Cistanche aizsargājošā iedarbība pret H2O2/UVB izraisītu ādas fibroblastu kolagēna degradāciju, izmantojot Hsa-microRNS-4535-mediētu TGF/Smad signālu Ⅱ

DISKUSIJA

Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, kacistanche aizsargājošā lomatiek mediēts, vājinot hsa-miR- 4535, kas vērsta uz Smad4, tādējādi regulējot Smad2/3/4 signālu pārraidi, kā arī kolagēna sintēzi ādā, kas ir pakļauta H2O2/UVB izraisīti ādas bojājumi in vitrounin vivo. Mūsu atklājumus var apkopot kā sešus galvenos punktus: (1) cistanche vājināja H2O2-inducēta HS68 šūnu novecošanās, bet ne apoptoze pie 30 µM devas; (2) H2O2/UVB izraisītsintracelulāri un mitohondrijil Pēc tam ROS veidošanās un MMP nelīdzsvarotība tika mainītacistanche ārstēšana; (3) cistanche ievērojami uzlaboja TGF / Smad signalizāciju, kā arī Samd2/3/4 kompleksa aktivizēšanu H.2O2-atklātas šūnas; (4) hsa-miR-4535 regulēšana, ko veic H2O2/UVB tika nomākta pēc tamcistanche ārstēšana; (5) hsa-miR- 4535 ir iesaistīts TGF/Smad signalizācijas regulēšanā, izmantojotmērķējot uz Smad4, lai traucēta kolagēna sintēze H2O2/UVB pakļautas šūnas; (6)lokāla cistanche lietošanauzkaila muguras ādapeles ievērojami samazināja UVB izraisīto iedarbībuādas fotonovecošanās,grumbu veidošanās, ādas hiperplāzija, un pasliktināšanāsno TGF / Smad signalizācijas ceļiem.

10. attēls. Cistanča ietekme uz UVB izraisītu C57BL6/J kailas peles ādas fotobojājumu. (A) Shematiskā procedūra eksperimentiem ar dzīvniekiem. Četras nedēļas vecu C57BL6/J kailu peļu (n=6) ​​muguras āda tika pakļauta UVB starojuma iedarbībai un tika apstrādāta ar cistanču reizi divās dienās 8 nedēļas (B). Fotogrāfija, kurā attēlota grumbu veidošanās uz kaila muguras ādas. pelēm UVB iedarbības dēļ, kam seko lokāla cistanche lietošana.

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu par Cistanche ārstēšanu ādas mazināšanai Pkarstuma bojājumi

11. attēls. Lokālā cistanche lietošana vājina UVB izraisīto iedarbībuādas hiperplāzijaun kolagēna noārdīšanās C57BL6/J kailo peļu muguras ādā. Ādas audi tika sērijveidā sadalīti un iekrāsoti ar H&E, Masona trihromu un imūnhistoķīmiski p-Smad2/3 Smad4 un -gal. H&E krāsošana parādīja epidermas biezumu. Divvirzienu sarkanās bultiņas norāda uz epidermas sabiezēšanu. Masona trihroma krāsošana parādīja kolagēna šķiedru saturu dermas slāņos. Kolagēna šķiedras izskatās zilas. LD, maza deva; HD, liela deva.

Cistancheziņots, ka dažādās šūnās, piemēram, keratinocītos un kardiomiocītos, bija anti-apoptotiskas un antioksidanta īpašības [13, 39, 40]. Cistanche perorāla ievadīšana efektīvi nomāca streptozotocīna izraisītu aknu bojājumu diabēta žurkām, samazinot mitohondriju oksidatīvos bojājumus un uzlabojot Nrf2 antioksidantu signālu pārraidi [13, 41]. Citi pētījumi ir parādījuši, ka cistanche mazināja ciklofosfamīda izraisītu hepatotoksicitāti un cisplatīna izraisītu nefrotoksicitāti, mazinot oksidatīvo stresu un iekaisumu [42, 43]. Ādas fibroblastu pakļaušana UVB vai H2O2 iedarbībai izraisa ROS uzkrāšanos mitohondrijās, izraisot mitohondriju fragmentāciju un šūnu novecošanos [44]. Iepriekšējais pētījums parādīja, ka sadrumstaloti mitohondriji pasliktina kolagēna ražošanu [45]. Mūsu pētījums liecināja, ka cistanche piemīt radikālas attīrīšanas spējas, lai novērstu ROS izraisītu mitohondriju membrānas potenciāla nelīdzsvarotību un ROS uzkrāšanos UVB un H2O2-inducētās šūnās. (3A–3C attēls). Jaunākie pētījumi liecina, ka ādas fibroblasti ir atbildīgi par ECM bagātas vides organizēšanu,

