Dažādu Kadsura Coccinea ekstraktu fotoaizsargājošas un pretmelanogēnas īpašības

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Saules ultravioletais (UV) starojums, ko raksturo UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) un UVC (100–280 nm), ir vissvarīgākais vides faktors, kas izraisa ādas vēzi un fotonovecošanos citotoksicitātes un genotoksicitātes dēļ. un fototoksicitāte. Konkrēti, UVA un UVB starojums veido attiecīgi vairāk nekā 95 procentus un 3 procentus no ikdienas UV starojuma [8]. UVA un UVB starojums var izraisīt reaktīvās skābekļa sugas (ROS) netieši vai tieši, iekļūstot epidermas un/vai dermas ādas slāņos, izraisot oksidatīvus bojājumus un šūnu nāvi. Pēdējo desmitgažu laikā UV starojums ir kļuvis par nopietnu ādas veselības problēmu un joprojām bīstami izplatās visā pasaulē [9–11]. UV starojums ir tiešs un konsekvents keratinocītu stimulators, kas veido aptuveni 95 procentus no ādas epidermas šūnu masas. Keratinocīti darbojas kā pirmā barjera pret mikrobiem, ķīmiskiem un fizikāliem apdraudējumiem un palīdz aizsargāties pret UVA un UVB starojumu. Kad keratinocīti tiek pakļauti UVA un UVB iedarbībai, tiek ģenerēti intracelulāri ROS, tādējādi izraisot apoptozi [12–14].

Melanocīti ir atbildīgi par melanīna pigmentu ražošanu un daudzumu, kas ir svarīgi ādas epidermas bioloģiskās aizsardzības dalībnieki; to disregulācija var izraisīt hiperpigmentāciju vai hipopigmentācijas traucējumus [15,16]. Melanocīti ir izplatīti ādas epidermas pamatslānī, ko ietekmē arī saules gaismas iedarbība, reaktīvās skābekļa sugas (ROS) un -melanocītus stimulējošie hormoni (-MSH) [17,18]. Tirozināze, kas pieder pie vara proteīnu tipa -3, ir evolucionāri konservēts metaloproteīns, kam ir izšķiroša nozīme melanoģenēzē un monofenola monooksigenāzes, kateholāzes un difenolu aktivitātēs. Tirozināzes, ar tirozināzi saistītā proteīna-1 (TRP-1) un ar tirozināzi saistītā proteīna-2 (TRP-2) pazeminātai regulēšanai ir izteikta katalītiska iedarbība. TRP-1 ir 5,6-dihidroksiindola-2-karbonskābes oksidāze, un TRP-2 ir DOPAhroma tautomerāze [19,20]. Turklāt ar mioftalmozi saistītais transkripcijas faktors (MITF) un uz cAMP reaģējošais elementu saistošais proteīns (CREB) ir transkripcijas faktori, kas galvenokārt regulē melanoģenēzi un kodē informāciju par stimulācijas veidu un intensitāti [17, 21]. Vairāki pētījumi liecina, ka MITF un CREB ceļi regulē melanoģenēzi. MITF ir galvenais faktors ar melanoģenēzi saistīto enzīmu transkripcijā un melanoģenēzes centrālais regulators. -MSH izraisa MITF ekspresiju, izmantojot signalizācijas mehānismu, kas ietver ar cAMP saistīto saistošo proteīnu (CREB). Pēc tam MITF iekļūst kodolā ar M-box secību (AGTCATGTGCT), lai veicinātu specifisku melanogēno gēnu un enzīmu transkripciju. Ir arī zināms, ka fosforilēto CREB stimulē -MSH, kas saistās ar CRE konsensa elementu Mitf promotorā, lai pārregulētu Mitf transkripciju [21–24].

Šajā pētījumā tika visaptveroši salīdzināti KC sakņu (KCR), stublāju (KCS), lapu (KCL) un augļu (KCF) ekstrakti, un tika veikti vairāki to fotoaizsargājošo un anti-melanogēno īpašību novērtējumi.

