Pinocembrin uzlabo pēcinfarkta sirds mazspēju, aktivizējot Nrf2/HO-1 signalizācijas ceļu, 1. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstrakts

Fons:Oksidatīvais stress ir svarīgs sirds mazspējas progresēšanas faktors. Pašreizējais pētījums tika veikts, lai noskaidrotu, vai pinocembrīns spēj uzlabot sirds mazspēju pēc infarkta (PIHF) un pamatā esošos mehānismus.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Metodes:Žurkām tika veikta kreisās priekšējās dilstošās artērijas nosiešana, lai izraisītu miokarda infarktu, un pēc tam 6 nedēļas tika audzētas, lai izraisītu hronisku sirds mazspēju. Pēc tam pinocembrins tika ievadīts katru otro dienu 2 nedēļas. Ietekme tika novērtēta ar ehokardiogrāfiju, Western blot, Masona krāsošanu, bioķīmiskiem izmeklējumiem, imūnhistoķīmiju un fluorescenci. In vitro mēs arī kultivējām H9c2 kardiomiocītus un sirds miofibroblastus, lai vēl vairāk liecinātu par mehānismiem.

Rezultāti:Mēs noskaidrojām, ka PIHF izraisīta sirds funkciju pasliktināšanās tika ievērojami uzlabota, ievadot pinocembrīnu. Turklāt ārstēšana ar pinocembrīnu arī mazināja kolagēna nogulsnēšanos un palielināja asinsvadu endotēlija augšanas faktora receptoru 2 infarkta pierobežas zonā, kā arī novājināja apoptozi, kas bija saistīta ar oksidatīvā stresa mazināšanos, par ko liecina reaktīvo skābekļa sugu (ROS) samazināšanās sirds audos. un malondialdehīds (MDA) serumā, un superoksīda dismutāzes (SOD) palielināšanās. Tam sekoja ar kodolfaktora eritroīdo 2-saistītā 2. faktora (Nrf2)/hēma oksigenāzes-1(HO-1) ceļa regulēšana. In vitro eksperimentos mēs atklājām, ka specifisks Nrf2 inhibitors būtiski mainīja pinocemrīna radītās sekas, tostarp antioksidantu, anti-apoptozes, antifibrozes un neovaskularizāciju, kas vēl vairāk liecināja par PIHF uzlabošanos ar pinocembrīnu Nrf2/HO-1 no ceļa atkarīgā veidā.

Cistanche var uzlabot imunitāti

Secinājums:Pinocembrin uzlaboja sirds funkcijas un PIHF izraisīto pārveidošanu, izmantojot ROS attīrīšanu un Nrf2/HO-1 ceļa aktivāciju, kas vēl vairāk mazināja kolagēna šķiedru nogulsnēšanos un apoptozi, kā arī veicināja angioģenēzi.

Atslēgvārdi:Pinokembrīns, sirds mazspēja, oksidatīvais stress, Nrf2/HO-1

Ievads

Sirds mazspēja (HF), ko raksturo virkne terminālu klīnisku sindromu, ko izraisa sirds strukturāli un/vai funkcionāli traucējumi, joprojām ir globāls veselības slogs, un miokarda infarkts (MI) ir galvenais cēlonis (Ziaeian un Fonarow 2016; Galli un Lombardi 2016; Rengo et al.2013). Neskatoties uz lielajiem sasniegumiem HF ārstēšanā un aprūpes kvalitātē, tiek lēsts, ka izplatība ir 37,7 miljoni cilvēku katru gadu visā pasaulē, kā arī 50% mirstība 5 gadus pēc HF diagnozes (Go et al. .2014). Pašreizējā dilemma daļēji varētu būt saistīta ar to, ka pēcinfarkta HF (PIHF) sastāv no dažādiem patofizioloģiskiem mehānismiem, uz kuriem pašreizējās terapeitiskās metodes nevar pilnībā atsaukties.

