Endotēlija cilmes šūnu mikrovezikulu aizsargājošā iedarbība uz Ang II izraisītu žurku nieru šūnu bojājumu
Mar 11, 2022
Abstrakts.Hroniska hipertensija var izraisītnieru bojājumi,pazīstama kā hipertensīvā nefropātija vai hipertensīvā nefroskleroze. Efektīvai diagnostikai un ārstēšanai ir būtiska turpmāka izpratne par molekulārajiem mehānismiem, caur kuriem attīstās hipertensīvā nefropātija. Šajā pētījumā tika pētīti mehānismi, ar kuriem endotēlija cilmes šūnas (EPC) atjauno primārās žurkasnieresšūnas (PRK). ELISA, šūnu skaitīšanas komplekts-8 un plūsmas citometrijas testi tika izmantoti, lai analizētu EPC vai EPC-MV ietekmi uz oksidatīvo stresu, iekaisumu, šūnu proliferāciju, apoptozi un AngII izraisīto PRK ciklu. PRK traumu modelis tika izveidots, izmantojot angiotenzīnu II (Ang II). Pēc Ang II indukcijas PRK proliferācija tika samazināta, apoptoze palielinājās un šūnu cikls tika bloķēts G1 fāzē pirms ieiešanas S fāzē. Tika konstatēts, ka paaugstināts reaktīvo skābekļa sugu un malondialdehīda līmenis, bet samazināts glutationa peroksidāzes un superoksīda dismutāzes līmenis. Turklāt ievērojami palielinājās iekaisuma citokīnu IL-1, IL-6 un TNF- līmenis. Tādējādi Ang II sabojāja PRK, stimulējot oksidatīvo stresu un veicinot iekaisuma reakciju. Tomēr, kad PRK tika kultivēti kopā ar EPC, Ang II izraisītais kaitējums tika ievērojami samazināts. Pašreizējā pētījumā tika apkopotas mikrovezikulas (MV), ko izdala EPC, un tās tika kultivētas kopā ar Ang II izraisītiem PRK, un tika konstatēts, ka EPC-MV saglabā savu aizsargājošo iedarbību uz PRK. Visbeidzot, EPC aizsargā PRK no Ang II izraisītiem bojājumiem, izmantojot izdalītos MV.
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU
Ievads
Hipertensija ir riska faktors saslimstībai ar sirds un cerebrovaskulārajām slimībām un ar tām saistīto mirstību (1). Thenieresvar izraisīt hipertensiju un ir viens no hipertensijas bojājuma mērķa orgāniem (2). Hronisksnieru slimība(CKD) pēdējo divu desmitgažu laikā ir bijis viens no galvenajiem paaugstinātas mirstības cēloņiem cilvēkiem ar augstu asinsspiedienu visā pasaulē (3, 4). Līdz ar to steidzami nepieciešams veicināt hipertensīvās nefropātijas ārstēšanu un pētīt tās patoloģisko mehānismu. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka angiotenzīns II (Ang II) izraisīja asinsvadu bojājumus un kalpoja par galveno lomu asinsvadu slimībās, izmantojot vairākus mehānismus, piemēram, apoptozes ierosināšanu (5), šūnu cikla apturēšanu (6), palielinot reaktīvo skābekļa sugu (ROS) līmeni ( 7), veicinot oksidatīvā stresa reakciju, palielinot malondialdehīda (MDA) sekrēciju un samazinot glutationa peroksidāzes (GSH-Px) un superoksīda dismutāzes (SOD) sekrēciju (8, 9). Ang II veicina arī ar iekaisumu saistītu faktoru, piemēram, IL-6, IL-1 un TNF- (10-12), veidošanos. Tāpēc Ang II izraisīti bojājumi tika izmantoti, lai modelētu hipertensiju in vitro, tostarp primārajām žurkāmnieresšūnas (PRK) (13,14).
