Priviliģēti hinolilnitroni išēmiska insulta un Alcheimera slimības kombinētai terapijaiⅡ

3. Materiāli un metodes

3.1. Sintēze

Mērķa QN tika sagatavoti un attīrīti, kā parādīts papildu materiālā.

3.2. Neiroprotekcijas analīze išēmijas eksperimentālā modelī

3.2.1. Primārās neironu kultūras

Primārās neironu kultūras tika sagatavotas no smadzeņu garozas, kā aprakstīts iepriekš [16]. Smadzeņu garozas tika iegūtas no E16 Sprague-Dawley žurku embrijiem, homogenizētas un uzsētas uz plastmasas trauciņiem, kas iepriekš pārklāti ar 0,05 mg/ml poli-dlizīnu ar blīvumu 2,5 × 105 šūnas/cm2. Šūnu kultūras tika turētas 6,5% CO2 atmosfērā 37 ◦C temperatūrā Dulbecco barotnē ar augstu glikozes līmeni, kas papildināta ar 15% termiski inaktivētu (56 ◦C, 30 min) teļa augļa serumu. Pēc 24 stundām barotne tika aizstāta ar serumu nesaturošu barotni (Dulbecco's/Ham's F12, 1:1 tilpums/tilpums, 5 mg/ml glikozes, 2 mM L-glutamīna un 1 mM nātrija piruvāta un papildināta ar 100 µg /mL transferīna, 100 µM putrescīna, 20 nM progesterona, 30 nM nātrija selenīta un 5 µg/ml insulīna).

Noklikšķiniet, lai cistanche tubulosa kapsulas Alcheimera slimībai

Ziņotajos eksperimentos tika izmantotas 6- līdz 7- dienas in vitro (DIV) neironu kultūras, kas saturēja 90 procentus -tubulīna III izotipa pozitīvu nobriedušu neironu, kā aprakstīts iepriekš [17]. Visas procedūras, kas saistītas ar eksperimentiem ar dzīvniekiem, atļāva Ramón y Cajal slimnīcas (Madride, Spānija) ētikas komiteja.

3.2.2. Eksperimentālā išēmija neironu kultūrās un ārstēšanā

Lai izraisītu eksperimentālu išēmiju, primārās neironu kultūras tika pakļautas skābekļa un glikozes atņemšanai (OGD) [18]. Kultūras no 6- līdz 7-DIV tika nomazgātas un ievietotas bezglikozes Dulbecco barotnē, kas iepriekš tika burbuļots ar 95% N2/5% CO2 30 minūtes, un tika turēta mitrinātā anaerobā kamerā, kas satur gāzes maisījums ar 95 procentiem N2/5 procentiem CO2 37 ◦C temperatūrā 4 stundas (OGD4h). Kontroles grupa tika ievietota ar glikozi papildinātā Dulbecco barotnē un 4 stundas tika turēta normoksiskajā inkubatorā. Pēc 4 stundu inkubācijas bezskābekļa (OGD4h) vai normoksiskā (kontroles) apstākļos kultūras šūnas ātri ievietoja normoglikēmiskā barotnē bez seruma un reoksigenācijas stāvoklī, pēc tam pievienoja savienojumus vai nesēju un šūnas uzturēja normoksiskos un normoglikēmiskos apstākļos līdz atveseļošanai. uz 24h.

Transportlīdzekļa eksperimentālajā grupā (R24h) bija tāds pats nesēju daudzums kā pārbaudītajos savienojumos (galīgā koncentrācija bez teksta 0,5 procenti etanola). Pēc atveseļošanās 24 stundas tika noteikta šūnu dzīvotspēja. Katrai pārbaudītajai grupai tika piešķirta nejauša secība, lai akli veiktu eksperimentālo procedūru. Savienojumu testi tika veikti neatkarīgi no četriem līdz astoņiem dažādiem laikiem ar dažādām kultūru partijām, un katrs eksperiments tika veikts četros eksemplāros.

3.2.3. Šūnu dzīvotspējas tests

Lai novērtētu savienojumu neiroprotektīvo iedarbību pret OGD, šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, kvantitatīvi nosakot dzīvas, metaboliski aktīvas šūnas, ko noteica 3-(4,5-dimetiltiazola{{3) fotometriskā reducēšana. }}il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds (MTT) (Roche) par zilu formazāna produktu.

