Neirīta deģenerācijas kvantitatīva noteikšana ar uzlabotu precizitāti un efektivitāti Parkinsona slimības in vitro modelī 1. daļa

Abstrakts

Neirītu deģenerācija ir saistīta ar neirodeģeneratīvo traucējumu, piemēram, Alcheimera slimības, Parkinsona slimības (PD) un amiotrofiskās laterālās sklerozes, agrīnām stadijām. Viena no metodēm, ko parasti izmanto neirīta deģenerācijas analīzei, ietver deģenerācijas indeksa (DI) aprēķinu pēc ImageJ Daļiņu analīzes rīka izmantošanas, lai noteiktu neirīta fragmentus kultivēto šūnu mikrogrāfijās. Tomēr DI analīzes ir pakļautas vairāku veidu mērījumu kļūdām, to veikšana var būt laikietilpīga, un to pielietojums ir ierobežots.

Neirodeģenerācija attiecas uz izmaiņām, kas notiek neironos vai ap tiem, kas var ietekmēt cilvēka kognitīvās funkcijas, intelektu, emocijas, uzvedību utt. Daudzi cilvēki domā, ka neirodeģenerācija ir cieši saistīta ar atmiņas pasliktināšanos, taču tas var nebūt tā.

Pirmkārt, neirodeģenerācija ne vienmēr nozīmē, ka atmiņa pasliktinās līdz ar vecumu. Daži cilvēki var saglabāt labu atmiņu un pat saprast taisnību. Tas ir tāpēc, ka cilvēka atmiņu ietekmē vairāki faktori, piemēram, vingrinājumi, diēta un dzīvesveids.

Otrkārt, cilvēka smadzenes var atjaunot jaunus neironu savienojumus un veidot jaunas atmiņas, ko sauc par plastiskumu. Neatkarīgi no vecuma smadzenes nemitīgi mācās un veido jaunas atmiņas. Tāpēc neirodeģenerācija ir vienkārši dabiskas izmaiņas smadzenēs un ne vienmēr nozīmē, ka atmiņa pasliktināsies.

Visbeidzot, optimistiskas attieksmes saglabāšana var arī uzlabot cilvēka atmiņu. Uztraukumam un stresam var būt negatīva ietekme uz smadzenēm, izraisot atmiņas zudumu. Pozitīva attieksme var veicināt smadzeņu veselību un uzlabot atmiņu un izziņas spējas.

Rezumējot, neirodeģenerācija ne vienmēr izraisa atmiņas zudumu, un optimistiska attieksme pret dzīvi var palīdzēt mums saglabāt labu atmiņu un kognitīvās spējas. Tāpēc mums vajadzētu saglabāt optimistisku attieksmi un stiprināt vingrinājumus, diētu un dzīvesveida pārvaldību, lai saglabātu smadzeņu veselību un atmiņu. Var redzēt, ka mums jāuzlabo atmiņa. Cistanche var būtiski uzlabot atmiņu, jo Cistanche var regulēt arī neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, paaugstināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni. Šīs vielas ir ļoti svarīgas atmiņai un mācībām. Turklāt gaļa var arī uzlabot asinsriti un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekamu uzturu un enerģiju, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz zināt veidus, kā uzlabot smadzeņu darbību

Šeit mēs aprakstām uzlabotu metodi DI analīžu veikšanai. Mērījumu precizitāte tika uzlabota, mainot atlases kritērijus neirīta fragmentu noteikšanai, no attēliem noņemot attēlu artefaktus un neirītu materiālus un optimizējot attēla kontrastu. Šādi uzlabojumi tika ieviesti ImageJ makro, kas nodrošina ātru un pilnībā automatizētu vairāku attēlu DI analīzi. Makro ietver darbības, kas paredzētas šūnu ķermeņu automātiskai noņemšanai no mikrogrāfiem, tādējādi paplašinot DI analīžu pielietojumu, lai to izmantotu eksperimentos, kuros iesaistītas disociētās kultūras.

