Ārstēšana ar metformīnu žurkām aptur konstatētas nediabētiskas hroniskas nieru slimības progresēšanu

Pašreizējās ārstēšanas stratēģijaspriekšhroniska nieru slimība (CKD)galvenokārt koncentrējas uzriska faktoru kontrole. Metformīns, pirmās izvēles zāles 2. tipa diabēta ārstēšanai, iedarbojas uz labvēlīgiem pleiotropiskiem efektiem, pārsniedzot tā paredzēto lietošanu, un sākotnējie dati ir atklājuši aizsargājošu iedarbību pret nieru darbības traucējumu attīstību. Šajā pētījumā tika novērtēta metformīna un kanagliflozīna, nātrija glikozes kotransportētāja-2 (SGLT2) inhibitora, ko nesen apstiprinājusi Amerikas Savienoto Valstu Pārtikas un zāļu pārvalde diabētiskās nefropātijas ārstēšanai, terapeitiskā efektivitāte, palēninot konstatētas nediabētiskas HNS progresēšanu. . Žurkas ar adenīna izraisītu HNS tika iedalītas dažādās ārstēšanas grupās, lai saņemtu vai nu 200 mg/kg metformīna četras vai piecas nedēļas pēc adenīna diētas sākuma (konstatēta viegla vai vidēji smaga HNS), vai 25 mg/kg kanagliflozīna četras nedēļas pēc diētas sākumā, katru dienu četras nedēļas ar zondi. Katra ārstēšanas grupa tika salīdzināta ar nesēja grupu. Hroniskas adenīna devas izraisīja smagu HNS ar nesēju ārstētām žurkām, par ko liecina ievērojams kreatinīna līmeņa paaugstināšanās serumā, izteikts kreatinīna klīrensa samazinājums un traucēta minerālvielu vielmaiņa. Metformīns, bet ne kanagliflozīns, apturēja funkcionālo nieru mazināšanos. Turklāt ar metformīnu ārstēto dzīvnieku nierēs bija mazāks intersticiāls laukums un iekaisums, salīdzinot ar nesēju grupu. Proteomiskās analīzes atklāja, ka metformīna nieru aizsargājošais efekts bija saistīts ar Hippo signalizācijas ceļa aktivizēšanu. Šī ļoti konservētā daudzproteīnu kināzes kaskāde kontrolē audu attīstību, orgānu izmēru, šūnu proliferāciju un apoptozi. Tādējādi metformīns parādīja terapeitisko efektivitāti, apturot konstatētās CKD progresēšanu žurku modelī. Kidney International (2022) 101, 929–944; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2022.01.037

ATSLĒGVĀRDI:kanagliflozīns; hroniska nieru slimība; Hippo signalizācijas ceļš; nieru darbība;metformīns; proteomika

JAUNA AUGU FORMULAHRONISKĀS NIERU SLIMĪBAS (HNS)

Tulkošanas paziņojums

Ārstēšanas stratēģijas, laihroniska nieru slimība (CKD)ideālā gadījumā (i) tiešā veidā jāietver nieres un (ii) jāspēj apturēt jau konstatētas HNS tālāku progresēšanu. Jaunākie pētījumi par pretdiabēta līdzekļiem, piemēram, metformīnu un kanagliflozīnu, liecina par iespējamu labvēlīgu ietekmi uz nieru darbības samazināšanos. Šajā rakstā ir ziņots par pētījuma rezultātiem ar žurkām, pētot metformīna un kanagliflozīna terapeitisko efektivitāti jau noteiktas, bezdiabētiskas HNS apstākļos. Mūsu dati liecina, ka metformīnam ir renoprotektīvs potenciāls un tas ir perspektīvs lietošanai kā terapeitisks līdzeklis, lai aizkavētu vai pat apturētu HNS progresēšanu.

Hroniska nieru slimība(CKD) raksturopavājināta nieru darbībakas ilgst vairāk nekā 3 mēnešus. Pašlaik tā ir atzīta par pasaules mēroga sabiedrības veselības problēmu, kuras izplatība pasaulē tiek lēsta no 3% līdz 16%.1–3 Galvenie HNS cēloņi attīstītajās valstīs ir diabēts un hipertensija.1 Turklāt HNS veicina arī sirds un asinsvadu slimību globālo slogu. slimībām.1,4 Nieru darbības traucējumi var tālāk progresēt līdz nieru mazspējai, kas neizbēgami prasa dialīzi vai nieres transplantāciju un līdz ar to būtiski samazina dzīves kvalitāti.5 Pašreizējās HNS ārstēšanas stratēģijas galvenokārt ir vērstas uz riska faktoru kontroli un simptomu mazināšanu.