12. attēls. Cistanche ietekme uz TGF/Smad signālu un hsa-miR-4535 ekspresiju ar UVB apstarotām pelēm. (A un B) hsa-miR-4535 un Smad4 mRNS līmenis no UVB iedarbībai pakļautu peļu muguras ādas tika noteikts ar qRT-PCR. (C) TGF , p-smad2/3 un Smad4 olbaltumvielu līmenis muguras ādas audos tika noteikts ar Western blotēšanu. -tubulīns tika izmantots kā slodzes kontrole. Dati tiek parādīti kā vidējais ± SD. Tiek parādīti rezultātu kvantitatīvie rādītāji; *P < 0.05, **P < 0.01 pret transportlīdzekļa kontroles grupu; #P < 0,05, ##P < 0,01 pret UVB plus transportlīdzekļu grupu.

pārsvarā sastāv no I un III tipa kolagēna [46]. I un III tipa kolagēna homeostāze būtībā ir atbildīga par ādas strukturālā un mehāniskā atbalsta uzturēšanu [47]. Jaunie pierādījumi liecina, ka novecošanas laikā rodas bagātīgs ROS, kā rezultātā pakāpeniski tiek zaudēti kolagēna saišķi dermas slāņos un tādējādi tiek veicināta grumbu veidošanās traucēta TGF / Smad ceļa un paaugstinātas MMP ekspresijas dēļ [48, 49].cistanche mediētsTGF/Smad signālu aktivizēšana rada kolagēnu, kas uztur ādas integritāti. Tomēr tam ir atšķirīga ietekme uz vēža šūnām; aknu vēža gadījumā,cistanche-apstrādeinhibēja HepG2 šūnu proliferāciju, aktivizējot TGF / Smad signalizāciju [50]. Turpretī cistanche inhibēja TGF / Smad signālu, kā arī inaktivēja Smad3, kā rezultātā tika kavēta prostatas un aizkuņģa dziedzera vēža šūnu augšana [51]. Tomēr cistanche loma TGF / Smad signalizācijāādas dermas fibroblastipalika nezināms. Šeit mēs novērojām, ka cistanche pārregulēja COL1A1 un COL3A1 ekspresiju, kas tika samazināta ar H2O2 / UVB apstrādātajām šūnām, aktivizējot TGF / Smad signālu (4A–4C, 8E, 9A attēls). Turklāt H2O2/UVB izraisītā MMP-1 indukcija tika novērsta pēc apstrādes ar cistanču (4.A, 9.A attēls). Mūsu atklājumi liecina, ka cistanche aizsargā dermas fibroblastus no H2O2 / UVB izraisītiem bojājumiem, aktivizējot TGF / Smad signalizāciju un izraisot kolagēna ražošanu.

Ādas dermas kolagēna attīstībair sarežģīts fizioloģisks process, un ir pierādīts, ka ar mikroRNS saistīta regulēšana veicina ECM pārveidošanu un organizēšanu [23, 52, 53]. Kolagēns, elastīns un hialuronskābe (HA) ir trīs galvenie proteīni, kas uztur ādas integritāti. Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka vairākas mikroRNS ir iesaistītas ādas novecošanā, izmantojot ECM regulējumu. miR-181a tika pārregulēts novecojošos cilvēka dermas fibroblastos un ļāva kolagēnam XVI modulēt ECM komponentus [54]. Interesanti, ka augsta miR-23a-3p ekspresija var izraisīt ādas novecošanos, tieši nomācot hialuronāna sintāzi 2, vienu no transmembrānas HA sintāzes izoenzīmiem, kas sintezē HA [21]. Nesen tika ziņots, ka dažādi dabiskie savienojumi, izmantojot mikroRNS regulēšanu, mazina ādas novecošanos [55–57]. Turklāt tiek ziņots, ka cistanche bija iesaistīta mikroRNS regulēšanā holangiokarcinomas un hepatocelulārā karcinomas gadījumā un izraisīja šūnu augšanas un metastāžu nomākšanu [58, 59]. Līdz šim neviens pētījums nav identificējis molekulāro mehānismu, piemēram, mikroRNS regulēšanuapstrādāts ar cistanšucilvēka ādas dermas fibroblastu šūnas. Šeit mēs analizējām mikroRNS masīvu profilus, lai identificētu vairākas mikroRNS, kas atšķīrās starp kontroli un 30 µMapstrādāts ar cistanšugrupām (5.A attēls). Izmantojot miRDB un TargetScanHuman datu bāzes, mēs paredzējām Smad4 kā hsa-miR-4535mRNS mērķis (5.B attēls). hsa-miR-4535 ekspresija tika pazemināta pēc cistanche apstrādes H2O2/UVB inducētās šūnās (6.C, 9.B attēls). Turpretim tā mērķa mRNS-Smad4 ekspresija tika ievērojami kavēta H2O2/UVB pakļautajās šūnās un palielinājās pēc apstrādes ar cistanču (6.D, 9C attēls). Dažādi pētījumi liecina, ka ROS darbojas kā starpposma stimulējoši stresa izraisīti transkripcijas faktori, piemēram, p53, NF-κB un HIF [60]. Tāpēc mēs secinājām, ka noteiktas miRNS var modulēt, regulējot šos transkripcijas faktorus. Izmantojot transkripcijas faktoru saistošo vietu datubāzi (PROMO), mēs noskaidrojām, ka hsa-miR-4535 promotorā ir viens iespējamais p53 saistošais elements. Mūsu turpmākajā pētījumā galvenā uzmanība tiks pievērsta p53 transkripcijas regulēšanai hsa-miR-4535 promotorā. Turklāt H2O2-inducēto kolagēna noārdīšanos nevarēja vājināt hsa miR-4535 pārmērīgi ekspresētās vai si-Smad4 transfektētās šūnās pat pēc apstrādes ar cistanču (8.C, 8.E attēls). Šie atklājumi vēl vairāk apstiprina hsa-miR- 4535 iesaistīšanos kolagēna sintēzes regulēšanā, mērķējot uz Smad4.