2. Materiāli un metodes

2.1. KC ekstraktu sagatavošana

Trīs gadus vecs KC 15 augs tika audzēts 9 l plastmasas podā Pusanas Nacionālās universitātes Mirjanas pilsētiņā. KC identificēja profesors Young Whan Choi, šī pētījuma autors. Šie paraugi tika glabāti kā kuponu paraugi (piekļuves numurs KC-PDRL-1) Pusanas Nacionālās universitātes Dabas resursu un dzīvības zinātņu koledžas Dārzkopības biozinātnes departamenta herbārijā. Augi tika pietiekami laistīti, izmantojot pilnu barības vielu šķīdumu ar vadītspējas līmeni 1.0 mS·cm−1 un kas satur šādus elementus (me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; un S, 4. KC kleita ostā tika novākta 2020. gada decembrī, klasificējot saknes, stublājus, lapas un augļus (1. A attēls). Novāktie paraugi tika nekavējoties liofilizēti saldētavā un uzglabāti vinila maisiņos 20 ◦ C temperatūrā līdz analīzei. KC (20 g) žāvētās saknes, stublāji, lapas un augļi tika samalti līdz smalkam pulverim un ekstrahēti istabas temperatūrā ar etilspirtu. Īsumā, KC EtOH ekstraktu filtrēšana un iztvaicēšana tika veikta pazeminātā spiedienā 45 ◦ C, kam sekoja liofilizācija. Visbeidzot, cietais ekstrakts (50 mg / ml) tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO) turpmākiem eksperimentiem.

cistancheherba epimedium sagittatumekstrakts

2.2. Kopējais polifenolu un flavonoīdu saturs KC ekstraktos

Kā aprakstīts iepriekš [25], kopējais polifenolu un flavonoīdu saturs KC sakņu, stublāju, lapu un augļu ekstraktos tika mērīts, izmantojot Folin-Ciocalteu (kopējais polifenols) un alumīnija hlorīda (flavonoīdu) kolorimetriskās metodes. Absorbcija tika mērīta pie 700 nm (kopējais polifenols), izmantojot Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Bekingemšīra, Apvienotā Karaliste), un pie 510 nm (flavonoīds), izmantojot VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, ASV). .

Standarta līknes tika izveidotas, kā standartus izmantojot gallskābi (kopējais polifenols) un kvercetīnu (flavonoīdu), un rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalenti uz gramu (GAE/g) KC sakņu, stublāju, lapu un augļu ekstraktu un kvercetīna ekvivalentu. uz gramu (QE/g) attiecīgi KC sakņu, stublāju, lapu un augļu ekstraktu.

2.3. DPPH un ABTS tests

KC sakņu, stublāju, lapu un augļu ekstraktu ({0}},5 mg/mL) DPPH un ABTS radikāļu attīrīšanas aktivitātes tika mērītas saskaņā ar iepriekš aprakstīto metodi [25] ar nelielām izmaiņām. KC sakņu, stublāju, lapu un augļu ekstrakti (0,5 mg/mL) tika sajaukti ar DPPH šķīdumu (60 µM) mikroplatēs. Pēc tam, kad paraugi tika enerģiski sakratīti, tie tika turēti tumsā 25 ◦C temperatūrā 0,5 stundas. 7 mM ABTS un 2, 6 kālija persulfāta izejas šķīdumus sagatavoja destilētā ūdenī istabas temperatūrā tumsā 18 stundas. KC sakņu, stublāju, lapu un augļu ekstrakti (0, 5 mg / ml) tika sajaukti ar darba šķīdumu un pēc tam ļāva nostāvēties 0, 5 stundas istabas temperatūrā tumsā. Paraugu maisījumu absorbcija tika uzraudzīta pie 510 nm (DPPH) vai 734 nm (ABTS).

2.4. Šūnu kultūra

Pielipušie keratinocīti (HaCaT) un pielipušie melanocīti (B16F10) tika inokulēti DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, ASV) kultūras šķīdumā, kas satur 10 procentus FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, ASV) un 1 procentu penicilīna/streptomicīna. Corporation, Carlsbad, CA, ASV) un kultivēta 37 ◦C temperatūrā ar 5 procentiem CO2. Regulāri tika novērota pievienotā HaCaT un B16F10 šūnu augšana, un barotne tika mainīta ik pēc divām līdz trim dienām. Turpmākajos eksperimentos tika izmantotas šūnas no logaritmiskās augšanas fāzes.

2.5. UVA un UVB apstarošana

Keratinocīti tika pakļauti UVA vai UVB starojumam (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Vācija) ar 5 8 W lampām, kas izstaro lielāko daļu savas enerģijas pie emisijas maksimuma pie 365 nm ( UVA) vai 312 nm (UVB). UVA apstarošanas devas bija 20 J/cm2 un UVB apstarošanas devas bija 50 mJ/cm2.