Metformīns, biguanīdu zāles, ir pirmās izvēles perorālais pretdiabēta līdzeklis, ko lieto 200 miljoni pacientu, kuri cieš no 2. tipa cukura diabēta.6,7 Lai gan metformīnu lieto jau 6 gadu desmitus, molekulārie ceļi, pa kuriem metformīns pazemina glikozes līmeni asinīs, joprojām ir. nav pilnībā noskaidrots.8,9 Dati no dažādām pētniecības grupām tomēr ir parādījuši, ka metformīnam ir daudz labdabīgu pleiotropisku efektu, kas pārsniedz tā sākotnējo noteikto lietošanu. Neatkarīgi no pacienta diabēta stāvokļa metformīna lietošana ir izrādījusies daudzsološa sirds un asinsvadu slimību10 un policistisko olnīcu sindroma11 ārstēšanā, un tā ir pierādījusi ievērojamu efektivitāti dažādu vēža veidu (prostatas12 un krūts13) ārstēšanā.

Turklāt jaunākie dati no preklīniskajiem pētījumiem par dažādiem nieru slimību modeļiem ir arī norādījuši uz iespējamo metformīna aizsargājošo iedarbību uz nierēm.14–19 Iepriekšējā eksperimentālā pētījumā mēs parādījām, ka profilaktiska ārstēšana ar metformīnu spēj ievērojami mazināt nieru slimību attīstību. smags HNS.14 Šajā scenārijā mēs atklājām, ka metformīns saglabā nieru darbību, mazināja nieru iekaisumu un novērsa pārmērīgu fibrozi.14 Diemžēl lielākā daļa pacientu ar HNS tiek diagnosticēti, kad GFR jau ir samazināts (GFR kategorija G2–G3a vai pat G3b–G4) , tāpēc jau konstatētas HNS ārstēšana ir klīniski nozīmīgāka izpētes paradigma. Tomēr potenciālo metformīna klīniskās lietošanas skaidrojumu HNS laikā kavēja vēsturiskās bailes no laktacidozes attīstības.20,21 Pārskatītajās vadlīnijās gan teikts, ka metformīnu tagad var lietot pacientiem ar vieglu vai vidēji smagu nieru mazspēju.22 Turklāt. , nesen veikts Lalau et al.23 klīniskais pētījums norādīja, ka ārstēšana ar metformīnu arī šķiet droša un joprojām farmakoloģiski efektīva vidēji smagas līdz smagas HNS (GFR kategorija no G3a–b līdz G4) gadījumā, ja deva tiek pielāgota nieru slimības pakāpei. neveiksme.

Ir pierādīts, ka nātrija-glikozes kotransportētāja-2 (SGLT2) inhibitori samazina nieru darbības traucējumu risku pacientiem ar cukura diabētu, un tādēļ tie ir apstiprināti diabētiskās nefropātijas ārstēšanai.24 SGLT2 inhibitori ir jauna perorālo pretdiabēta līdzekļu klase. kuru mērķis ir nieru kanāliņu glikozes reabsorbcija.25,26 Turklāt nesenā randomizētā kontrolētā pētījumā (Dapagliflozīna un Hroniskas nieru slimības nelabvēlīgo iznākumu novēršanas [DAPA-CKD] pētījums) tika pierādīts, ka SGLT2 inhibitors dapagliflozīns palēnina CKD progresēšanu. neatkarīgi no 2. tipa cukura diabēta klātbūtnes.27

Šī iemesla dēļ ASV Pārtikas un zāļu pārvalde pavisam nesen apstiprināja dapagliflozīna lietošanu pacientiem ar HNS neatkarīgi no diabēta statusa.28,29 Lai palīdzētu precizēt šos datus par iejaukšanos konstatētā HNS gadījumā, mūsu pašreizējā pētījuma mērķis bija novērtēt HNS terapeitisko efektivitāti. metformīnu un kanagliflozīnu par konstatētās HNS progresēšanu bezdiabēta žurku modelī ar adenīna izraisītu HNS.

METODES

Zāļu sagatavošana

Metformīns (Merck KGaA) un kanagliflozīns (Janssen) tika izšķīdināti 1% karboksimetilcelulozes koncentrācijā attiecīgi 20 un 2,5 mg/ml pirms ikdienas perorālās barošanas. Tika izmantots 10 ml/kg devas tilpums.

