CTPG-W Δψm tika novērtēts, izmantojot JC-1 krāsošanu. JC-1 agregāts (sarkanā fluorescence noteikta FL-2) sadalīsies monomērā (zaļā fluorescence noteikta FL-1), kad Δψm samazinās (32). Kā parādīts 5.A attēlā, FL-1+ FL-2-/+ šūnu biežums ievērojami palielinājās atkarībā no devas, norādot, ka Eca-109 šūnu Δψm samazinājās. Fluorescences izmaiņas Eca-109 šūnās tika novērotas arī ar apgrieztās fluorescences mikroskopu (5.B att.). Pieaugot CTPG-W koncentrācijai, sarkanā fluorescence samazinājās un zaļā fluorescence palielinājās, kas atbilst plūsmas citometrijas datiem. Tika arī novērots, ka citohroma c līmenis citozolā bija ievērojami paaugstināts (5.C att.), kas ir Δψm samazināšanās rezultāts. Tas pastiprina secinājumu, kas izdarīts no palielinātā FL-1+ FL-2-/+ šūnu skaita, ka Δψm samazinājās CTPG-W apstrādes rezultātā. Ir ziņots, ka JNK var regulēt BCL-2 proteīnu saimes aktivāciju, izraisot citohroma c (33-35) izdalīšanos. Tika arī noteikts, ka pēc CTPG-W apstrādes JNK līmenis bija ievērojami paaugstināts (5. C attēls). Rezultāti liecināja, ka CTPG-W var izraisīt Eca-109 šūnu apoptozi, izmantojot no mitohondriju atkarīgu ceļu.

5. attēls. Δψm samazināšana un citohroma c un JNK regulēšana. Eca-109 šūnas tika apstrādātas ar dažādām CTPG-W koncentrācijām 24 stundas. (A) Δψm tika noteikts ar JC-1 krāsošanu, un paraugi tika analizēti ar plūsmas citometriju. Atsevišķos punktu diagrammas attēlo JC-1 fluorescences izmaiņas. Šūnu FL-1+ FL-2-/+ frekvences ir attēlotas apakšējā panelī. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

6. attēls. ROS līmenis Eca-109 šūnās pēc apstrādes ar CTPG-W un CTPG-W antioksidanta aktivitāte. (A) Eca-109 šūnas tika apstrādātas ar dažādām CTPG-W koncentrācijām, un ROS līmeņi tika analizēti ar plūsmas citometriju norādītajos laika punktos. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

CTPG-W ietekme uz intracelulāro ROS veidošanos.ROS varētu samazināt Δψm, lai izraisītu apoptozi (36). Lai noskaidrotu, vai CTPG-W var palielināt ROS veidošanos, Eca-109 šūnas tika apstrādātas ar dažādām CTPG-W koncentrācijām. Šūnas tika savāktas norādītajos laika punktos un iekrāsotas ar DCFH-DA. Intracelulāro ROS veidošanos Eca-109 šūnās noteica ar plūsmas citometriju. Kā parādīts 6.A attēlā, 800 µg/ml CTPG-W ievērojami palielināja ROS veidošanos no 2-6 h un samazinājās no 12-24 h. Turklāt 400 µg/ml CTPG-W ievērojami palielināja ROS ražošanu no 12-24 h. Turklāt 200 µg/ml CTPG-W būtiski nemainīja ROS ražošanu. Dinamiskās izmaiņas ROS ražošanā var būt saistītas ar Eca-109 šūnu apoptozi. Tika arī noteikts, ka CTPG-W bija brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāte (6.B att.), kas var būt saistīta ar samazinātu ROS veidošanos Eca-109 šūnās, kas pēc 12 stundām apstrādātas ar 800 µg/ml CTPG-W.

7. attēls. Šķelto kaspāžu un šķelto PARP līmenis pēc apstrādes ar CTPG-W. Olbaltumvielas tika izolētas no Eca-109 šūnām, kas apstrādātas ar CTPG-W 24 stundas, un šķelto kaspāžu un šķelto PARP līmenis tika noteikts ar Western blot analīzi. DMSO, dimetilsulfoksīds; CTPG-W, ūdenī šķīstošie feniletanoīdu glikozīdiC. tubulosa; PARP, poli (ADP-ribozes) polimerāze.

CTPG-W pārregulē kaspāzes-3, kaspāzes-7, kaspāzes-9 un PARP aktivitāti. Citohroma c izdalīšanās Δψm samazināšanas dēļ var aktivizēt kaspāzes proteāzes, lai izraisītu apoptozi (29, 30, 37). Pēc 24 stundu ilgas apstrādes ar CTPG-W kaspāzes -3, 7, 8, 9 un PARP aktivācija tika noteikta ar Western blot analīzi. Salīdzinot ar kontroli, šķeltās-kaspāzes-9, šķeltās-kaspāzes-7, šķeltās-kaspāzes-3 un šķeltās-PARP līmenis, bet ne šķeltās-kaspāzes līmenis{20. }}, tika paaugstināti ar CTPG terapiju atkarībā no devas (7. att.). Šie rezultāti liecināja, ka CTPG-W samazināja Δψm un veicināja citohroma c izdalīšanos, lai aktivizētu kaspāzes, kas izraisa Eca-109 šūnu apoptozi.