Pacientiem arnieru funkcijatraucējumi, endotēlija šūnu bojājumi un samazināta reģenerācija un atjaunošanās ir galvenie peritubulāro mikrovezikulu (MV) zuduma cēloņi (15). Endotēlija cilmes šūnas (EPC), kas iegūtas no kaulu smadzenēm, var veicināt endotēlija atjaunošanos (16, 17). Iepriekšējie pētījumi atklāja, ka EPC var uzlabot sirds un asinsvadu reģenerāciju (18) un regulēt angiogenēzi (19), kā arī iedarboties uz ārstniecisku iedarbību uz akūtu.nieruišēmijas-reperfūzijas traumas (20) un pacientiem arnieru transplantācija(21). Tomēr, cik mums ir zināms, iepriekš nav ziņots par EPC ietekmi uz hipertensīvo nefropātiju. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka EPC var būt aizsargājoša iedarbība pret hipertensīvo nefropātijunierušūnas. MV nepārtraukti izdala dažādas ķermeņa šūnas, piemēram, epitēlija šūnas, audzēja šūnas un cilmes šūnas, un tās pastāv vairākos ķermeņa šķidrumos, piemēram, asinīs, urīnā un pienā, kur tie veic bioloģiskās funkcijas (22). Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka EPC aizsargājošā iedarbība ir cieši saistīta ar MV izdalīšanos (23, 24). Šajā pētījumā EPC-MV iespējamā pielietošana hipertensīvās nefropātijas ārstēšanā tika pārbaudīta, pētot aizsargājošos efektus un mehānismus. ar kuru palīdzību EPC-MV aizsargā pret Ang II izraisītu PRK traumu, lai nodrošinātu bioloģisko teorētisko pamatu hipertensīvās nefropātijas ārstēšanai.
Atslēgvārdi:EPC-MV, hipertensīvā nefropātija, Ang II, ROS, MV, iekaisums, nieres, nieres
materiāli un metodes
Dzīvnieki.No Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licence) kopā tika iegūtas 12 8 nedēļas vecas, no specifiskiem patogēniem brīvas žurkas (WKY) žurkas (svars 80–120 g). Nr. SCXK, Guangdong, 2015-0063). Žurkas tika ievietotas telpā ar nemainīgu temperatūru un mitrumu (temperatūra, 23±2˚C; mitrums, 50±10 procenti) 12 stundu gaismas/tumsas ciklā ar ad libitum piekļuvi standarta žurku barībai un ūdenim. polistirola būris. Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Hainaņas Medicīnas universitātes Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (Haikou, Ķīna; apstiprinājuma nr. HYLL-2021-053), un tie tika veikti saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu vadlīnijām (25).
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
PRK izolācija un kultūra.WKY žurkas ar brīvu piekļuvi ūdenim ir badojušās 12 stundas pirms eksperimenta. WKY peles tika eitanāzijas, izmantojot intraperitoneālu pentobarbitāla nātrija injekciju (200 mg/kg ķermeņa svara), pēc tamnierestika izņemti aseptiski, un garozas daļanierestika izgriezts un pārstādīts nelielā vārglāzē. Thenierugaroza tika sagriezta ~ 1 mm3 audu fragmentos, trīs reizes mazgāta ar PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugēta ar ātrumu 1, 000 xg 25 ˚C 5 minūtes un supernatants tika izmests. Audu fragmenti tika pievienoti I tipa kolagenāzei (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ar galīgo koncentrāciju 1 g/l, un audu fragmenti tika svārstīti un sagremoti 37˚C 30 min. Pēc filtrēšanas caur 200 sietu (0,075 mm) nerūsējošā tērauda sietu šūnas tika atdalītas ar Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) blīvuma gradienta centrifugēšanu (26). Pēc centrifugēšanas pie 1,000 xg pie 25˚C 2 minūtes, starpsuspensija tika savākta un sajaukta ar MEM/F12 barotni (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), inokulēta 6 iedobju plāksnē un kultivēts 37 °C temperatūrā zem 5% CO2. Pēc 24 stundām barotne tika noņemta un aizstāta ar svaigu barotni, un barotne tika nesaistītanierušūnas un audi tika izmesti. Pēc 48 stundām barotne atkal tika izņemta, šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS un tika apzīmētas kā PRK (27, 28); galvenā sastāvdaļa bija žurku glomerulārās mezangiālās šūnas. PRK tika kultivēti trīs paaudzes un apstrādāti ar Ang II (1 µM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 37 °C temperatūrā 24 stundas, lai izveidotu PRK.nieru bojājumimodelis. Ang II izraisīts iekaisums žurkāmnierucauruļveida epitēlija šūnas tika veiktas, kā iepriekš aprakstīja Nair et al (29).