Pētījuma plāns Deviņdesmit četri (94) Wistar žurku tēviņi (Iffa, Credo) tika izmitināti 2 katrā būrī, pakļauti 12-12 stundu gaismas-tumsas ciklam, ar ad libitum piekļuvi ūdenim un tiem piešķirto barību. HNS izraisīja, ievadot ar adenīnu bagātinātu diētu (ar zemu K vitamīna saturu, 0,25% adenīna, 0.2 mg/kg K, 1% Ca, 1% P, 1 SV /g D vitamīns un 6% proteīna SSNIFF Spezialdiäten), kā aprakstīts citur,30 visu 8 un 9 nedēļu pētījuma periodu.

CKD žurkas tika nejauši iedalītas 6 dažādās grupās, lai saņemtu 4-nedēļas ārstēšanu ar 200 mg/kg metformīna, 25 mg/kg kanagliflozīna vai nesēja (1% karboksimetilcelulozes), kas sākās 4 vai 5 nedēļas pēc adenīna izraisītas CKD shēmas. Tika iekļauti 4- un 5-nedēļas ārstēšanas sākuma punkti, lai novērtētu, vai terapeitiskā efektivitāte bija atkarīga no HNS sākotnējās smaguma pakāpes. Lai novērtētu nieru histoloģiju un funkciju šajos attiecīgajos sākumpunktos, 2 papildu grupām tika ievadīta 0, 25% adenīna diēta attiecīgi 4 un 5 nedēļas, pēc tam tās tika upurētas. Kā atsauce uz pētījumu tika iekļauta arī kontroles žurku grupa ar normālu nieru darbību (1. attēls). Dzīvnieki 24 stundas tika izmitināti vielmaiņas būros, lai savāktu urīna paraugus, kam sekoja asins paraugu ņemšana caur astes vēnu atturīgā, apzinātā stāvoklī. Vadlīnijas iesaka samazināt metformīna devu pacientiem artraucēta nieru darbībalai izvairītos no laktacidozes.23,31,32 Tāpēc devas pielāgošana tika balstīta uz seruma laktāta līmeņa un pH novērtēšanu kā laktacidozes indikatoru (Papildu tabula S1). Grupā, kas saņēma tikšanos min pēc 4 nedēļu ilgas adenīna izraisītas HNS, deva tika samazināta līdz 150 mg/kg 7. nedēļā līdz pētījuma beigām. Sākot ārstēšanu pēc 5 nedēļu ilgas adenīna izraisītas HNS, metformīna deva tika samazināta līdz 150 mg/kg 7. nedēļas sākumā un līdz 100 mg/kg 8. nedēļas beigās. Pēc 4 nedēļu ilgas metformīna vai kanagliflozīna terapijas (pieredzot 8 un 9 nedēļas adenīna izraisītu HNS), dzīvnieki tika nogalināti, veicot atasiņošanu caur retroorbitālo pinumu pēc anestēzijas, ip ievadot 80 mg/kg ketamīna (Ketalar; Pfizer) un 16 mg/kg ksilazīna (Rompun; Bayer). ). Eksperimentālās procedūras tika veiktas saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu rokasgrāmatu par laboratorijas dzīvnieku kopšanu un lietošanu 85-23 (1996) un apstiprinājusi Antverpenes Universitātes Ētikas komiteja (atļaujas numurs 2017-56).

Bioķīmiskās analīzes

Deparafinizētās audu sekcijas tika iekrāsotas iekaisuma novērtēšanai (CD45, visas leikocītu marķieris), izmantojot avidīna-biotīna kompleksa metodi. Pēc bloķēšanas ar kazas serumu un vienas nakts inkubācijas ar primāro antivielu truša poliklonālo anti-CD45 (1:1000, ab10558, Abcam), sekojošas inkubācijas ar biotinilētu kazas anti-truša IgG antivielu (PK-

4001, Vector Laboratories), kam sekoja avidīna-biotīna peroksidāzes komplekss (AB-komplekss, Vector Laboratories), ļāva vizuāli noteikt tumši brūnu krāsu, pievienojot diaminobenzidīnu. CD45 pozitivitāte (laukuma procents) tika kvantitatīvi noteikta aklā veidā (sākotnējais palielinājums 100), izmantojot Axiovision attēlu analīzes programmatūru (Carl Zeiss).

