Fitoķīmiskā analīze, in vitro pretproliferācijas līdzeklis, antioksidants, 1. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Fons:Rumex rothschildianus ir vienīgais pārstāvis no unikālas Rumex ģints, Polygonaceae dzimtas. Šī suga ir ļoti reta neliela divmāju suga, kas ir endēmiska Palestīnai un ko tradicionāli izmanto kā pārtiku un dažādu slimību ārstēšanai. Tāpēc pašreizējās izmeklēšanas mērķis bija pārbaudīt četru R. rothschildianus lapu šķīdinātāju frakciju ķīmiskās sastāvdaļas, antioksidantus, anti-a-amilāzi, anti-a-glikozidāzi, paredzēt un citotoksisku iedarbību.

Metodes:R. rothschildianus lapu žāvētais pulveris tika ekstrahēts četros šķīdinātājos ar dažādu polaritāti. Ekstraktu sastāvdaļu noteikšanai tika veikti vairāki kvalitatīvi un kvantitatīvi fitoķīmiskie testi. Kolorimetriskā analīze tika izmantota fenolu, flavonoīdu un tanīnu kvantitatīvai noteikšanai. Tika veikti in vitro testi, lai novērtētu ekstraktu antioksidantu, anti-a-amilāzes, anti-a-glikozidāzes iedarbību un paredzētu inhibējošās aktivitātes, kā arī citotoksicitāti ar MTS testu pret dzemdes kakla karcinomas šūnu līniju (HeLa) un krūts vēža šūnu līniju. (MCF7).

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Rezultāti:R. rothschildianus lapu acetona frakcija bija visnozīmīgākāantioksidantsaktivitāte, jo tajā ir visaugstākais flavonoīdu un fenolu saturs, ar ICso vērtību 6,3±0,4 ug/ml, salīdzinot ar 3,1±0,9 ug/ml Trolox, un lipāzes inhibīcijas aktivitāte acetona frakcija uzrādīja visspēcīgāko aktivitāti ar ICso vērtību 26,3±{{10}},6 ug/ml, salīdzinot ar orlistata pozitīvās kontroles ICso 12,3 ug/ml. Tas pats ekstrakts bija visspēcīgākais a-amilāzes un a-glikozidāzes inhibitors ar ICso vērtībām attiecīgi 19,1±0,7 ug/ml un 54,9±0,3 ug/ml, salīdzinot. līdz 28,8, 37,1±0,3 ug/un akarbozes, attiecīgi. Heksāna frakcija uzrādīja 99,9% HeLa šūnu inhibīciju un 97,4% MCF7 šūnu inhibīciju.

Secinājums:R. rothschildianus lapu acetona frakcija varētu būt bioaktīvo savienojumu avots oksidatīvā stresa ārstēšanai. Tāpat heksāna frakcija norāda uz daudzsološo R. rothschildianus pretvēža potenciālu. Skaidrs, ka šīm sākotnējām indikācijām ir nepieciešama turpmāka potenciāli aktīvo savienojumu attīrīšana un, visbeidzot, in vivo pētījumi, lai noteiktu to efektivitāti.

Atslēgvārdi:Rumex rothschildianus, antioksidants, lipāze, amilāze, trolokss, fitoķīmija, antiproliferatīva darbība

Fons

Augi ir izmantoti kā terapija kopš seniem laikiem. Saknes, sēklas, miza, lapas un ziedi ir izmantoti ārstniecības nolūkos. Mūsdienās ir pieejamas sintētiskās zāles, kas ir efektīvas daudzu slimību ārstēšanā; tomēr daži cilvēki joprojām dod priekšroku augu izcelsmes zālēm, jo ​​tās tiek uzskatītas par mazāk kaitīgām cilvēka ķermenim [1,2]. Ārstniecības augi pēc definīcijas ir fitoķīmisko savienojumu avots, kam piemīt ārstnieciskas darbības. Šīs īpašības ir atkarīgas no dažādu sekundāro metabolītu, piemēram, fenolu, terpenoīdu un alkaloīdu, klātbūtnes [3]. Rumex rothschildianus Aarons. ir vienīgais Rumex ģints, Polygonaceae dzimtas, unikālas daļas pārstāvis. Šī suga ir ļoti reta neliela divmāju suga, kas ir endēmiska Palestīnā. Tā vidējais augstums ir 45 cm, un tam raksturīgi stāvi kāti ar radikālām kātiņa lapām, kas ir īsi smailas pie pamatnes un īsi asinātas virsotnē. Ziedu diametrs ir 3-4 mm, savukārt ziedi ir aptuveni 2 mm diametrā ar korozijas membrānas slāni [4]. Rumex spp. ir plaši izplatīti dažādos Turcijas reģionos, un tos pārstāv 22 sugas. Dažas no visizplatītākajām sugām ir R.patia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus un R. caucasicus ir daudzgadīgi augi, kas izplatīti Anatolijas vidienē un austrumu daļā augstumā {{10 }} m virs jūras līmeņa. Rumex ģints ir plaši izmantota tradicionālajā medicīnā Turcijā, lai ārstētu tādus traucējumus kā aizcietējums, caureja un ekzēma [5, 6]. Ģints satur arī caureju veicinošu, diurētisku, pretdrudža, brūču dzīšanas un pretiekaisuma iedarbību. Daudzi cilvēki Turcijas austrumu daļā izmanto Rumex spp. jaunās lapas. kā konservants sierā, kā arī piešķir ēdienam aromātu [7].