MTT tests tika veikts pēc atveseļošanās perioda, izņemot OGD 4 stundu grupu, kurai MTT tika pievienots uzreiz pēc OGD perioda beigām, bez atveseļošanās, apstrādājot šūnas ar 0.2 mg/mL MTT barotnē 1,5 stundas 37 ◦C temperatūrā 6,5 procentu CO2 atmosfērā. Pēc inkubācijas šūnas nakti tika lizētas ar vienādu tilpumu līzes šķīduma (10 mM HCl, 10 procenti SDS). MTT samazinājumu kvantitatīvi noteica ar absorbcijas mērījumu pie 595 nm (690 nm kā atsauce). Samazināta MTT aktivitāte norāda uz mitohondriju funkcijas traucējumiem un tiek uzskatīta par šūnu bojājumu norādi.

3.3. Neiroaizsardzības analīze AD eksperimentālajos modeļos

3.3.1. SHSY-5Y šūnu kultūra

Neiroblastomas SH-SY5Y šūnu līnija tika iegūta no Sigma-Aldrich (Madride, Spānija), tika uzturēta un kultivēta 1:1 maisījumā, kurā bija Eagle minimālā ēteriskā barotne (EMEM) un F12 barotne, kas papildināta ar 10 procentiem liellopu augļa seruma (FBS). ), saskaņā ar iepriekš aprakstītajām procedūrām [8].

Kultūras tika iesētas kolbās un uzturētas 37 ◦C mitrinātā atmosfērā ar 5% CO2 un 95% gaisa. Dzīvotspējas pārbaudēm SH-SY5Y šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 50,000 šūnas/iedobē, ievērojot aprakstīto procedūru [8]. Šajā pētījumā visas šūnas tika izmantotas ar mazu pasāžu skaitu (<14).

3.3.2. Neiroprotekcijas pētījumi

Lai izpētītu savienojumu iespējamo neiroprotektīvo iedarbību, šūnas tika iepriekš inkubētas ar savienojumiem pie 0,3, 1, 3 vai 10 µM 24 stundas. Pēc tam šūnas tika inkubētas ar 30 µM Rotenonu un 10 µM oligomicīnu-A (R/O) [19], Okadaic Acid (20 nM) [20] vai amiloīdu- 25-35 (30 µM) (Sigma-Aldrich, Madride, Spānija) ar vai bez savienojumiem dažādās koncentrācijās 24 stundas. Eksperimenta beigās šūnu dzīvotspēja tika mērīta, izmantojot 3.2.3. sadaļā aprakstīto MTT metodi.

3.4. Statistiskā analīze

Katras ārstēšanas laikā iegūtie rezultāti tika aprēķināti vidēji un neatkarīgi analizēti, un visa pētījuma laikā informācija par ārstēšanu tika slēpta. Dati tika attēloti kā vidējais ± SE. Tika veikta dispersijas analīze (ANOVA), lai salīdzinātu datus starp vairākām koncentrācijām pēc post hoc testa, kad dispersijas analīze bija nozīmīga. Statistiskā nozīmīguma līmenis tika iestatīts uz {{0}},05, izmantojot Prism statistikas programmatūru 5.0 (GraphPad).

3.5. ADME analīze

Savienojuma MC903 ADME īpašības tika novērtētas ar Schrödinger moduli QikProp (QikProp, versija 5.1, Schrödinger, LLC, Ņujorka, NY, ASV, 2017. gada janvāris) [21–23].

4. Nobeigumsvīzijas

Šajā darbā mēs atklājām provizoriskos rezultātus, ko ieguvām, meklējot atsevišķus un jaunus līdzekļus potenciālai išēmiska insulta un AD kombinētai ārstēšanai. Pretēji citām ziņotajām pieejām [14, 15], šeit mēs pirmo reizi pievērsāmies racionāli vadītam zāļu dizainam, izmantojot uz fragmentiem balstītu zāļu izstrādes stratēģiju, kuras pamatā ir atlasīto farmakoforu pretstatīšana no QN23 un Contilisant, mūsu vismodernākajiem svina savienojumiem. attiecīgi išēmiska insulta un AD ārstēšanai.