13. attēls. Cistanča darbības mehānisma shematiskā diagramma. cistanche uzlabo TGF/Smad kolagēna sintēzes ceļus, samazinot H2O2-inducēto has-mikroRNS-4535, lai uzlabotu fotonovecošanos cilvēka ādas dermas fibroblastos. Saīsinājumi: ECM: ekstracelulāra matrica; TGF: transformējošais audzētais faktors beta; T RI: TGF receptoru I tips; T RII: TGF receptoru tips II.

Visbeidzot, mūsu atklājumi liecināja, ka cistanche aizsargā pret H2O2 / UVB izraisītu ROS veidošanos, MMP nelīdzsvarotību, šūnu novecošanos un kolagēna degradāciju cilvēka dermas fibroblastos. Cistanche dermo aizsargājošā iedarbība bija saistīta ar hsa-miR-4535 inhibīciju un Smad2/3/4 kompleksa aktivizēšanu, lai uzlabotu kolagēna sintēzi. Smad2/3/4 kompleksa aktivāciju regulēja hsa-miR-4535, saistoties ar Smad4-3′-UTR. Tāpēc cistanche aizsargmehānisms pret H2O2/UVB izraisītiem ādas bojājumiem var ietvert Smad4/kolagēna sintēzes kavēšanu ar hsa-miR- 4535

MATERIĀLI UN METODES

Šūnu kultūras un ārstēšana

HS68 cilvēka dermas fibroblasti tika iegūti no Bioresursu savākšanas un izpētes centra (BCRC, Hsinchu, Taivāna) un tika uzturēti Dulbecco modificētajā ēteriskajā barotnē (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, ASV), kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma (Invitrogen, CA, ASV). ), 2 mM L-glutamīna (Sigma-Aldrich, MO, ASV), 100 V/ml penicilīna (Sigma-Aldrich) un 100 ug/ml streptomicīna (Sigma Aldrich) 37 grādu temperatūrā un 5% CO2. Lai novērtētu cistanche ietekmi uz H2O2-inducētiem šūnu bojājumiem, HS68 šūnas tika apstrādātas ar 200 μM H2O2 1 stundu un pēc tam kopā ar cistanche (282200, Sigma-Aldrich) 23 stundas. Šūnas tika mazgātas ar PBS un ievietotas 1 ml svaigā PBS pirms UVB iedarbības. UVB starojumam šūnas tika pakļautas šķērssaistītāja (CX-2000, Upland, CA, ASV) un UVB spuldzēm ar intensitāti 40 mJ/cm2 un pēc tam apstrādātas ar cistanšu.

MTT testi

HS68 šūnu dzīvotspēja pēc apstrādes tika mērīta, izmantojot MTT testu. HS68 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs un apstrādātas ar 200 μM H2O2 1 stundu vai apstarotas ar 40 mJ/cm2 UVB un pēc tam inkubētas ar dažādu koncentrāciju cistanche (10, 20, 30 μM) 23 stundas. Pēc 24 stundām barotne tika aizstāta ar 100 μL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds) šķīdums (0,5 mg/ml; 5 mg/ml izejas šķīdums PBS tika atšķaidīts ar barotni līdz 0,5 mg/ml) 4 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēc tam purpursarkanās krāsas formazāns tika izšķīdināts 100 μL dimetilsulfoksīda (DMSO) un optiskais blīvums pie 570 nm tika mērīts, izmantojot spektrofotometru (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV).