Uzkrājošie pētījumi ir parādījuši, ka oksidatīvais stress (OS) galvenokārt ir saistīts ar PIHF patoloģisku progresēšanu (Dubois-Deruy et al. 2020; Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019). OS, ko galvenokārt raksturo Ir pierādīts, ka pārmērīga brīvo radikāļu/reaktīvo skābekļa sugu (ROS) uzkrāšanās, kas satur hidroksilradikāļus, superoksīdu, slāpekļa oksīdu utt. (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), ir pierādīts, ka tas spēj izraisīt lipīdu oksidatīvo modifikāciju vai bojājumus. , olbaltumvielas un DNS, ar organellu traucējumiem, iekaisumu, apoptozi miocītos un intersticiālu fibrozi (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Hermida et al. 2018). Pateicoties daudzkārtējai ROS kaitīgajai iedarbībai, PIHF terapijās ir ņemti vērā antioksidanti, kuru mehānismi sastāv no tiešas ROS izvadīšanas un/vai antioksidantu aizsardzības stimulēšanas, kas satur glutationu, superoksīda dismutāzi (SOD), katalāzi utt. Habtemar-iam 2019). Tomēr bija žēl, ka dažu antioksidantu, ne E vitamīna (Lee et al.2005), ne resveratrola (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014) lietošana nesniedza gandarījumu sirds un asinsvadu slimību terapijā. par ko liecina neveiksme sirds funkciju uzlabošanā. Tāpēc PIHF terapijā ir nepieciešami efektīvāki antioksidanti.

Pinocembrin (Pino) ​​(ķīmiskā struktūra parādīta 1.A attēlā) ir dabisks flavonoīdu savienojums, ko papildus var ekstrahēt no medus, propolisa un vairākiem citiem augiem (Lan et al.2015; Rasul et al.2013). mākslīgā sintēze (Costa un Leitao 2011), radot pretiekaisuma, antibakteriālu, pretvēža un pretvēža iedarbību (Rasul et al. 2013; Ye et al. 2019), kā arī uzsvērtu antioksidantu efektu (Kim et al. 2020; Sangweni et al. .2020). Kā tika parādīts iepriekš, Pino fenola struktūra, kas ir atbildīga par tiešu ROS izvadīšanu, kā arī fenola un nefenola struktūras, kas pastiprina antioksidantu aizsardzību (Habtemariam 2019), nosaka Pino antioksidantu iedarbību, ar kuru Pino tika pētīts un izmantots plašā mērogā. dažādas slimības, piemēram, neirodeģeneratīvas slimības, ateroskleroze, doksorubicīna izraisīta kardiomiocītu toksicitāte (Sangweni et al. 2020; Sang et al. 2012; Liu et al. 2014). Tomēr, ņemot vērā to, ka vairāki miokarda infarkta un HF antioksidanti ir nederīgi vai nepietiekami, lai tos pārvērstu klīniskā lietošanā, joprojām ir slikti saprotams, vai Pino antioksidanta iedarbība var tikt īstenota PIHF terapijā. Tādējādi šis pētījums tika veikts, lai noskaidrotu, vai Pino ievadīšana var labvēlīgi ietekmēt PIHE, solot būt jauna vai, ja ne dominējoša, bet vismaz papildu ārstēšana.

Metodes un materiāli

Dzīvnieku modelis un eksperimenta protokols

56 Sprague-Dawley žurku tēviņi, kas iegādāti no Ķīnas Trīs aizu universitātes dzīvnieku eksperimentu centra,

tika audzēti Uhaņas Nr.3 slimnīcas dzīvnieku pārvaldē. Visi eksperimenti tika oficiāli atļauti un veikti Hubei Key Laboratory of Cardiology, ievērojot ASV Nacionālo veselības institūtu publicēto Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatu (NIH Publikācijas Nr.{1}}, pārskatīta 1996. gadā).