Tādējādi, meklējot jaunus nitronus kā neiroprotektīvus antioksidantus, kas spēj ne tikai samazināt ROS līmeni, bet arī saistīties ar bioloģiskiem mērķiem un palielināt neirotransmiteru līmeni - galvenais deficīts AD pacientu smadzenēs - mēs sintezējām QN JMA101A, JMA98C. , DDI89, DDI88, JMA12A, JMA11A, MC903 un MC902 (1. attēls) un pakļāva tiem atbilstošus fenotipiskos testus išēmisku bojājumu un AD noteikšanai. Rezultātā mēs varējām identificēt MC903 kā trāpījumu aģentu. Runājot par struktūru, MC903 satur tādas pašas funkcionālās grupas tajās pašās pozīcijās kā QN23, izņemot N-propargilpiperazīnu, kas otrā slāpekļa vietā ir aizvietots ar lineāru trīs metilēna motīvu, kas saistīts ar O (C6), nevis metoksigrupu.

Ņemot vērā rezultātus, kas iegūti, izmantojot šeit sniegto provizorisko SAR, šis funkcionālais un farmakoforiskais izkārtojums šķiet kritisks novērotajām darbībām, un tas būtu jāņem vērā turpmākajā attīstībā. Tādējādi MC903 ir jauns un mazs QN potenciālai kombinētai išēmiska insulta un AD terapijai, kas demonstrē spēcīgas neiroprotektīvas īpašības primārajām neironu kultūrām OGD apstākļos kā eksperimentāls išēmijas modelis un neironu līnijas šūnām pret R/O, OA vai 25–35 procedūras, kas atdarina AD konstatētās sekas.

Pamatojoties uz šiem daudzsološajiem rezultātiem, mūsu centieni tagad ir vērsti uz to, lai uzlabotu hit-MC903 novēroto farmakoloģisko profilu, izstrādājot, sintēzējot un bioloģiski novērtējot jaunus saistītos QN, tostarp attiecīgās fermentatīvās un receptoru saistīšanās analīzes, meklējot svina-QN. pakļaut piemērotiem išēmiska insulta un AD dzīvnieku modeļiem. Pašreizējie rezultāti paver ceļu jaunām terapeitiskām atziņām un attīstībai jaunu līdzekļu meklējumos kombinētai išēmiska insulta un AD ārstēšanai.

Cista mehānismsnche neiroprotekcijas efekts

Cistanche ir tradicionāls ķīniešu augs, kam ir ziņots par neiroprotektīvu iedarbību. Šo efektu mehānismi nav pilnībā izprotami, taču ir vairāki iespējamie pētnieku ierosinātie mehānismi:

1. Antioksidanta aktivitāte: ir konstatēts, ka Cistanche ekstraktiem piemīt spēcīga antioksidanta aktivitāte, kas var aizsargāt pret oksidatīvā stresa izraisītiem neironu bojājumiem.

2. Pretiekaisuma iedarbība: iekaisums ir bieži sastopams neirodeģeneratīvo slimību cēlonis, un ir pierādīts, ka cistanche ekstraktiem piemīt pretiekaisuma iedarbība, kas var mazināt neironu bojājumus.

3. Mitohondriju funkcijas aizsardzība: Mitohondriju disfunkcija ir galvenais neironu bojājumu un šūnu nāves veicinātājs, un ir konstatēts, ka cistanche ekstrakti aizsargā pret mitohondriju bojājumiem un uzlabo mitohondriju darbību.

4. Neirotrofisko faktoru aktivizēšana: neirotrofiskie faktori ir ķīmiskas vielas, kas veicina neironu augšanu un izdzīvošanu, un ir pierādīts, ka cistanche ekstrakti palielina neirotrofisko faktoru, piemēram, smadzeņu izcelsmes neirotrofiskā faktora (BDNF) un nervu augšanas faktora (NGF) ekspresiju. .