PRK tika identificēti, izmantojot imūnfluorescences (IF) testu.Pēc trīsreizējās skalošanas ar PBS un fiksēšanas ar 4% paraformaldehīdu 25 °C temperatūrā 1 stundu, šūnas 2 stundas inkubēja (25 °C) ar Triton X-100, kam sekoja 5% BSA (Pekina). Solar Science & Technology Co., Ltd.) 25˚C temperatūrā 30 minūtes. Pēc tam PRK inkubēja nakti tumsā ar gludo muskuļu aktīnu (-SMA; 1 µg/ml; kat. nr. ab7817; Abcam) un vimentīnu (1:250; kat. nr. ab92547; Abcam) 4 °C temperatūrā. Pēc trīsreizējās skalošanas ar PBS, šūnas tika inkubētas ar Alexa Fluor® 488- (1:100; kat. nr. ab150077; Abcam) vai ar 647 marķētām (1:200; kat. Nr. ab150075; Abcam) sekundārajām antivielām 37 gadu vecumā. ˚C 1 stundu. Pēc tam šūnas tika iekrāsotas ar DAPI (0, 5 µg / ml; Beyotime Biotehnoloģijas institūts) 25 ° C temperatūrā 5 minūtes. Visbeidzot, attēli tika uzņemti, izmantojot fluorescences mikroskopu (palielinājums, x400; Leica Microsystems GmbH).
EPC kultūra un identificēšana.Žurkas augšstilbs un stilba kauls tika sadalīti, un katra kaulu smadzeņu caurule tika izskalota ar sterilu PBS. Iegūtais maisījums tika centrifugēts (1,000 xg; 25˚C; 15 min) un daļiņas tika atkārtoti suspendētas MEM/F12 barotnē. Šūnas tika izolētas ar Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) blīvuma gradienta centrifugēšanu (1,000 xg; 25˚C; 20 min) un ievietotas 25 cm2 kultivēšanas kolbā, kas pārklāta ar fibronektīnu (BD Biosciences). Šūnas tika turētas pilnīgā barotnē standarta apstākļos (37˚C; 5 procenti CO2). Barotne tika nomainīta pēc 4 dienām, un pielipušās šūnas tika kultivētas vēl 3 dienas (30). Lai identificētu EPC, tika izmantota Dil kompleksa acetilēta zema blīvuma lipoproteīna (Dil-Ac-LDL) krāsošana (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Kopkultūras sistēmai PRK (1x104) tika pievienoti kopkultūras plāksnes (Corning, Inc.) apakšējai kamerai uz 24 stundām un pēc tam tika pievienoti Ang II (1 µM) vai 200 µl PBS un EPC (3x104). pievieno augšējai kamerai un inkubēja 37 °C temperatūrā 24 stundas, pirms tika veikta turpmāka šūnu funkciju analīze. Pārbaudot PRK un labāko EPC proporciju, šūnu skaita proporcijas bija 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 un 1:7.