2.6. Šūnu dzīvotspējas un citotoksicitātes mērīšana, izmantojot CCK-8 un LDH analīzi

Šūnu dzīvotspējas analīzei HaCaT keratinocītiem tika pievienots šūnu skaitīšanas komplekta-8 (CCK-8) šķīdums no CCK-8 testa komplekta (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV). un B16F10 melanomas šūnu suspensijas saskaņā ar ražotāja norādījumiem un inkubētas 37 ◦C 4 stundas. Īsumā, 2 104 šūnas tika iesētas katrā 24-iedobes plāksnes iedobē un inkubētas ar 5 procentiem CO 37 ◦C temperatūrā 24 stundas. Īsumā, 2 104 šūnas tika iesētas katrā 24-iedobes plāksnes iedobē un inkubētas ar 5 procentiem CO 37 ◦C temperatūrā 24 stundas. Pēc 24 stundu inkubācijas katrai iedobei tika pievienots CCK-8 reaģents, un šūnas tika inkubētas vēl 4 stundas. Lai noteiktu ārpusšūnu laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanos HaCaT keratinocītu barotnē, tika izmantots citotoksicitātes noteikšanas komplekts (Roche Applied Science, Šveice). Absorbcija tika analizēta pie 450 nm (CCK-8) un 490 nm (LDH), izmantojot VICTOR Multilabel Plate Reader.

2.7. Intracelulārās ROS ražošanas novērtējums keratinocītos

Intracelulārie ROS līmeņi tika analizēti, izmantojot {{0}}(un-6)-hlormetil-2′,7′-dihlorīda-hidrofluoresceīna diacetāta acetilesteri (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Visas procedūras tika veiktas saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsāk sakot, pēc KC citu daļēju ekstraktu (0,5 mg/ml) apstrādes keratinocīti (HaCaT) tika mazgāti ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) un inkubēti ar CM-H2DCFDA (5 µM) 0,5 stundas tumšs. Pēc tam intracelulārās ROS ģenerēšana tika vizualizēta, izmantojot Carl Zeiss fluorescences mikroskopu; fluorescences intensitāte tika mērīta, pamatojoties uz fluorescējošu krāsu (CM-H2DCFDA), izmantojot plūsmas citometru (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, ASV).

2.8. Apoptozes analīze

Pēc iedarbības un apstrādes HaCaT keratinocīti tika tripsinēti un centrifugēti. Pēc tam iegūto šūnu apoptoze tika novērtēta, izmantojot fluoresceīna izotiocianāta (FITC) Annexin V / Dead CellApoptosis komplektu (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, keratinocīti tika izskaloti divreiz ar PBS, un keratinocīti aneksīna saistošajā buferšķīdumā tika iegūti un sajaukti ar FITC / Annexin V (komponents A) un propīdija jodīda (PI) darba šķīdumu. Pēc inkubācijas istabas temperatūrā 15 minūtes tumsā tika izmērīta keratinocītu apoptoze un apoptotisko šūnu procentuālais daudzums tika aprēķināts, izmantojot plūsmas citometru (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, ASV). Tika konstatēti signāli FL1 (FITC/Nexin V) un FL3 (PI) kanāliem, un tika izveidotas iekrāsoto šūnu kvadrantu marķieru krāsošanas un punktu diagrammas.

2.9. Intracelulārā melanīna satura un tirozināzes aktivitātes analīze

Intracelulārā melanīna saturs un tirozināzes aktivitātes testi tika mērīti, paskaidrojot, kur nedaudz modificētā procedūra atšķiras [24]. Melanocīti tika apstrādāti ar galīgo koncentrāciju 0,5 µM -MSH un 0,5 mg/mL KC citiem daļējiem ekstraktiem 48 stundas. Melanocītu granulas tika lizētas ar 1 N NaOH 1 0 procentu DMSO 80 ◦ C temperatūrā 1 stundu. Relatīvais melanīna saturs tika noteikts, mērot absorbciju pie 475 nm, izmantojot VICTORMultilabel Plate Reader. Intracelulārā tirozināzes aktivitāte tika noteikta, mērot dopahroma ražošanas ātrumu, izmantojot L-DOPA. Melanocīti tika mazgāti ar ledusaukstu PBS un lizēti PBS, kas satur 1% (w/v) Triton X-100. Tirozināzes substrāts L-DOPA (2 mg / ml) tika sagatavots tajā pašā fosfāta līzes buferšķīdumā. Katrs ekstrakts tika ievietots 96-iedobes plāksnē, un fermentu analīze tika uzsākta, pievienojot L-DOPA šķīdumu. Pēc 1 stundas ilgas inkubācijas absorbcija tika mērīta pie 475 nm, izmantojot VICTOR Multilabel Plate Reader, lai analizētu dopahroma veidošanos. Katra mērījuma vērtība tika izteikta procentos no kontroles. Arbutīns (A, 0,5 mg/ml) tika izmantots kā pozitīvā kontrole.