Ir veikti dažādi pētījumi par Rumex sugām, piemēram, dažām sugām ziņots par pretmikrobu iedarbību. Dažas bioaktīvas fitoķīmiskas vielas iepriekš ir atrastas Rumex vicarious L, piemēram, karotinoīdi, tokoferoli, polifenoli, flavonoīdi un askorbīnskābe, kam ir antioksidantu un dabisko detoksikācijas līdzekļu loma. Antioksidantu fitoķīmisko vielu, piemēram, karotinoīdu, uzņemšana ar uzturu,fenoli, unflavonoīdivar aizsargāt pret cilvēku neinfekcijas slimībām, piemēram, vēzi, sirds un asinsvadu traucējumiem un citām veselības problēmām, kas saistītas ar oksidatīvo stresu [5, 8]. Ir zināms, ka kaitīgajiem brīvajiem radikāļiem ir svarīga loma daudzu nopietnu veselības problēmu, piemēram, vēža, sirds un asinsvadu slimību, reimatoīdā artrīta, kataraktas,Alcheimera slimībaun citas ar novecošanu saistītas deģeneratīvas slimības. Antioksidanti ir labvēlīgi komponenti, kas neitralizē šos brīvos radikāļus, pirms tie var uzbrukt šūnām, un tādējādi novērš šūnu proteīnu, lipīdu un šūnu bojājumus.ogļhidrāti. Cilvēku slimību ārstēšanai ir ierosināti dažādi gan dabiskie, gan sintētiskie antioksidanti. Šāda interese par antioksidantu lomu cilvēka veselībā rosinājusi veikt pētījumus pārtikas zinātnes un ārstniecības augu jomās, novērtējot ārstniecības augu kā antioksidantu funkciju. Antioksidanta darbība ietver brīvo radikāļu attīrīšanas spēju, lipīdu peroksidācijas inhibīciju, metālu jonu helātu veidošanās spēju un arī reducēšanas spēju [9,10].

Vēzis ir viena no globālākajām veselības aprūpes problēmām. Jaunu pretvēža zāļu izstrāde un atklāšana joprojām ir ārkārtīgi svarīga dažādu faktoru dēļ. Šie faktori ietver ārstēšanu, kas var izraisīt nopietnas blakusparādības vai var būt diezgan dārga. Joprojām ir ļoti vēlamas alternatīvas, kas ir bioloģiski drošākas un lētākas [11-14].

Vairākas augu sugas tiek uzskatītas par potenciāliem bioaktīvo molekulu avotiem, piemēram, atropīns no Belladonna lapām, kokaīns no koka lapām, vinkristīns no Vinca auga un daudzas citas, kurām joprojām ir svarīga loma mūsdienu medicīnā [15, 16].

Noderīgu terapeitisko efektu var iegūt, sajaucot ārstniecības augos esošos sekundāros produktus. Šie savienojumi lielākoties ir sekundāri metabolīti, piemēram, alkaloīdi, steroīdi, tanīni, flavonoīdi un fenoli, kas tiek sintezēti un nogulsnēti noteiktās šo augu daļās [17,18]. Šajā pētījumā tiek pētītas dažādu no R. rothschildianus lapām iegūto frakciju anti-a-amilāzes, anti- -glikozidāzes, antilipāzes, antiproliferatīvās un antioksidantu aktivitātes in vitro.