EPC-MV sagatavošana. EPC tika kultivētas 7 dienas, kā aprakstīts iepriekš (30), divas reizes mazgātas ar PBS un 12 stundas turētas seruma badā. Pēc tam MEM/F12 barotne, kas satur kultivētos EPC, tika savākta un centrifugēta 4 °C temperatūrā (1,000 xg; 15 min), un supernatants tika ekstrahēts 4 °C (100,000 xg); 60 min) izdalīto EPC-MV savākšanai. Pēc iestrādāšanas Pon 812 epoksīda sveķos (Structure Probe, Inc.), to uz nakti novietoja 37 ˚C. Pēc tam 4 stundas pievienoja elektronu mikroskopa fiksācijas šķīdumu (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) un urāna acetātu (2 procenti; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) un svina citrātu (Wuhan Service Technology Co., Ltd.). ) tika iekrāsoti 25 °C temperatūrā 15 minūtes. MV tika apstiprināti ar transmisijas elektronu mikroskopiju. Kopkultūras sistēmā 50 µg/ml EPC-MV (31) tika pievienoti Transvela testa plāksnes augšējai kamerai, un apakšējai kamerai tika pievienoti parki, kā aprakstīts iepriekš, un inkubēti 24 stundas.
Šūnu proliferācijas tests.PRK tika sagremoti ar tripsīnu, inokulēti 96 iedobju plāksnēs ar blīvumu 3x103 šūnas/iedobē un kultivēti 24 stundas. Lai novērtētu šūnu proliferācijas ātrums.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIERES SĀPES
Šūnu apoptozes tests.Šūnu apoptozes tests tika veikts, izmantojot Annexin V-FITC Apoptozes noteikšanas komplektu (BD Biosciences), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. PRK tika savākti, divreiz mazgāti ar ledusaukstu PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) un atkārtoti suspendēti 500 µl saistīšanas buferšķīdumā. Pēc tam atkārtoti suspendētie PRK tika inkubēti ar 5 µl aneksīna V-FITC un 5 µl PI tumsā 15 minūtes 23 ± 2 ° C temperatūrā. Šūnu apoptoze tika novērtēta, izmantojot plūsmas citometriju (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™ programmatūra, versija: 1.0; BD Biosciences).
EPC-MV un PRK saplūšana.Lai novērotu, vai EPC-MV ir sapludināti ar PRK, EPC-MV pirms līdzinkubācijas tika marķēti ar lipīdu membrānā iestrādātu fluorescējošu krāsu (PKH26). Īsumā, 50 µg/ml EPC-MV tika apvienoti ar 2 ml PKH26 (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) un maisīja 23 ± 2 ˚C 5 minūtes. Marķētais maisījums tika pievienots 2 ml 1% BSA (v) un centrifugēts pie 100,000 xg 4 °C temperatūrā 60 minūtes, pēc tam noskalots ar aukstu PBS. Nogulsnes tika suspendētas 1 ml MEM/F12 barotnē, pievienotas PRK un inkubētas 37 ˚C 24 stundas. Visbeidzot, kodola krāsošanai 25 ˚C 15 minūtes pievienoja 1 µg/ml DAPI. Šūnu attēli tika iegūti, izmantojot fluorescences mikroskopu (palielinājums, x400; Leica Microsystems GmbH).
Šūnu cikla tests.Šūnu cikla tests tika veikts, izmantojot šūnu cikla noteikšanas komplektu (BD Biosciences). EPC vai PRK (1x106) tika savākti, divreiz mazgāti ar PBS un pēc tam fiksēti 500 µl 70 procentu ledusaukstā etanolā 2 stundas 25 °C temperatūrā. Pēc tam šūnas divas reizes nomazgāja ar aukstu PBS un inkubēja PI (400 µl) un RNāzē (100 µl) 30 minūtes 37 ° C temperatūrā tumsā. PI signāls tika noteikts, izmantojot FCM (FACSCanto II). Šūnu procentuālais daudzums G1, S un G2 fāzē tika skaitīts un salīdzināts, izmantojot FlowJo programmatūru (versija 10.0.6; FlowJo LLC).