Cistancheehinakozīdsir tirozināzes inhibitors.

2.10. Kvantitatīvā reāllaika PCR

Kopējā RNS tika izolēta no katras melanocītu grupas, izmantojot RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Vācija). Reversā transkripcija tika veikta, izmantojot lielas ietilpības cDNS reversās transkripcijas komplektu (Thermo Fisher Scientific, Maiami, OK, ASV), saskaņā ar ražotāja norādījumiem, lai iegūtu pirmo cDNS virkni. Pēc tam pavedieni tika izmantoti kā veidnes kvantitatīvā reāllaika PCR (qRT-PCR), izmantojot Bio-Rad Chromo4TM instrumentu un SYBR Green qPCR galveno maisījumu (Thermo Fisher Scientific, Maiami, OK, ASV). PCR tika veikta iepriekš denaturējot 95 ◦ C temperatūrā 5 minūtes, denaturējot 95 ◦ C temperatūrā 15 sekundes, un atkausējot 55–58 ◦ C temperatūrā 30 sekundes. GAPDH mRNS tika izmantota kā iekšēja atsauce tirozināzes, TRP-1 un TRP-2 mRNS. Mērķgēna ekspresijas relatīvā vērtība=2−∆∆CT. Primeru sekvences bija šādas: tirozināze-sense (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3'), tirozināze-antisense (5'-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sense (5'). ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sense (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sense (5′- tccagagccctga{3} ′), TRP-2-antisense (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sense (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) un GAPDH-antisense (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-ta -3′).

2.11. Western blotēšana

Melanocīti tika savākti un lizēti, izmantojot zīdītāju proteīna ekstrakcijas reaģentu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Visas procedūras tika veiktas saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Visas olbaltumvielu koncentrācijas tika noteiktas, izmantojot Bio-Rad proteīna testa komplektu (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV). Pēc tam proteīna supernatantam pievienoja iekraušanas buferi un sajauca. Maisījumu vārīja 10 minūtes, un olbaltumvielas tika atdalītas, izmantojot Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV) un pārnestas uz Hybond polivinilidēna difluorīda membrānu (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, ASV). Imunodekcija tika veikta, izmantojot tirozināzi (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), fosforilētu CREB (p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000) un -tubulīns (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ASV), izmantojot SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV). Membrānu inkubēja nakti ar primārajām antivielām 4 ◦C temperatūrā. Membrānai tika pievienota kazas anti-truša (IgG) sekundārā antiviela (1:5000, Cell Signaling Technology) un inkubēta istabas temperatūrā 1 stundu. Olbaltumvielu joslas tika novērotas, izmantojot uzlabotu Pierce ECL Western blotēšanas substrātu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV), un tās kvantitatīvi noteica kā mērķa proteīna joslas intensitātes attiecību pret tubulīna joslas intensitāti.

2.12. Statistiskā analīze

Visi testi tika neatkarīgi atkārtoti vismaz trīs reizes. Visi statistiskie parametri ir parādīti kā vidējā standarta kļūda (VEM). Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Danna post-hoc tests. Vērtība p < 0.01="" vai="" p="">< 0,05="" tika="" uzskatīta="" par="">

flavonoīdu tests

3. Rezultāti

3.1. Vairāku KC daļēju ekstraktu antioksidantu īpašību salīdzinājums

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 procenti) > KCF (8,7 ± 1,1 procenti) (1. E attēls).