References

1 Kārnijs, Dž. M.; Starke-Reed, PE; Olivers, CN; Landum, RW; Čens, MS; Vu, JF; Floyd, RA Ar vecumu saistītā smadzeņu proteīnu oksidācijas palielināšanās, enzīmu aktivitātes samazināšanās un laika un telpiskās atmiņas zuduma maiņa, hroniski ievadot spin-slazdošanas savienojumu N-terc-butil-alfa-fenilnitronu. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 1991, 88, 3633–3636. [CrossRef]

2. Kļavas, KR; Green, AR; Floyd, RA ar nitronu saistītā terapija. CNS Drugs 2004, 18, 1071–1084. [CrossRef] [PubMed]

3. Džans, K.; Gao, T.; Luo, Y.; Čens, X.; Gao, G.; Gao, X.; Džou, Y.; Dai, J. Pārejoša fokāla smadzeņu išēmija/reperfūzija izraisa agrīnas un hroniskas aksonu izmaiņas žurkām: tās nozīme Alcheimera slimības riskam. PLoS ONE 2012, 7, e33722. [CrossRef]

4. Kima, HA; Millers, AA; Dramonda, GR; Amanda, G.; Thrift, AG; Arumugam, TV; Phan, TG; Šrikants, VK; Sobey, CG Asinsvadu kognitīvie traucējumi un Alcheimera slimība: smadzeņu hipoperfūzijas un oksidatīvā stresa loma. Nauņina-Šmiedeberga arka. Pharmacol. 2012, 385., 953.–959. [CrossRef] [PubMed]

5. Žens, G.; Kima, YT; Li, RC; Yocum, J.; Kapūrs, N.; Langers, J.; Dobroļskis, P.; Marujama, T.; Narumija, S.; Doré, S. PGE2 EP1 receptors saasināja neirotoksicitāti smadzeņu išēmijas un Alcheimera slimības peles modelī. Neirobiol. Novecošana 2012, 33, 2215–2219. [CrossRef]

6. Makreja, MI; Allan, SM Stroke: pagātne, tagadne un nākotne. Smadzeņu neiroķi. Adv. 2018, 2, 1.–5. [CrossRef]

7. Čioua, M.; Martinezs-Alonso, E.; Gonsalo-Gobernado, R.; Ajuso, MI; Eskobars-Peso, A.; Infantes, L.; Hadžipavlū-Litina, D.; Montoija, Dž. Montaners, J.; Alkāzars, A.; un citi. Jauni hinolilnitroni insulta terapijai: antioksidants un neiroprotektīvs (Z)-N-terc-butil-1-(2-hlor-6-metoksihinolin-3-il) metenamīna oksīds (kā jauns svins -savienojums išēmiska insulta ārstēšanai. J. Med. Chem. 2019, 62, 2184–2201. [CrossRef] [PubMed]

8. Bautista-Agilera, OM; Hagenovs, S.; Palomino-Antolīna, A.; Farre-Alìns, V.; Ismaili, L.; Joffrin, P.‑L.; Jimeno, ML; Soukup, O.; Janockova, J.; Kaļinovskis, L.; un citi. Uz vairākiem mērķiem vērsti ligandi, kas apvieno holīnesterāzes un monoamīnoksidāzes inhibīciju ar histamīna H3R antagonismu neirodeģeneratīvām slimībām. Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 12765–12769. [CrossRef] [PubMed]

9. Bautista-Agilera, OM; Budni, J.; Mina, F.; Medeiros, EB; Deiters-Konrāds, V.; Entrēna, JM; Moraleda, I.; Iriepa, I.; LòpezMunoz, F.; Marco-Contelles, J. Contilisant, tetra mērķa maza molekula Alcheimera slimības terapijai, kas apvieno holīnesterāzi, monoamīnoksidāzes inhibīciju un H3R antagonismu ar S1R agonisma profilu. J. Med. Chem. 2018, 61, 6937–6943. [CrossRef] [PubMed]

10. Bolea, I.; Žuress-Džimeness, Dž.; de los Rìos, C.; Čioua, M.; Pouplana, R.; Lukē, FJ; Unzeta, M.; Marko-Kontels, Dž.; Samadi, A. Donepezila un n-[(5-(benziloksi)-1-metil-1h-indol-2-il)metil] sintēze, bioloģiskā novērtēšana un molekulārā modelēšana - nmetilprop-2-yn-1-amīna hibrīdi kā jauni multipotenciāli holīnesterāzes/monoamīnoksidāzes inhibitori Alcheimera slimības ārstēšanai. J. Med. Chem. 2011, 54, 8251–8270. [CrossRef] [PubMed]

11. Brouns, R.; De Deyn, PP Neirobioloģisko procesu sarežģītība akūta išēmiska insulta gadījumā. Clin. Neirol. Neiroķirurgs. 2009, 111, 483–495. [CrossRef]