ROS mērījums ar FCM.PRK tika kultivēti līdz 60–70 procentiem saplūšanas un iegūti, izmantojot tripsinizāciju. Visas šūnas tika inkubētas ar 1,0 µM 2',7'-dihlordihidrofluoresceīna diacetātu 15 minūtes 37 °C temperatūrā. Pēc tam šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS un analizēja, izmantojot FCM, lai noteiktu ROS, izmantojot ierosināšanai 488 nm lāzeru un noteikšanai 535 nm lāzeru.
ELISA.Pēc centrifugēšanas (1,000 xg; 25˚C; 5 min) tika savākts katras apakšgrupas šūnu supernatants, lai analizētu MDA, GSH-Px, SOD un iekaisuma faktoru IL-6, IL- līmeni. 1 un TNF- . Saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika izmantoti šādi komplekti: Micro MDA testa komplekts (kat.nr. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), GSH-Px testa komplekts (kat.nr. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), SOD aktivitātes noteikšanas komplekts (kat. Nr. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), žurkas IL-1 ELISA komplekts (kat. Nr. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), žurkas IL-6 Quantikine ELISA komplekts (kat.nr. R6000B; R&D Systems, Inc.) un žurkas TNF Quantikine ELISA komplekts (kat.nr. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Statistiskā analīze.Visi eksperimenti tika atkārtoti trīsreiz, un visi dati ir izteikti kā vidējais ± SD. Dati tika analizēti, izmantojot SPSS programmatūras versiju 21.0 (IBM Corp.). Atšķirības starp vairākām grupām tika novērtētas, izmantojot vienvirziena ANOVA un Dunnett post hoc testu. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultāti
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 procenti, apstiprinot, ka EPC tika veiksmīgi izolēti. Izolētie PRK tika analizēti, izmantojot IF (vimentin / -SMA). Rezultāti parādīja, ka vimentīna/-SMA ekspresijas līmenis PRK bija augsts un pozitīvs, kas liecina par veiksmīgu PRK izolāciju (1.B att.).
Optimāla EPC un PRK attiecība.Tika pārbaudīta dažādu PRK/EPC proporciju apvienošanas ietekme kopkultūras sistēmā, un tika konstatēts, ka PRK, kas audzētas proporcijā 1:3 PRK/EPC, nepalielināja proliferācijas ātrumu, salīdzinot ar PRK, kas audzētas ar 2: 1, 1:1 vai 1:2 PRK/EPC attiecība (1. C attēls). Turklāt pieaugošās EPC proporcijas (1:4, 1:5, 1:6 un 1:7) ievērojami palielināja PRK izplatību salīdzinājumā ar EPC (1:3). Tāpēc turpmākajiem pētījumiem tika izvēlēta attiecība 1:3 PRK / EPC, lai turpmākajos eksperimentos novērstu iespējamos traucējumus no pārmērīgas EPC.
EPC kopkultūras ietekme uz Ang II izraisītiem bojājumiem.PRK (1x104) tika inokulēti 24 stundas iepriekš Transwell plāksnes apakšējā nodalījumā. Augšējā kamerā bija 200 µl PBS kontroles grupā un 200 µl EPC (3x104) eksperimentālajā grupā. Lai modelētunieru bojājumi,Apakšējā nodalījumā tika pievienots 1 µM Ang II. Pēc 24 stundām tika veikti CCK-8 un FCM testi, lai izmērītu PRK proliferācijas ātrumu. PRK, kas saņēma Ang II bez EPC, ievērojami samazinājās (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">nieresšūnu modelis.