3.2. Dzīvotspējīgu un bojātu keratinocītu, kas apstrādāti ar vairākiem daļējiem KC ekstraktiem UVA, UVB vai neapstarošanas klātbūtnē, salīdzinājums

Mēs veicām šādus eksperimentus, lai izpētītu KCR, KCS, KCL un KCF onkeratinocītu ietekmi. Pirmkārt, visi ekstrakti tika uzklāti uz HaCaT keratinocītiem UVA, UVB vai bez apstarošanas. CCK-8 analīze parādīja, ka ekstrakti būtiski nemainīja keratinocītu dzīvotspējas koncentrāciju 0,5 mg/ml. Vēlāk keratinocīti tika apstrādāti ar KCR, KCS, KCL un KCF UVA vai UVB apstarošanas klātbūtnē. UVA un UVB starojums ievērojami kavēja keratinocītu dzīvotspēju, kā parādīts CCK-8 analīzē 2.A attēlā. Tomēr mēs atklājām, ka UVA un UVB apstaroto keratinocītu dzīvotspēja palielinājās šādā secībā: KCL, KCR, KCS un KCF (2.A attēls). Mēs arī novērojām bojātos keratinocītus, mērot ekstracelulāro LDH izdalīšanos. Rezultāti parādīja, ka UVA vai UVB starojums būtiski veicināja LDH izdalīšanos; tomēr KCL, KCR, KCS un KCF ievērojami vājināja LDH izdalīšanos ar UVA vai UVB iedarbību šādā secībā (2.B attēls). Iepriekš minētie eksperimentālie rezultāti parādīja, ka UVA vai UVB starojuma antiproliferatīvā un citotoksiskā iedarbība uz keratinocītiem tika mazināta KCL, KCR, KCS un KCF secībā. Proti, KCL var atjaunot šūnu dzīvotspēju līdz kontroles līmenim.

2. attēls. KCR, KCS, KCL un KCF ekstrakta keratinocītu dzīvotspēja un citotoksicitāte UVA, UVB vai neapstarošanas klātbūtnē.

3.3. Intracelulārās ROS ražošanas salīdzinājums keratinocītos, kas apstrādāti ar vairākiem daļējiem KC ekstraktiem UVA un UVB starojuma klātbūtnē vai bez tās

Tā kā ROS intracelulārā ražošana izraisa nopietnus keratinocītu bojājumus, tie tiek uzskatīti par potenciāliem UVA vai UVB starojuma izraisītu bojājumu mediatoriem. Vairāki pētījumi liecina, ka UVA vai UVB starojums inducē endogēno ROS veidošanos [12,14]. Mūsu mērķis bija noteikt, vai ir paaugstināts endogēnais ROS līmenis UVA vai UVB apstarotajos keratinocītos. Attiecīgi mēs analizējām zondes CM-H2DCFDA intracelulārās fluorescences intensitāti, izmantojot fluorescences mikroskopiju un plūsmas citometriju. Fluorescences mikroskopijas rezultātā CM-H2DCFDA krāsošanas attēli uzrādīja nelielu krāsojumu kontroles, KCR, KCS, KCL un KCF apstrādātajos keratinocītos un ievērojamu iekrāsošanos UVA vai UVB apstarotajos keratinocītos (3.A attēls). Saskaņā ar plūsmas citometrijas kvantitatīviem rezultātiem, UVA un UVB apstarošana palielināja intracelulāro ROS līmeni keratinocītos par attiecīgi 27,2 ± 4,5 procentiem un 34,1 ± 4,2 procentiem, salīdzinot ar kontroli (5,7). ±0,2 procenti). Turklāt, līdzīgi fluorescences mikroskopijas rezultātiem, tika apstiprināts, ka KC ekstrakti nomāca intracelulāro ROS līmeni šādā secībā: KCL > KCR > KCS > KCF UVA vai UVB apstarošanas klātbūtnē (3.B attēls). Šie rezultāti liecina, ka vairāki daļēji KC ekstrakti ievērojami inhibēja keratinocītu bojājumus, samazinot endogēno ROS līmeni.

3. attēls. KCR, KCS, KCL un KCF ekstrakta ietekme uz intracelulāro ROS veidošanos UVA, UVB vai neapstarotos keratinocītos.

3.4. Ar vairākiem daļējiem KC ekstraktiem apstrādātu keratinocītu apoptozes salīdzinājums UVA un UVB starojuma klātbūtnē vai bez tā