Kvantitatīvā reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija Kopējā mRNS no ātri sasaldētas nieres sekcijas tika ekstrahēta, izmantojot PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen), un reversā transkribēta uz cDNS ar High-Capacity cDNS arhīva komplektu (Applied Biosystems). Kvantitatīvā reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija tika veikta, izmantojot QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). TaqMan zonde un grunti tika iegādāti no Thermo Fisher Scientific (papildu metodes). Katra pārbaudītā gēna ekspresijas līmenis tika analizēts trīs eksemplāros katram paraugam un normalizēts atbilstoši mājturības atsauces gēna Gapdh ekspresijai. Proteomiskās analīzes Kreisās nieres no CKD žurkām, kuras tika ārstētas ar metformīnu vai nesēju pēc 5 nedēļu ilgas adenīna diētas, tika savāktas un sagatavotas masas spektrometrijai un kvantitatīvai proteomikai, kā aprakstīts Papildu metodēs. Bioinformātiskās analīzes Iegūto datu kopu būtiski mainītie proteīni tika funkcionāli anotēti, izmantojot Kioto gēnu un genomu enciklopēdiju (KEGG) un WikiPathways ceļa analīzi, izmantojot Enrichr komplektu (https://maayanlab.cloud/Enrichr/).33,34 Lai nodrošinātu tika izmantota šo proteīnu funkcionālā interpretācija, datu bāze anotācijai, vizualizācijai un integrētai atklāšanai (DAVID Bio informatic Recourses 6.8: https://david.ncifcrf.gov/). Sīkāka informācija par turpmākajām bioinformātiskajām analīzēm ir izklāstīta papildu metodēs. Statistika Rezultāti ir izteikti kā vidējie SEM. Neparametriskā statistiskā analīze tika veikta, izmantojot Prism (GraphPad Software). P < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.

REZULTĀTI

Adenīna izraisīts CKD žurku modelis Sīkāka informācija par ķermeņa svaru, pārtikas uzņemšanu un urīna izdalīšanos no visām pētījuma grupām ir sniegta papildu attēlā S1 un S2. Glikozes līmeni asinīs šajā bezdiabētiskā CKD modelī, salīdzinot ar ārstēšanu ar nesēju, nemainīja metformīns vai kanagliflozīns (1. tabula). Metformīns aptur nieru darbības samazināšanos Hroniskas adenīna devas izraisīja smagu HNS žurkām, kas ārstētas ar nesēju, par ko liecina kreatinīna līmeņa paaugstināšanās serumā (2.a un b. attēls). Šis pieaugums bija ievērojami atšķirīgs pēc 4 un 5 nedēļu ilgas adenīna izraisītas HNS, norādot uz 2 ārstēšanas sākumpunktiem ar atšķirīgu HNS smagumu (P < {{10}}).0001 Papildu attēls S3). Progresīvo nieru darbības pasliktināšanos gandrīz pilnībā apturēja metformīna ievadīšana no 4. un 5. nedēļas, par ko liecina seruma kreatinīna līmeņa stabilizēšanās attiecīgi 8. un 9. nedēļā (P < 0,0001 pret nesēju) (2.a un b. attēls). Kreatinīna klīrenss kā glomerulārās filtrācijas ātruma mērs atklāja laika gaitā samazināšanos ar nesēju ārstētām CKD žurkām, savukārt metformīna deva šo samazinājumu mazināja (P < 0,05 salīdzinājumā ar nesēju; 2.c un d attēls). Arī šeit HNS smaguma atšķirības 2 sākuma punktos tika demonstrētas ar ievērojami samazinātu kreatinīna klīrensu pēc 5 nedēļām, salīdzinot ar 4 nedēļu HNS indukcijas (P <0, 001; papildu attēls S3). Saskaņā ar nieru darbības traucējumiem ar nesēju ārstētām CKD žurkām parādījās traucēta minerālvielu metabolisms. Fosfora līmenis serumā ievērojami palielinājās no 6. un 7. nedēļas, bet kalcija līmenis samazinājās, īpaši vēlākos laika punktos. Ārstēšana ar metformīnu arī atcēla šos traucējumus (2. tabula).