EPC aizsargā PRK no Ang II izraisītiem bojājumiem, tika pārbaudīts Ang II izraisītā oksidatīvā stresa līmenis PRK, kas kultivēti kopā ar EPC. FCM testa rezultāti atklāja, ka Ang II ievērojami palielinājās (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 pret PRK:EPC, 2:1 grupa; *P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">nieresšūnas; FCM, plūsmas citometrija; CCK-8, šūnu skaitīšanas komplekts-8; Dil-Ac-LDL, Dil kompleksa acetilēts zema blīvuma lipoproteīns; OD, optiskais blīvums; -SMA, -gludo muskuļu aktīns; NS, nav būtiski. pretējus rezultātus attiecībā uz šo enzīmu sekrēciju. Tāpēc ROS veidošanās var būt saistīta ar Ang II izraisītiem šūnu bojājumiem, un to var uzlabot, kultivējot kopā ar EPC.
Ang II var arī bojāt šūnas, veicinot iekaisuma citokīnu sekrēciju, savukārt EPC var novērst iekaisumu (32). Pēc tam tika pētīts, vai Ang II veicina iekaisuma citokīnu sekrēciju PRK un vai EPC varētu veikt savu aizsargājošo lomu, kavējot iekaisuma citokīnu sekrēciju. IL-1, IL-6 un TNF- sekrēcija tika ievērojami paaugstināta PRK, pievienojot Ang II. Turpretim PRK, kas tika kultivēti kopā ar EPC, IL-1, IL-6 un TNF- līmenis (2. E-G attēls) bija salīdzinoši zemāks (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
EPC aizsargājošo iedarbību iedarbojas ar MV.Mehānismi, ar kuru palīdzību EPC iedarbojas uz Ang II izraisītu aizsargājošu iedarbībunieresšūnas tika tālāk analizētas, izolējot MV no EPC (3.A att.). EPC-MV tika marķēti ar PKH26 un pievienoti PRK kopā ar Ang II Transwell plāksnē, kā aprakstīts iepriekš. PKH26 fluorescence tika konstatēta PRK citoplazmā (3.B att.), kas norāda, ka EPC-MV ir sapludināti ar PRK. Pēc tam tika konstatēts, ka Ang II izraisīts samazināts proliferācijas ātrums, veicināta apoptoze un cikla apstāšanās G1 fāzē, tika inhibēti ar EPC-MV (3. C-E att.). Līdzīgi kā PRK, kas tika kultivēti kopā ar EPC, PRK, kas audzēti EPC-MV klātbūtnē un pakļauti Ang II iedarbībai, bija samazināts ROS un MDA līmenis (4.A un B attēls), paaugstināts GSH un SOD līmenis (4.C un D attēls). un samazināta iekaisuma citokīnu IL-1, IL-6 un TNF- sekrēcija (4E-G att.), salīdzinot ar Ang II grupu.
Diskusija
Cik mums ir zināms, šis pētījums pirmo reizi parādīja, ka EPC var aizsargāt PRK no Ang II izraisītiem šūnu bojājumiem. Šo aizsargājošo efektu vismaz daļēji nodrošina MV, ko izdala EPC un kas kopkultūras laikā saplūst ar PRK. Pievienojot bagātinātus MV PRK, kas pakļauti Ang II iedarbībai, tika konstatēts, ka EPC-MV atsevišķi var aizsargāt PRK no Ang II izraisītiem bojājumiem, kavējot oksidatīvo stresu un iekaisumu. MV ir definēti kā membrānas nanodrupumi (0.05–1 µm) (33), un tie tiek izvadīti no šūnas virsmas pēc aktivācijas, stresa vai apoptozes. Turklāt MV var iegūt no dažādiem šūnu veidiem, piemēram, trombocītiem, endotēlija šūnām, EPC un baltajām asins šūnām (34, 35). MV ekspresē specifiskus šūnu virsmas marķierus, kas atšķiras atkarībā no izcelsmes šūnas un to veidošanās, un tiem var būt pretiekaisuma, antikoagulanta un angiogēna iedarbība (36). No EPC atbrīvotās MV var pārnēsāt savas mātes šūnas bioloģisko informāciju un tādējādi veikt līdzīgu funkciju mērķa šūnām (33). Piemēram, EPC-MV aizsargā kardiomiocītus no Ang II izraisītas hipertrofijas un apoptozes (28), uzlabo endotēlija funkciju un spēju regulēt angiogēzi (37) un mazina oksidatīvā stresa izraisītu endotēlija disfunkciju (38). Tomēr, cik mums ir zināms, iepriekš nav ziņots par EPC-MV ietekmi uz hipertensīvo nefropātiju. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija izpētīt EPC un EPC-MV iespējamo aizsargājošo iedarbībunieru šūnu bojājums.