Žurkām sākotnēji tika veikta kreisās priekšējās lejupejošās koronārās artērijas (LAD) nosiešana vai fiktīva operācija. Īsumā, žurkas tika anestēzētas ar 3% pentobarbitālu (2 ml/kg; Sigma-Aldridge, Sentluisas štatā, ASV, intraperitoneāli), kam sekoja trahejas intubācija un elpošanas atbalsts (plūdmaiņas tilpums: 5-10 ml, ātrums: 70 reizes minūtē). Pēc tam tika veikta sirds iedarbība, un LAD tika ligatēts ar 7-0 monopavedienu neilona šuvēm. Virsotnes bāluma vai ST segmenta pacēluma parādīšanās elektrokardiogrammas I vadā norādīja uz MI ierosināšanu. Fiktīvajai operācijai tika veiktas identiskas procedūras, izņemot LAD nosiešanu. Penicilīns (200,000 SV) tika injicēts intramuskulāri vienu reizi dienā nedēļu pēc operācijas.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 procenti; Sigma-Aldridge) vai tāds pats tilpums fizioloģiskā šķīduma tika injicēts intravenozi caur astes vēnu katru otro dienu 2 nedēļas. Deva attiecas uz iepriekšējo pētījumu (Lan et al.2017). Protokols tika ilustrēts 1.B attēlā.

Kontroles pozitīvās kontroles žurkas saturēja 3 grupas: viltus plus fizioloģiskais šķīdums (fiktīva grupa); LAD ligation plus fizioloģiskais šķīdums (HF grupa); LAD ligācija plus enalaprils (HF plus ACEI grupa). Žurkām tika veiktas atbilstošās operācijas, izņemot to, ka HF plus ACEI grupas žurkas tika barotas iekšķīgi ar enalaprilu 20 mg/kg.

Ehokardiogrāfijas mērījumi

Sirds funkcijas tika novērtētas ar transtorakālo ehokardiogrāfiju, izmantojot ultraskaņas attēlveidošanas sistēmu (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Kanāda), kā iepriekš tika ziņots mūsu grupā (Fo et al.2020). Kreisā kambara iekšējā dimensija beigu diastoliskajā stadijā (LVIDd) un beigu sistoliskā stadijā (LVID), kreisā kambara beigu sistoliskais un beigu diastoliskais tilpums (LVESV un LVEDV) tika reģistrēts ar divdimensiju M režīma ehokardiogrammām vismaz 3 secīgi cikli katrai žurkai. Pēc tam tika aprēķināta kreisā kambara izsviedes frakcija (LVEF) un frakcionālais saīsinājums (FS), kas atspoguļoja sistolisko funkciju.

Parauga sagatavošana

Pēc Pino un ehokardiogrāfijas testu ievadīšanas žurkas atkal tika anestēzijas. Vairāk nekā 2 ml venozo asiņu no astes vēnas tika uztverti etilēndiamīntetraetiķskābi (EDTA) saturošās vakuuma asiņu savākšanas mēģenēs ar secīgu centrifugēšanu ar ātrumu 3000 apgr./min 15 minūtes un 4 °C temperatūrā, kam sekoja izolēšana seruma supernatants un saglabāšana-80 "C. Pēc tam sirdis tika ātri novāktas. Katras sirds infarkta robežzonas daļa tika nogriezta un sasaldēta šķidrā slāpeklī Western blot analīzei, bet pārējie sirds audi tika fiksēti 4. procenti paraformaldehīda ilgāk par 24 stundām.

Masona krāsojums

Mēs veicām Masona krāsošanu, lai noteiktu kolagēna nogulsnēšanos infarkta robežas zonā. Ar paraformaldehīdu fiksētos kambarus iestrādāja parafīns un pēc tam sagriež 5- μm sekcijās. Pēc tam sekcijas tika iekrāsotas ar Masson trihromu, kur kolagēns tika krāsots zilā krāsā, miokards rozā un kodols melnā krāsā. Kolagēna nogulsnēšanās proporcija tika aprēķināta ar Image J programmatūru (NIH, Bethesda, MD) pie × 200 palielinājuma.