12. Marco-Contelles, J. A Tau, lobijs vai reliģija? ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 1361–1362. [CrossRef] [PubMed]

13. Oseta-Gaske, MJ; Marco-Contelles, J. Alcheimera slimība, "vienas molekulas, viena mērķa" paradigma un vairāku mērķu virzīta ligandu pieeja. ACS Chem. Neirosci. 2018, 9, 401–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Saule, P.; Džou, V.; Yue, H.; Džans, C.; Ak, Y.; Jans, Z.; Hu, W. Savienojums AD110 darbojas kā Alcheimera slimības un insulta terapijas vadība peļu un žurku modeļos. ACS Chem. Neirosci. 2020, 11, 929–938. [CrossRef] [PubMed]

15. Liu, Z.; Cai, W.; Lang, M.; Jans, R.; Li, Z.; Džans, G.; Jā.; Van, Y.; Saule, Y.; Zhang, Z. Daudzfunkcionālu līdzekļu neiroprotektīvie efekti un darbības mehānismi, kas vērsti pret brīvajiem radikāļiem, monoamīnoksidāzi B un holīnesterāzi Parkinsona slimības modelī. J. Mol. Neirosci. 2017, 61, 498–510. [CrossRef] [PubMed]

16. Quevedo, C.; Salinas, M.; Alcázar, A. Iniciācijas faktora 2b aktivitāti regulē proteīna fosfatāze 1, ko aktivizē no mitogēna aktivētās proteīnkināzes (karte) atkarīgais ceļš insulīnam līdzīgā augšanas faktora 1-stimulētās neironu šūnās. J. Biol. Chem. 2003, 278, 16579–16586. [CrossRef]

17. Cid, C.; Alkāzars, A.; Regidors, I.; Masjuāns, J.; Salinas, M.; Álvarez-Cermeño, J. Neironu apoptoze, ko izraisa cerebrospinālais šķidrums no multiplās sklerozes pacientiem, korelē ar hipointensīviem bojājumiem t1 magnētiskās rezonanses attēlveidošanā. J. Neirols. Sci. 2002, 193., 103.–109. [CrossRef]

18. Čioua, M.; Salgado-Ramoss, M.; Diez-Iriepa, D.; Eskobars-Peso, A.; Iriepa, I.; Hadžipavlū-Litina, D.; Martiness-Alonso, E.; Alkāzars, A.; Marco-Contelles, J. Jauni hinolilnitroni, kas apvieno neiroprotektīvas un antioksidanta īpašības. ACS Chem. Neirosci. 2019, 10, 2703–2706. [CrossRef] [PubMed]

19. Maleks, R.; Arribas, RL; Palomino-Antolīns, A.; Totosons, P.; Demougeot, C.; Kobrlova, T.; Soukup, O.; Iriepa, I.; Moraleda, I.; DiezĪriepa, D.; un citi. Jaunas dubultās mazās molekulas Alcheimera slimības terapijai, kas apvieno histamīna h 3 receptoru (h3r) antagonismu un kalcija kanālu blokādi ar papildu holīnesterāzes inhibīciju. J. Med. Chem. 2019, 26, 11416–11422. [CrossRef]

20. Buendija, I.; Egeja, J.; Parada, E.; Navarro, E.; Leons, R.; Rodrigess-Franco, MI; López, MG Melatonīna-N, N-dibenzil(Nmetil)amīna hibrīds ITH91/IQM157 nodrošina neiroaizsardzību in vitro Alcheimera modelī, izmantojot hemooksigenāzes-1 indukciju. ACS Chem. Neirosci. 2015, 18, 288–296. [CrossRef]

21. Lipinski, CA; Lombardo, F.; Dominijs, BW; Feeney, PJ Eksperimentālās un skaitļošanas pieejas, lai novērtētu šķīdību un caurlaidību zāļu atklāšanas un izstrādes apstākļos. Adv. Narkotiku Deliv. Rev. 2001, 46, 3–26. [CrossRef]

22. Dafijs, EM; Jorgensens, WL Simulāciju īpašību prognozēšana: Brīvās šķīdināšanas enerģijas heksadekānā, oktanolā un ūdenī. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2878–2888. [CrossRef]

23. Jorgensens, WL; Duffy, EM Zāļu šķīdības prognozēšana no Montekarlo simulācijām. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 1155–1158. [CrossRef]