Šajā pētījumā tika izveidots PRK traumu modelis, izraisot bojājumus ar Ang II. Saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem (26, 39) Ang II samazināja PRK proliferāciju, palielināja apoptozi un apturēja šūnu ciklu G1 fāzē pirms ieiešanas S fāzē. Pamatojoties uz šiem ar hipertensiju saistītajiem marķieriem, tika secināts, ka Ang II izraisītais PRK hipertensijas modelis ir veiksmīgi izveidots. Turklāt tika noteikts, ka kopkultūra ar EPC aizsargāja PRK no Ang II izraisītiem bojājumiem. Pēc EPC vienlaicīgas inkubācijas ar PRK plus Ang II oksidatīvā stresa enzīmu un iekaisuma faktoru līmenis PRK tika samazināts. Tādējādi iespējamie mehānismi, ar kuru palīdzību EPC iedarbojas uz PRK, var ietvert oksidatīvā stresa un iekaisuma regulēšanu. Cik mums ir zināms, pašreizējais pētījums pirmo reizi parādīja, ka EPC var uzlabot Ang II izraisīto oksidatīvā stresa reakciju un iekaisumu PRK.
EPC efektīvi aizsargānieru funkcijaHNS (40) un kalpo lielai lomai asinsvadu integritātes saglabāšanā un endotēlija bojājumu labošanā (15), kā arī samazina asinsvadu noplūdi, uzlabo orgānu darbību un palielina izdzīvošanas līmeni sepses gadījumā (41). Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka EPC var veikt aizsargājošu lomu, izdalot MV (37, 42, 43). Lai pārbaudītu EPC-MV aizsargājošo iedarbību PRK, EPC-MV tika izolēti un marķēti ar PKH26, un pēc tam marķētie MV tika inkubēti kopā ar PRK plus Ang II. EPC-MV saplūda ar PRK un ievērojami inhibēja oksidatīvā stresa reakciju un iekaisumu, ko izraisīja Ang II, un šie rezultāti ir līdzīgi Fu et al (44) rezultātiem. EPC-MV inhibējošā iedarbība uz oksidatīvā stresa enzīmu līmeni bija lielāka nekā tikai EPC; to var attiecināt uz to, ka MV ir lielākā koncentrācijā PRK, kas apstrādāti ar EPC-MV, nekā tajos, kas kultivēti ar EPC. Šie atklājumi liecina, ka EPC aizsargājošā iedarbība uz PRK pret Ang II izraisītiem šūnu bojājumiem var būt atkarīga no izdalītajiem MV. Šī pētījuma ierobežojums ir tāds, ka potenciālie mehānismi, ar kuriem EPC-MV regulē mikroRNS / mRNS / signālu pārraides asis, netika pilnībā pārbaudīti. Loma un mehānismi, ar kuriem EPC-MV nodrošina aizsardzībunieru bojājumibūtu jānovērtē hipertensīvās nefropātijas dzīvnieku modelī, kas ir daudzsološs virziens turpmākajiem pētījumiem. Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums parādīja, ka EPC var aizsargāt PRK no Ang II izraisīta oksidatīvā stresa un palielināta iekaisuma, izdalot MV. Tas nodrošina jaunu virzienu hipertensīvās nefropātijas ārstēšanai un izveido in vitro modeli pētīšanainieru traumas.