1. tabula|Glikozes līmenis asinīs adenīna izraisītas HNS bezdiabēta žurku modelī, kas ārstēts ar metformīnu, kanagliflozīnu vai nesēju, 4 vai 5 nedēļas pēc HNS indukcijas 4 nedēļas

Metformīns aptur histoloģisko HNS progresēšanu ar adenīnu barotām HNS žurkām novēroja cauruļveida suku robežu zudumu, bazālās membrānas sabiezēšanu un cauruļveida dilatāciju, kas visi tika vājināti, ārstējot ar metformīnu (3.a attēls). Salīdzinot ar kontroles dzīvniekiem ar normālu nieru darbību, intersticiālā laukuma procentuālā daļa palielinājās 2- un 23- reizes attiecīgi 4. un 5. nedēļā pēc HNS indukcijas (3.b un 3.c attēls). Pēc šiem atklājumiem fibrotiskā marķiera Col1a1 mRNS ekspresija pēdējos laika punktos tika ievērojami palielināta (3.d un e attēls). Atšķirībā no transportlīdzekļa terapijas, starp metformīna terapijas sākumu (attiecīgi 4. un 5. nedēļa) un pētījuma beigām (attiecīgi 8. un 9. nedēļa) starpšūnu laukumu procentuālais daudzums būtiski nepalielinājās, sniedzot pierādījumus par metformīna spēja mazināt turpmāku intersticiālu paplašināšanos un histopatoloģisko samazināšanos. Šie atklājumi tika pastiprināti, mērot galvenā profibrotiskā citokīna TGFb ekspresiju, kas bija ievērojami zemāka ar metformīnu ārstētiem dzīvniekiem, salīdzinot ar dzīvniekiem, kas ārstēti ar nesēju (3.f un g attēls).

Attiecībā uz iekaisumu, 4 nedēļu ilgas transportlīdzekļa terapijas rezultātā pētījuma beigās (ti, 8. un 9. nedēļā) ievērojami palielinājās Cd45 ekspresija, salīdzinot ar kontroles žurkām ar normālu nieru darbību (4.a attēls). Šis Cd45 ekspresijas pieaugums tika ievērojami (P < 0.01) apturēts, kad metformīns tika ievadīts pēc 5 nedēļu ilgas adenīna izraisītas HNS (4.c attēls). Tāpat ārstēšana ar metformīnu, kas tika uzsākta pēc 5 nedēļām pēc adenīna izraisītas HNS, izraisīja ievērojami zemāku iekaisuma citokīna Tnfa ekspresiju pētījuma beigās, salīdzinot ar dzīvniekiem, kas tika ārstēti ar nesēju tajā pašā laika punktā (P < 0,01; attēls). 4d un e). Līdzīgi rezultāti tika novēroti ar Cd68 ekspresiju, kas liecināja par makrofāgu infiltrācijas nomākšanu (4f un g attēls).

2. tabula|Minerālvielu metabolisma seruma parametri adenīna izraisītas HNS bezdiabēta žurku modelī, kas ārstēta ar metformīnu vai nesēju, 4 vai 5 nedēļas pēc CKD indukcijas 4 nedēļas

Attiecībā uz iekaisumu, 4 nedēļu ilgas transportlīdzekļa terapijas rezultātā pētījuma beigās (ti, 8. un 9. nedēļā) ievērojami palielinājās Cd45 ekspresija, salīdzinot ar kontroles žurkām ar normālu nieru darbību (4.a attēls). Šis Cd45 ekspresijas pieaugums tika ievērojami (P < 0.01) apturēts, kad metformīns tika ievadīts pēc 5 nedēļu ilgas adenīna izraisītas HNS (4.c attēls). Tāpat ārstēšana ar metformīnu, kas tika uzsākta pēc 5 nedēļām pēc adenīna izraisītas HNS, izraisīja ievērojami zemāku iekaisuma citokīna Tnfa ekspresiju pētījuma beigās, salīdzinot ar dzīvniekiem, kas tika ārstēti ar nesēju tajā pašā laika punktā (P < 0,01; attēls). 4d un e). Līdzīgi rezultāti tika novēroti ar Cd68 ekspresiju, kas liecināja par makrofāgu infiltrācijas nomākšanu (4f un g attēls). Laktātacidozes risks ir pārvaldāms metformīna terapijas laikā ar konstatētu HNS Lai gan ārstēšana ar metformīnu uzrādīja spēju palēnināt jau konstatētas HNS progresēšanu, jāatzīmē, ka ar metformīnu ārstētiem dzīvniekiem tika konstatēta augstāka mirstība (5. attēls). Tomēr, lai apkarotu un mazinātu laktātacidozes risku, tas ir, paaugstinātu laktāta līmeni, tika veikta metformīna devas pielāgošana (skatīt Metodes), kā rezultātā pētījuma beigās vērtības samazinājās (6. attēls).