Metodes

Augu materiāls, ķīmiskās vielas un instrumenti

R. rothschildianus lapas tika novāktas no Palestīnas rietumu reģioniem no 2018. gada februāra līdz martam. Tās identificēja Dr. Nidals Džaradats no An-Najah Nacionālās universitātes Farmakognozijas laboratorijas, izmantojot kupona parauga kodu Pharm-PCT{3} }. Visas ķīmiskās vielas tika iegādātas no Sigma-Aldrich. Spektrofotometrs-UV/Visible (Jenway grāds 7135, Stafordšīra, Apvienotā Karaliste), filtrpapīri (Whitman No. 1, Vašingtona, ASV), kratītāja ierīce (Memmert 531-25-1, Stokholma, Zviedrija), rotācijas aparāts (Heidolph) -VV 2000, Schwa-bach, Vācija), dzirnaviņas (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Ķīna), elektroniskais balanss (Radwag, AS 220/c/2, Toruņska, Polija), saldētavas žāvētājs-BT85 Tika izmantots (Millrock Technology, Ķīna) un krio-eksikators (Mill-rock tehnoloģija, BT85, Kingstona, ASV).

Ekstraktu sagatavošana un frakcionēšana

R. rothschildianus lapu žāvēto pulveri ekstrahēja, pievienojot šķīdinātājus secīgi, pamatojoties uz to polaritāti, sākot ar nepolāru šķīdinātāju heksānu un pēc tam acetonu (polāru aprotisku organisko šķīdinātāju), metanolu (polāro spirtu) un visbeidzot destilētu ūdeni (a polārais protoniskais šķīdinātājs). Katrai ekstrakcijai apmēram 25 g maltu žāvētu lapu tika ievietotas 0,51 heksānā uz 72 stundām kratītājā ar 100 apgriezieniem minūtē 25 grādos. Pirmkārt, heksāns tika aizstāts ar 0,5 l acetonu, un pēc tam aizstāšana ietvēra līdzvērtīgus metanola un ūdens daudzumus. Inkubācijas šķīdinātājos bija tādas, kā aprakstīts iepriekš attiecībā uz heksānu. Katra organiskā frakcija tika filtrēta un koncentrēta vakuumā ar rotācijas iztvaicētāju, savukārt ūdens frakcija tika žāvēta, izmantojot saldēšanas žāvētāju. Visbeidzot, visas neapstrādātās frakcijas tika uzglabātas 4 grādu temperatūrā [19, 20].

Katras frakcijas iznākums tika aprēķināts, izmantojot šādu formulu:

Iepriekšējs fitoķīmiskais novērtējums

Lai identificētu aktīvos sekundāros metabolītus, tika veikti R. rothschildianus lapu fitoķīmiskās skrīninga testi četrās frakcijās. Kvalitatīvie rezultāti tika izteikti kā ( plus ) par bioaktīvo fitoķīmisko vielu klātbūtni un (-) par bioaktīvo fitoķīmisko vielu neesamību[10,21].

Kopējā fenola satura (TPC) noteikšana

Procedūra TPC noteikšanai tika balstīta uz Cheung et al. TPC tika izteikts miligramos gallskābes ekvivalenta uz gramu lapu sausā svara (mg GA/g sausnas svara). Svaigi pagatavots 7,5% nātrija karbonāta šķīdums tika pagatavots, ievietojot 7,5 g Na2CO3 mērkolbā un noregulējot tilpumu līdz 100 ml ar destilētu ūdeni. Standarta standartšķīdumu (gallskābes šķīdumu) sagatavoja, izšķīdinot 100 mg gallskābes destilētā ūdenī līdz galīgajam tilpumam 100 ml. No tā tika veikta sērijveida atšķaidīšana, lai iegūtu gallskābes šķīdumus 100, 70, 50, 40 un 10 ug/ml). Lapu frakciju izejas šķīdumus sagatavoja, izšķīdinot 100 mg augu ekstrakta destilētā ūdenī, un noregulēja līdz 100 ml kopējam tilpumam. Reakcijas maisījumus sagatavoja, sajaucot 0,5 ml katras frakcijas šķīduma ar 2,5 ml 10% Folin-Ciocalteu reaģenta, kas tika izšķīdināts ūdenī ar 2,5 ml 7,5% nātrija bikarbonāta. Paraugu mēģenes tika inkubētas 45 minūtes 45 grādu temperatūrā. Pēc tam katra absorbcija tika mērīta spektrofotometrā pie viļņa garuma 765 nm. Darba paraugi tika sagatavoti trīs eksemplāros katram analītiskajam izmēģinājumam, no kuriem tika aprēķinātas vidējās un standartnovirzes vērtības [21].