Lai noteiktu apoptozi, kas ir uzticams keratinocītu bojājumu indikators, keratinocīti tika iekrāsoti ar aneksīnu V kombinācijā ar propīdija jodīdu. Lai pārbaudītu keratinocītu apoptozes ātrumu, tika izmantots fluoresceīna izotiocianāta (FITC) aneksīna V / mirušo šūnu apoptozes komplekts. UVA un UVB apstarošana veicināja aneksīna V krāsošanas aktivitāti, savukārt KCR, KCS, KCL un KCF samazināja aneksīna V krāsošanas aktivitātes ātrumu UVA un UVB starojuma klātbūtnē. KCR, KCS, KCL un KCF atsevišķi (0,5 mg/ml) neizraisīja aneksīna V krāsošanas aktivitāti. Kvantitatīvie plūsmas citometrijas dati parādīja, ka UVA un UVB starojums palielināja keratinocītu apoptozes līmeni par 46,3± 1,5 procenti un 48,7 ± Attiecīgi 1.0 procenti, salīdzinot ar kontroles līmeni (5.0 procenti ± 0,7 procenti). Svarīgi, ka tika apstiprināts, ka KC ekstrakti nomāca apoptozes līmeni šādā secībā: KCL > KCR > KCS > KCF UVA vai UVB starojuma klātbūtnē (4.A, B attēls). Kopumā UVA un UVB apstarošana izraisīja keratinocītu bojājumus, un vairāki daļēji KC ekstrakti mazināja keratinocītu bojājumus, ko izraisīja UV starojums.

4. attēls. KCR, KCS, KCL un KCF ekstraktu ietekme uz apoptozi UVA, UVB vai neapstarotos keratinocītos.

3.5. Intracelulārā melanīna satura un tirozināzes aktivitātes salīdzinājums melanocītos, kas apstrādāti ar vairākiem daļējiem KC ekstraktiem MSH terapijas klātbūtnē vai bez tās

Pirms KCR, KCS, KCL un KCF bioloģiskā potenciāla izpētes uz - MSH izraisītu melanoģenēzi, šūnu dzīvotspēja pēc KCR, KCS, KCL un KCF (0.5 mg/mL) apstrādes tika novērtēta, izmantojot CCK-8 tests melanocītos B16F10 ar vai bez -MSH. KCR, KCS, KCL un KCF (0,5 mg/ml) nemainīja šūnu dzīvotspēju -MSH klātbūtnē vai bez tās (5.A attēls). -MSH ir svarīgs melanogēns līdzeklis, kas var palielināt intracelulāro melanīna saturu, saistoties ar melanokortīna 1 receptoru un aktivizējot adenilāta ciklāzi. Lai izpētītu KCR, KCS, KCL un KCF ietekmi uz melanoģenēzi melanocītos, intracelulārā melanīna saturs tika noteikts ar vizuālu novērošanu un bioķīmiskiem mērījumiem. Kā parādīts 5.B attēlā, intracelulārā melanīna saturu ievērojami palielināja -MSH. Tomēr vienlaicīga ārstēšana ar KCR, KCS, KCL un KCF uzrādīja ievērojamu intracelulārā melanīna satura samazināšanos, salīdzinot ar ārstēšanu ar -MSH. Bioķīmisko mērījumu secība, kas norāda uz intracelulārā melanīna satura inhibīciju, bija šāda: KCL > KCR > KCS > KCF (5.B attēls). Intracelulārās tirozināzes aktivitātes tests tika veikts saskaņā ar intracelulāro melanīna satura testu. -MSH stimulēto melanocītu intracelulārā tirozināzes aktivitāte palielinājās, bet -MSH stimulēto melanocītu aktivitāte, kas tika ārstēta ar KCR, KCS, KCL un KCF, samazinājās. Bioķīmisko mērījumu secība, kas norāda uz intracelulārās tirozināzes aktivitātes inhibīciju, bija šāda: KCL > KCR > KCS > KCF (5.C attēls). Šie rezultāti liecina, ka vairāki daļēji KC ekstrakti ievērojami samazināja intracelulāro melanīna saturu un inhibēja tirozināzes aktivitāti, nemainot šūnu dzīvotspēju.

3.6. Tirozināzes, TRP-1 un TRP-2 transkripcijas un translācijas līmeņu salīdzinājums melanocītos, kas apstrādāti ar vairākiem daļējiem KC ekstraktiem, ja ir vai nav- MSH ārstēšana