Pārejoša transfekcija

Mikromasīvu analīze

Luciferāzes reportiera tests

Šūnas tika kopīgi transfekētas ar savvaļas tipa un mutantu luciferāzes Smad4-3′-UTR-WT vai Smad4-3′-UTR-MT reportieru konstrukcijām, attiecīgi, un iekšējās kontroles luciferāzes plazmīdām. Pēc transfekcijām luciferāzes aktivitātes tika noteiktas ar Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Sunnyvale, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Plāksnes tika nolasītas ar Reporter Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, ASV). Relatīvās luciferāzes aktivitātes tika normalizētas līdz Renilla luciferāzes aktivitātei.

Western blot analīze

Šūnas tika mazgātas, izmantojot 1x fosfātu buferšķīdumu (PBS) un lizētas līzes buferšķīdumā (50 mM Tris bāzes (pH7,5), {{10}},5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1 mM -merkaptoetanola, 1% NP-40, 1% glicerīna un proteāzes inhibitoru kokteiļu tabletes (Roche Molecular Biochemicals, Augšbavārija, Vācija) 30 minūtes uz ledus un pēc tam centrifugēja 12,000 × g 10 minūtes 4 grādu temperatūrā. Supernatanti tika savākti 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenēs. Olbaltumvielu koncentrācija šajos supernatantos tika noteikta ar Bredforda metodi (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV). Paraugi kas satur vienādus daudzumus proteīna (20 ug), tika atdalīti ar 6–12 procentu gradienta nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE) un pēc tam pārnesti uz polivinilidēna difluorīda (PVDF) membrānām (Millipore, Bedford, MA, ASV). Membrānas tika bloķētas, izmantojot bloķējošu buferšķīdumu (5 procenti beztauku sausais piens, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl un 0,1 procents Tween 20) 1 stundu RT. Pēc tam membrānas inkubēja ar primārajām antivielām (1: 1,000 atšķaidījums) pret TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, ASV), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}, Santakrusa), COL1A1 (sc-28657, Santa Cruz), COL3A1 (sc-271249, Santa Cruz), p16 (10883-1-AP, Proteintech), p21 (sc{ {60}}, Santakrusa), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz) un Histon H1 (sc-10806 , Santa Cruz) naktī pie 4 grādiem. Pēc tam tos inkubēja ar atbilstošām sekundārajām antivielām (1:80, 000 atšķaidījums), prettrušu (A0545), pretpeles (A9044) vai pretkazas (A5420) IgG (Santa Cruz Biotechnology) 1 stundu RT. Imunobloti tika atklāti ar pastiprinātas hemiluminiscences (ECL) mārrutku peroksidāzes (HRP) substrātu (Millipore), izmantojot ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Apvienotā Karaliste).

Kodolproteīna ekstrakcija

RNS ekstrakcija un qRT-PCR

Kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot Direct-zol™ RNA MiniPrep komerciālo komplektu (Zymo Research Corporation, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu [65, 66]. miRNS tika reversi transkribētas uz cDNS, izmantojot miRNS cDNS sintēzes komplektu (Takara, Shiga, Japāna), kā aprakstīts iepriekš [16, 67]. hsa-miR-4535 un Smad4 ekspresija tika noteikta ar reāllaika PCR, izmantojot LightCycler 96 Systems (Roche, Bāzele, Šveice), izmantojot standarta LightCycler 480 SYBR Green I Master protokolu. 10 μL PCR reakcija ietvēra 2 μL cDNS, 5 μL 2 × SyberGreen PCR Mix, 0,5 μL priekšējo praimeru (10 μM), 0,5 μL reverso praimeru (10 μM) un 2 μL ddH2O. Visas reakcijas tika veiktas trīs eksemplāros. MRNS noteikšanai katram gēnam tika noteikts sliekšņa cikls (Ct), un katra gēna ekspresija attiecībā pret GAPDH tika aprēķināta kā 2ΔCt, kur ΔCt=(Cttarget gēns – CtGAPDH). Lai noteiktu miRNS, katram gēnam tika noteikts Ct, un katra gēna ekspresija attiecībā pret U6 rRNS tika aprēķināta kā 2ΔCt, kur ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNS). MiRNS un mRNS ekspresijas noteikšanai izmantotie priekšējie (F) un reversie (R) primeri bija: hsa-miR-4535 (3′-CAGGG TCGGUCCA5′); cilvēks-Smad4 (F′-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R′- ATACGTGGACCCTTCTG GA); cilvēka-GAPDH (F′-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); pele-Smad4 (′'-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R'-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); pele-GAPDH (F′-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R′-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

Imunofluorescences analīze