Imūnhistoķīmiskā analīze

Tika veikta imūnhistoķīmiskā analīze, lai novērtētu asinsvadu endotēlija augšanas faktora receptora 2 (VEGFR2) blīvumu, kura regulēšana veicināja angioģenēzi, kas bija labvēlīga un svarīga remodelācijas vājināšanā (Rengo et al. 2013). Ventrikulārās sekcijas tika izgatavotas tāpat kā Masona krāsošanā, kam sekoja deparafinēšana un rehidrēšana. Pēc tam sekcijas saņēma ar siltuma starpniecību saistīta antigēna izgūšanu un tika apstrādātas ar 3 procentiem H, O, lai bloķētu endogēno peroksidāzi, 12 h inkubējot 1 ug/ml VEGFR2 antivielu (Abcam, ab9530) 4 grādu temperatūrā. Pēc tam sekcijas tika inkubētas ar mārrutku peroksidāzi (HRP) iezīmētu sekundāro antivielu (1:200, Service, G1213) 50 minūtes 37 grādu temperatūrā. Turklāt tika izmantots 3,3'-diaminobenzidīns, lai iegūtu pozitīvu krāsojumu, kas tika iegūts. parādīts dzeltenbrūnā krāsā. Visbeidzot, VEGFR2 vidējais optiskais blīvums tika analizēts un aprēķināts, izmantojot programmatūru Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, ASV).

Termināla-dezoksinukleotidiltransferāzes mediētās nick-end marķēšanas (TUNEL) tests

Apoptoze pēc tam tika atklāta ar TUNEL testu. Iepriekš ražotās parafīna masas, kas iestrādāja ventrikulāros audus, tika sagrieztas citās šķēlēs TUNEL testam, kam sekoja TUNEL krāsošana saskaņā ar komerciālā testa komplekta ražotāja norādījumiem (Roche, Šveice; 11684817910). Īsumā, ventrikulārās sekcijas tika pakļautas TUNEL reaģentam, kur TdT un dUTP tika sajaukti proporcijā 1: 9, 1 stundu istabas temperatūrā pēc proteināzes K inkubācijas un šūnu membrānas plīsuma. Visbeidzot, fluorescējošie attēli tika novēroti pie viļņa garuma 530 nm, ko izraisīja emisijas viļņa garums 450 nm (× 400 palielinājums). Katras grupas ventrikulāro audu apoptotiskais ātrums tika analizēts un aprēķināts ar Image Software.

Western blot

Mēs ieviešam Western blot, lai noskaidrotu pamatā esošos mehānismus, ar kuriem Pino uzlaboja PIHF. Proteīna paraugu ekstrakcijas un sagatavošanas procedūras līdzinājās tām, par kurām iepriekš ziņots mūsu pētījumā (Chen et al.2020a). Membrānas tika pārbaudītas ar antivielām pret kodolfaktora eritroīda 2-saistīto faktoru 2 (Nrf2), hēma oksigenāzi{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,šūnu signalizācijas tehnoloģija,2524S), BCL-2 (1:1000, šūnu signalizācijas tehnoloģija, 2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), šķelta kaspāze-3(1:1000, šūnu signalizācijas tehnoloģija, 9664 T), kolagēns I (1:1000, Affinity, AF7001), gliceraldehīds-3- fosfāta dehidrogenāze (GAPDH, Service, GB12002), ar sekojošu vizualizāciju ar HRP iezīmētām sekundārajām antivielām (Service, G1213 un G1214) un ķīmijluminiscences noteikšanas reaģentiem. Blota attēli beidzot tika analizēti un kvantificēti ar Image J programmatūru.