Lai izpētītu KCR, KCS, KCL un KCF ietekmi uz melanoģenēzes marķieru (tirozināzes, TRP-1 un TRP-2) olbaltumvielu un mRNS ekspresijas līmeņu pazemināšanos, melanocīti tika apstrādāti ar KCR. , KCS, KCL un KCF -MSH klātbūtnē vai bez tās. Kā parādīts 6.A–C attēlā, tirozināzes, TRP-1 un TRP-2 mRNS līmenis ievērojami palielinājās, ārstējot ar -MSH. Turpretim, salīdzinot ar ārstēšanu ar -MSH, KCR, KCS, KCL un KCF samazināja tirozināzes, TRP-1 un TRP-2 mRNS ekspresiju. Turklāt KCR, KCS, KCL un KCF atsevišķi būtiski neietekmēja tirozināzes, TRP{10}} un TRP{11}} mRNS līmeni. Western blot analīze tika veikta sadarbībā ar reāllaika PCR. Rezultāti parādīja, ka ārstēšana ar -MSH paaugstināja tirozināzes, TRP-1 un TRP-2 proteīna ekspresijas līmeni, un šie līmeņi tika samazināti, vienlaikus ārstējot ar KCR, KCS, KCL un KCF (6. D attēls). ). Kvantitatīvās reāllaika PCR un Western blotindicating tirozināzes, TRP-1 un TRP-2 mRNS un olbaltumvielu ekspresijas inhibīcijas secība bija šāda: KCL > KCR=KCS > KCF (attēls 6). Šie rezultāti liecina, ka vairākiem daļējiem KC ekstraktiem ir potenciāls veicināt anti-melanoģenēzi, ko parādīja melanoģenēzes marķieru pazemināšanās.

3.7. Ar vairākiem daļējiem KC ekstraktiem apstrādātu melanocītu MITF ekspresijas un CREB fosforilācijas salīdzinājums MSH terapijas klātbūtnē vai bez tās

Tirozināze, TRP-1 un TRP-2 ir būtiskas melanoģenēzes procesā. To ekspresiju regulē MITFexpression un CREB fosforilācija [17,21]. Western blot analīze liecināja, ka KCR, KCS, KCL un KCF efektīvi inhibēja MITF proteīna līmeņa paaugstināšanos, ko izraisīja ārstēšana ar -MSH. Turklāt tikai KCR, KCS, KCL un KCF gandrīz neatklāja MITF proteīna ekspresiju. Kvantificēto Western blot rezultātu secība, kas norāda uz MITF proteīna ekspresijas līmeņu inhibīciju, bija šāda: KCL > KCR > KCS > KCF (7.A attēls). Turklāt KCR, KCS, KCL un KCF mainīja -MSH apstrādes ietekmi uz CREB fosforilāciju. Tikai KCR, KCS, KCL un KCF maz ietekmēja CREB fosforilāciju. Kvantificēto Western blot rezultātu secība, kas norāda uz CREB fosforilācijas līmeņu inhibīciju, bija šāda: KCL > KCR > KCS > KCF (7.B attēls). Šie rezultāti norādīja, ka vairāki daļēji KC ekstrakti vismaz daļēji nomāca melanoģenēzes inmelanocītus, izmantojot MITF ekspresiju un CREB fosforilāciju.

4. Diskusija

Ādas balināšanas popularitāte visā pasaulē pieaug, pateicoties pieaugošajam UV starojumam, un tuvākajās desmitgadēs tā, visticamāk, sasniegs lielus apmērus estētiskiem nolūkiem [8]. Kosmētikas un farmācijas tirgos ir izmantoti daudzi balinātāju veidi, piemēram, kojskābe un arbutīns. Turklāt dabiskajiem ekstraktiem tiek pievērsta arvien lielāka uzmanība to potenciālo antioksidantu, pretiekaisuma, pretaudzēju, antibakteriālo un citu aktivitāšu dēļ [26,27]. Pamatojoties uz antioksidantu un fotoaizsardzības un anti-melanoģenēzes īpašībām, ir izstrādāti vairāki kosmētikas un farmācijas kandidāti. Ir labi zināms, ka šīs balināšanas kandidātu īpašības ir neaizstājams kosmētikas un farmācijas pētniecības un attīstības veicinātājs [28]. TDM ir daudzkomponentu un vairāku mērķu īpašības, un tas ievērojami uzlabo cilvēka bioloģisko efektivitāti un dzīves kvalitāti [29]. Mūsdienu fitoķīmiskie pētījumi liecina, ka KC satur dažādas sastāvdaļas, un galvenās sastāvdaļas ir lignāni un terpenoīdi [30]. Ir identificēti vairāk nekā 202 savienojumi, tostarp dibenzocikloktadiēna lignāni, spirobenzofuranoīdu dibenzociklooktadiēna lignāni, arilnaftalīna lignāni, kadlongilaktona triterpenoīdi un seskviterpenoīdi [31,32]. KC žāvētām saknēm, kātiem un lapām ir plašas tradīcijas izmantot TDM, lai ārstētu reimatoīdo artrītu, divpadsmitpirkstu zarnas čūlu, kuņģa-zarnu trakta traucējumus un ginekoloģiskas problēmas. Žāvētas KC saknes, kas attīra siltumu un izvada toksīnus, izraisot diurēzi tūskas noņemšanai. KC augļus pārsvarā lieto svaigu augļu, sulu un augļu vīna veidā, kas liecina, ka tie ir labvēlīgi cilvēku veselībai [7,33,34]. Iepriekšējie pētījumi arī ir parādījuši, ka tas ir bagāts ar bioaktīvām sastāvdaļām, piemēram, lignāniem, triterpenoīdiem, flavonoīdiem, fenolskābēm, steroīdiem un aminoskābēm, kurām ir augsta uzturvērtība un ārstnieciska vērtība [3,35]. Šajā pētījumā tika iegūtas dažādas KC daļas. Proti, kopējais polifenolu un flavonoīdu saturs KC lapās un saknēs bija daudz augstāks nekā stublāju un augļu saturs. Lapas un saknes satur vairāk nekā divas reizes vairāk polifenolu un flavonoīdu nekā stublāji un augļi. Rezultātā mēs uzskatām, ka kopējie polifenoli un flavonoīdi būtiski veicina KC fotoaizsargājošo un anti-melanogēno iedarbību.