Kopējā flavonoīdu satura (TFC) noteikšana

TFC četrās R. rothschildianus lapu frakcijās tika novērtēts, izmantojot rutīna (standarta atsauces savienojuma) kalibrēšanas līkni. Rezultāti tika izteikti kā rutīna ekvivalenta miligrami uz gramu lapu ekstrakta sausā svara (mg RU/g sausnas masas). Rutīna kalibrēšanas līkne tika izveidota, izmantojot sērijveida atšķaidījumus, kas iegūti no izejas šķīduma 1{{10}}0 ug/ml. Lai pagatavotu izejas šķīdumu, 10 mg rutīna izšķīdināja 10 ml destilēta ūdens un pēc tam atšķaidīja līdz 100 ml. Pēc tam izejas šķīdums tika atšķaidīts, lai nodrošinātu rutīnu koncentrācijās 10, 30, 40, 50, 70 un 100 ug/ml. Darba šķīduma pagatavošanai 0,5 ml katras frakcijas šķīduma tika sajaukti ar 3 ml metanola, 0,2 ml 10% AlCl3, 0,2 ml 1 M kālija acetāta un 5 ml destilēta ūdens, un pēc tam inkubēja istabas temperatūrā 30 minūtes. Iepriekšējās darbības tika atkārtotas katrai frakcijai, pēc tam absorbcija tika mērīta pie viļņa garuma 415 nm. Tukšā parauga kontrolei parauga ekstrakta vietā tika izveidots darba šķīdums ar destilētu ūdeni. Katram analītiskajam izmēģinājumam paraugi tika sagatavoti trīs eksemplāros, no kuriem tika aprēķinātas vidējās un standartnovirzes vērtības [22].

Kopējā tanīna satura (TTC) noteikšana Sun et al. tika izmantota, lai noteiktu TTC četrās R. rothschildianus lapu frakcijās, kas ir visbiežāk izmantotā procedūra. Katehīns tika izmantots kā atsauces savienojums, lai izveidotu kalibrēšanas līkni. Tika sagatavota 100 ug/ml izejviela metanolā, no kuras tika izveidota atšķaidījumu sērija, lai iegūtu katehīna koncentrāciju 10, 30, 50, 70 un 100 ug/ml. Svaigi tika pagatavots 4 procentu vanilīna šķīdums metanolā. Frakciju izejas šķīdumus ar 100 ug/ml pagatavoja, kā šķīdinātāju izmantojot metanolu. Darba šķīdumam 0,5 ml katras frakcijas šķīduma tika sajaukti ar 3 ml vanilīna šķīduma un 1, 5 ml koncentrēta HCl. Maisījumam ļāva nostāvēties 15 minūtes, un pēc tam tika mērīta absorbcija pie 500 nm, izmantojot darba šķīdumu, kas parauga ekstrakta vietā iestatīts ar metanolu kā tukšo paraugu. Visi darba paraugi tika analizēti trīs eksemplāros, no kuriem tika aprēķinātas vidējās un standartnovirzes vērtības. Kopējais tanīns katrā frakcijā tika izteikts katehīna ekvivalentos (mg CAE/g lapu sausnas masas)[23].

Antioksidantu aktivitātes metode

Lai noteiktu antioksidantu aktivitāti dažādās R. rothschildianus lapu frakcijās, tika izmantots brīvo 2,2-difenil-pikrilhidrazila (DPPH) radikāļu atrašanas tests. Katras augu frakcijas izejas šķīdums 1000 ug/ml tika sagatavots metanolā. Turklāt tika sagatavots arī 1000 ug/ml Trolox šķīdums (atsauces standarts). Atšķaidījumu sērija tika sagatavota no katras frakcijas izejas šķīdumiem, sniedzot sešus sērijas atšķaidījumus ar 2, 5, 10, 20, 50 un 100 ug/ml. Viens ml katra ekstrakta atšķaidījuma tika sajaukts ar 1 ml 0,002 g/ml DPPH metanolā. Pievienoja vienu ml metanola, lai iegūtu galīgo darba tilpumu 3 ml. DPPH šķīdums bija svaigi pagatavots, jo tas bija ļoti jutīgs pret gaismu. Sērijas koncentrāciju tukšā kontrole bija DPPH metanolā attiecībā 1:2, nepievienojot ekstraktu. Visi darba šķīdumi tika inkubēti istabas temperatūrā (25 grādi) tumsā apmēram 30 minūtes. Pēc tam optiskais blīvums tika mērīts ar spektrofotometru pie viļņa garuma 517 nm. Lai aprēķinātu DPPH inhibīcijas procentuālo daudzumu katrai augu frakcijai, izmantojot Trolox kā standarta savienojumu, tika izmantots šāds vienādojums:

kur Ag ir tukšā šķīduma reģistrētā absorbcija un Ats ir pārbaudītā parauga šķīduma reģistrētā absorbcija [21].

Cūku aizkuņģa dziedzera lipāzes inhibīcijas tests

No katras augu frakcijas tika izgatavoti izejas šķīdumi ar 500 ug/ml 10 procentu DMSO. No tiem tika izveidota atšķaidīšanas sērija ar piecām koncentrācijām 50, 100, 200, 300 un 400 ug/ml. 1 mg/ml cūku aizkuņģa dziedzera lipāzes izejas šķīdums Tris-HCl buferšķīdumā tika pagatavots svaigi tieši pirms lietošanas. Substrāts, p-nitrofenilbutirāts (PNPB) tika sagatavots, izšķīdinot 20,9 mg 2 ml acetonitrila. Katram darba šķīdumam 0,1 ml cūku aizkuņģa dziedzera lipāzes sajauca ar 0,2 ml augu frakciju no katra atšķaidīšanas sērijas dalībnieka. Tika pievienots Tris-HCl, lai darba šķīdumu gala tilpums būtu 1 ml, un tos inkubēja 37 ° C temperatūrā 15 minūtes. Pēc inkubācijas katrai mēģenei pievienoja 0, 1 ml p-nitrofenilbutirāta šķīduma. Pēc tam maisījumu inkubēja vēl 30 minūtes 37 grādu temperatūrā. Aizkuņģa dziedzera lipāzes aktivitāte tika noteikta, mērot PNPB hidrolīzi p-nitrofenolātā pie 410 nm, izmantojot UV spektrofotometru. Tāda pati procedūra tika atkārtota, izmantojot orlistatu kā standarta atsauces savienojumu. Lipāzes inhibīcijas procentuālais daudzums ar augu frakcijām tika aprēķināts ar šādu vienādojumu:

kur Ap ir tukšā šķīduma reģistrētā absorbcija un Ats ir pārbaudītā parauga šķīduma reģistrētā absorbcija [24]. a-amilāzes inhibējošais tests

Katras frakcijas A100 mg NaH-PO4,0,006M NaCl, pH 6,9, lai iegūtu galīgos izejas šķīdumus ar koncentrāciju 1000 ug/ml. No tiem tika sagatavoti šādi atšķaidījumi ar 10, 50, 70, 100 un 500 ug/ml, kā šķīdinātāju izmantojot 10 procentu DMSO. 0,2 ml tilpums 2 vienības/ml cūku aizkuņģa dziedzera amilāzes tika sajaukts ar 0,2 ml

augu frakcija un tika inkubēta 10min 30 grādu temperatūrā. Pēc inkubācijas pievienoja 0,2 ml svaigi pagatavota 1% cietes šķīduma ūdenī, un pēc tam mēģenes inkubēja vēl vismaz trīs minūtes. Šajā brīdī reakcija tika apturēta, pievienojot 0,2 ml 3,5-dinitrosalicilskābes (DNSA) krāsas reaģenta un tika atšķaidīta ar 5 ml destilēta ūdens, pēc tam karsējot 90 grādu temperatūrā 10 minūtes ūdenī. vanna. Pēc tam maisījumu atdzesēja līdz istabas temperatūrai, un absorbciju mēra pie 540 nm. Tukšo kontroli sagatavoja, izmantojot tos pašus daudzumus, kas aprakstīti iepriekš, bet aizstājot augu frakciju ar 0, 2 ml buferšķīduma. Akarboze tika izmantota kā standarta atsauce, ievērojot iepriekš aprakstīto procedūru. a-amilāzes inhibējošā aktivitāte tika aprēķināta, izmantojot šādu vienādojumu:

kur Ag ir tukšā parauga absorbcija un Ar ir testa parauga absorbcija [25].

Šis raksts ir iegūts no Jaradat et al. BMC komplementārā medicīna un terapijas (2021) 21:107