H9c2 kardiomiocītu kultūra un iznīcināšana in vitro Žurku sirds kambaru izcelsmes H9c2 kardiomiocīti, kas tika iegādāti no American Type Culture Collection (CRL-1446), tika kultivēti, lai vēl vairāk pārbaudītu Pino ietekmi in vitro. H9c2 kardiomiocīti tika kultivēti e Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (DMEM)/F12 barotnē, kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma (Sijiqing, Hangzhou, Ķīna) 37 grādu temperatūrā un 95 procentu gaisa un 5 procentu CO atmosfērā. tika iesētas 6-iedobju plāksnēs pēc audzēšanas līdz 90 procentiem, turklāt seruma barotne, kas satur 25 uM izoprenalīna (ISO), pēc tam tika aizstāta ar normālu barotni 3 iedobēs, lai šūnas inkubētu 48 stundas, lai atdarinātu HF stāvokli, jo HF raksturo arī pārmērīga simpātiskā tonusa aktivizēšana un -adrenerģisko receptoru stimulēšana, kas rada ROS (Velusamy et al.2020). Pēc tam šūnas tika sadalītas 6 grupās: (i) kontroles grupa; (ii) kontroles barotne, kas pievienota 25 μM Pino uz 4 stundām (kontrole plus Pino grupa); (i) kontroles barotne, ko inkubē ar 25 μM Pino un 5 μM ML385 4 stundas (Nrf2 inhibitors); MCE, Ņūdžersija, ASV)(kontrole plus Pino plus ML385 grupa);(iv)ISO ​​grupa; v. ISO barotne ar 4-h inkubāciju ar 25 μM Pino (ISO plus Pino grupa); vi. ISO plus 25 μM Pino plus 5 μM ML385 grupa. Zāļu koncentrācija un inkubācijas laiks attiecas uz iepriekšējiem pētījumiem vai instrukcijām (Jin et al.2015; Oliveira et al.2017).

Jaundzimušo žurku sirds miofibroblastu kultūras un proliferācijas tests

Jaundzimušo žurku sirds miofibroblasti (CMF) tika kultivēti, lai izpētītu Pino ietekmi uz kolagēna sekrēciju. CMF tika atdalīti, izmantojot 3 dienas vecas jaundzimušo žurkas, atsaucoties uz iepriekš demonstrētām metodēm (Cui et al. 2021). Izolētās un sasmalcinātās sirdis tika sagremotas ar 0,125 procentiem tripsīna, kam sekoja kokteilis, kas satur 0,25 procentus tripsīna un 0,08 procentus kolagenāzes, pēc tam veicot centrifugēšanu un transplantāciju Petri trauciņā, lai savāktu šūnas no supernatanta. Pēc tam barotne tika aizstāta ar seruma barotni, kas līdzīga tai, ko izmantoja H9c2 kardiomiocītu kultūrai pēc 90 minūšu adhēzijas. CMF saņēma identisku iznīcināšanu kā H9c2 kardiomiocītiem. Mēs arī ieviesām šūnu skaitīšanas komplekta-8(CCK-8) testu (Dojindo, Japāna), lai noteiktu CMF proliferāciju, sasniedzot 1,5 × 10 grādu blīvumu katrā iedobē, izmantojot mikroplašu lasītāju viļņa garums 450 nm, kur augstāka vērtība norādīja uz pastiprinātu proliferācijas aktivitāti.

ROS noteikšana

Pino spēja iztīrīt ROS tika mērīta ar fluorescējošu zondi dihidroetīdiju (DHE; Beyotime, Šanhaja, Ķīna). DHL, kas tika izšķīdināts DMSO, tika atšķaidīts līdz 5 μM saldētām sekcijām vai pievienots seruma barotnei, kas jāatšķaida līdz tādai pašai koncentrācijai saskaņā ar instrukcijām. Ar paraformaldehīdu fiksētās sirdis tika sasaldētas, pēc tam sagrieztas līdz 4- μm sekcijām. Sekcijas vai H9c2 kardiomiocīti tika inkubēti kopā ar DHE šķīdumu 30 minūtes 37 grādu temperatūrā, pēc tam attēlojot ar apgrieztu fluorescējošu mikroskopu (IX70; Olympus, Tokija, Japāna). Īsumā, kodols, kas bija piepildīts ar DNS un RNS, tika krāsots skaidri sarkanā krāsā, pateicoties afinitātei starp nukleīnskābi un DHE. Turklāt spēcīgāka fluorescences intensitāte liecināja par lielāku ROS uzkrāšanos.

Bioķīmiskie izmeklējumi

Tika veikti bioķīmiskie izmeklējumi, lai pārbaudītu seruma BNP, SOD un malondialdehīda (MDA) izmaiņas serumā un šūnu supernatantā, kas attiecīgi norādīja uz HF fenotipu un oksidētāja aizsardzību. Koncentrācija tika mērīta, izmantojot atbilstošus bioķīmisko testu komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Jiancheng, Nanjing, Ķīna).

Šis raksts ir iegūts no Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7