Diskusija

Tradicionālā CHM var izraisīt barības vada vēža šūnu apoptozi, izmantojot dažādus ceļus, tostarp ārējos nāves receptorus un iekšējos mitohondriju un endoplazmatiskā tīkla stresa ceļus (29). Mūsu iepriekšējais pētījums parādīja, ka CTPG kā galvenā C. tubulosa sastāvdaļa inhibēja melanomas B16-F10 šūnu augšanu, inducējot apoptozi caur mitohondriju atkarīgu ceļu (24). Šajā pētījumā tika pētīta CTPG-W pretvēža iedarbība uz Eca-109 šūnām un tika noteikts, ka CTPG-W nomāc Eca-109 šūnu augšanu, izraisīja apoptozi un šūnu cikla apstāšanos, samazināja Δψm, palielināja citohroma c un aktivēto kaspāžu izdalīšanos. CTPG un CTPG-W var izraisīt apoptozi un šūnu cikla apstāšanos vēža šūnās. Tomēr precīzie mehānismi atšķiras dažādu CTPG (26,64% ehinakozīda, 10,19% akteozīda un 1,71% izoakteozīda) un CTPG-W (39,16% ehinakozīda un 2,44% akteozīda) sastāvdaļu dēļ. CTPG aizturēja B16-F10 šūnas G0/G1 fāzē, bet CTPG-W aizturēja Eca-109 šūnas S fāzē (24). ROS produkciju atkarībā no devas palielināja CTPG, bet tas liecināja par izmaiņām no laika atkarīgā veidā ar lielu CTPG-W devu, kas ievērojami palielinājās CTPG-W ārstēšanas sākumā (2-6 h) un ievērojami samazinājās pēc 12 stundām, salīdzinot ar kontroli. Iespējamais iemesls ir tas, ka galvenā CTPG-W sastāvdaļa ir ehinakozīds. Vairākos pētījumos ziņots, ka ehinakozīds var kavēt ROS veidošanos un ROS izraisītu apoptozi, lai radītu neiroprotektīvo un pretnovecošanās efektu (38-40). Tāpat šajā pētījumā tika novērota brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāte. Tāpēc tika pieņemts, ka daži komponenti, tostarp verbaskozīds, izo-verbaskozīds un salidrozīds lielā CTPG-W devā varētu nekavējoties izraisīt ROS veidošanos, lai izraisītu Eca-109 šūnu apoptozi (41,42), un pēc tam ROS iztīrīja echinakozīds. Vēl viens iespējamais iemesls atšķirībām CTPG un CTPG-W ROS ražošanā ir tas, ka šajā un iepriekšējā pētījumā tika izmantotas dažādas šūnu līnijas (24). Dong et al (43) ziņoja, ka ehinakozīds var izraisīt cilvēka SW480 kolorektālā vēža šūnu apoptozi, radot oksidatīvus DNS bojājumus bez paaugstināta ROS līmeņa.

Ārstēšana ar CTPG-W samazināja Δψm un izraisīja citohroma c izdalīšanos, kas veicina kaspāzes -9 šķelšanos (28). Konsekventi šķeltās kaspāzes -9 līmenis tika paaugstināts ar CTPG-W ārstēšanu. Pēc tam aktīvā kaspāze-9 var aktivizēt kaspāzi-3, lai izraisītu apoptozi (44). Sašķeltās kaspāzes{10}} līmenis tika paaugstināts arī ar CTPG-W ārstēšanu. Tomēr CTPG-W neaktivizēja kaspāzi -8, kas norāda, ka ārējais nāves receptoru ceļš nebija iesaistīts CTPG-W izraisītajā apoptozē. Šie novērojumi liecina, ka CTPG-W inducē Eca-109 šūnu apoptozi, aktivizējot no mitohondrijiem atkarīgu ceļu.

PARP ir svarīga loma genoma stabilitātē, un to var šķelt aktīvās kaspāzes, īpaši kaspāzes -3 un -7 (45). Tika noteikts, ka ārstēšana ar CTPG-W aktivizēja kaspāzi-3 un -7, kas var šķelt PARP, lai kavētu DNS atjaunošanos un izraisītu apoptozi.

CTPG-W arī atkarībā no devas un laika nomāc cilvēka hepatocelulārās karcinomas BEL-7404 šūnu augšanu (nepublicēti dati). Lai gan CTPG-W kavē Eca-109 un BEL-7404 šūnu augšanu, tas veicina splenocītu proliferāciju, kas var būt saistīts ar polisaharīdu saturu (~50%) CTPG-W (46 ). Tāpat vairākos pētījumos ir ziņots, ka polisaharīdi var veicināt splenocītu (46-49) proliferāciju. Peles modelī tika noteikts, ka CTPG-W ievērojami palielināja liesas indeksu, salīdzinot ar kontroles grupu, bet neietekmēja ķermeņa svaru un citu orgānu indeksus, tostarp sirds, aknas, nieres un plaušas (nepublicēti dati), norādot, ka CTPG-W nav citotoksiskas ietekmes uz normālām šūnām.

Kopumā dati liecināja, ka CTPG-W inhibē Eca-109 šūnu augšanu, inducējot apoptozi caur mitohondriju atkarīgu ceļu

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%