UV starojuma izraisītā ādas fototoksicitāte galvenokārt ir saistīta ar šūnu citotoksicitāti, intracelulāro ROS uzkrāšanos un apoptozi keratinocītos. Tāpēc ir saprātīgāk koncentrēties uz šūnu citotoksicitātes, intracelulārās ROS uzkrāšanās un apoptozes kavēšanu UVA un UVB apstarotajos keratinocītos [36, 37]. Kā aprakstīts šajā pētījumā [10,38], iejaukšanās ar KC ekstraktiem fotocitotoksicitātes (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) rezultātos parādīja, ka KC ekstrakti ievērojami samazināja šūnu citotoksicitāti, intracelulāro ROS uzkrāšanos un apoptoze. Saskaņā ar iepriekšējiem rezultātiem KC lapu un sakņu fotoaizsardzības efekts bija daudz augstāks nekā stumbra un augļu iedarbība. Turklāt mūsu rezultāti liecināja, ka KC ekstrakti uzrāda iepriekš minētos efektus, veicinot antioksidantu aktivitāti. Melanoģenēzi bieži novēro pēc UV apstarošanas, un tā galvenokārt ir saistīta ar pigmentāciju vai hiperpigmentāciju [39]. Saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem melanoģenēzes ierosināšanas metode, izmantojot -MSH, ir plaši atzīta un piemērota. Tāpēc šis pētījums tika balstīts uz melanocītu modeļa izveidi, kas stimulēts ar -MSH [24,39]. Mēs noskaidrojām, ka KC ekstrakti nomāc -MSH stimulēto intracelulāro melanīna saturu un tirozināzes aktivitāti. Turklāt KC ekstrakti pazemināja melanoģenēzes marķieru, piemēram, tirozināzes, TRP-1 un TRP-2, transkripciju un translāciju -MSH stimulētos melanocītos. Turklāt mēs pētījām MITF proteīna ekspresiju un CREB fosforilāciju -MSH stimulētos melanocītos. Tāpat šajā pētījumā mēs atklājām, ka KC ekstrakti nomāc -MSH-mediētu MITF proteīna ekspresiju un CREB fosforilāciju melanocītos. Saskaņā ar fotoaizsardzības rezultātiem KC lapu un sakņu anti-melanogēnā iedarbība bija daudz augstāka nekā stublāju un augļu iedarbība.

cistanche šķēles

Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, noklikšķiniet šeit.

5. Secinājumi

Kopumā šajā pētījumā tika konstatēta KC ekstrakta iespējamā fotoaizsargājošā un anti-melanogēnā iedarbība. KC ekstrakts ar augstu polifenolu un flavonoīdu saturu var iedarboties uz keratinocītiem un melanocītiem pret fotoaizsardzību un anti-melanogēnu iedarbību. Šis pētījums sniedz pamatojumu un izpētes stratēģiju kosmētiskām un farmaceitiskām iejaukšanām dabīgiem balinošiem un fotoaizsargājošiem līdzekļiem.