Mēs piedāvājam eksperimentālos atklājumus, kas apstiprina, ka, salīdzinot ar parasto metodi, uzlabotā analīzes metode nodrošina mērījumus ar lielāku precizitāti un prasa ievērojami mazāk laika.

Turklāt mēs demonstrējam metodes lietderību neirīta deģenerācijas izpētei PD šūnu kultūras modelī, veicot eksperimentu, atklājot c-Jun N-termināla kināzes (JNK) ietekmi uz neirīta deģenerāciju, ko izraisa oksidatīvais stress cilvēka meencefālas šūnās. Šo uzlaboto analīzes metodi var izmantot, lai iegūtu jaunu ieskatu par faktoriem, kas ir pamatā neirīta deģenerācijai un neirodeģeneratīvo traucējumu progresēšanai.

Atslēgvārdi:

Aksonu deģenerācija; deģenerācijas indekss; neirīta deģenerācija; neirodeģenerācija; oksidatīvais stress; Parkinsona slimība.

Paziņojums par nozīmīgumu

Neirītu deģenerācija ir šūnu notikums, kas saistīts ar vairāku veidu neirodeģeneratīvo traucējumu agrīnajām stadijām. Molekulārie faktori, kas regulē neirīta deģenerāciju, joprojām ir slikti saprotami, un esošajām neirīta deģenerācijas izpētes metodēm ir ierobežots pielietojums un efektivitāte. Šeit mēs identificējam modifikācijas plaši izmantotā neirīta deģenerācijas analīzes procedūrā, kas samazina mērījumu kļūdu.

Šādi metodoloģiski uzlabojumi tika iekļauti ImageJ makro, tādējādi veicinot ātru un pilnībā automatizētu neirīta deģenerācijas analīzi, izmantojot lielas mikrogrāfiju kopas. Izmantojot Parkinsona slimības (PD) šūnu kultūras modeli, mēs parādām, ka makro veicina precīzākus un efektīvākus neirīta deģenerācijas mērījumus, vienlaikus paplašinot analīzes metodes piemērotību eksperimentiem, kuros iesaistītas disociētas kultūras.

Ievads

Neirītu deģenerācija ir šūnu process, kurā aksoniem vai dendritiem notiek progresējoša disfunkcija un morfoloģiskas izmaiņas, kas izraisa neirīta integritātes zudumu. Neirītu deģenerācija ir evolucionāri konservēts process, kas ir būtisks pareizai neironu tīklu izveidei centrālās nervu sistēmas attīstības laikā (Neukomm un Freeman, 2014).

Tomēr process tiek aktivizēts arī, reaģējot uz dažāda veida ievainojumiem, piemēram, mehāniskiem bojājumiem vai ķīmijterapijā izmantoto zāļu iedarbību (Salvadores et al., 2017). Turklāt neirīta deģenerācija ir saistīta ar dažādu ar vecumu saistītu neirodeģeneratīvu traucējumu progresēšanu, tostarp Alcheimera slimību, Parkinsona slimību (PD), Hantingtona slimību un amiotrofisko laterālo sklerozi.

Interesanti, ka visiem šādiem neirodeģeneratīviem traucējumiem uzkrājošie pierādījumi liecina, ka neirīta deģenerācija ir galvenais agrīnās stadijas notikums, kas notiek pirms neironu nāves vai klīnisko simptomu parādīšanās (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert and Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Tādējādi pētījumi, kas pēta faktorus, kas regulē šo šūnu procesu, var atklāt jaunus mērķus dažādu neirodeģeneratīvu stāvokļu ārstēšanai.

Neirītu deģenerācijas izpēte ir īpaši svarīga, lai izprastu PD — slimību, ko raksturo α-sinukleīnu saturošu olbaltumvielu agregātu uzkrāšanās, pakāpenisks dopamīnerģisko neironu zudums substantia nigra pars compacta (SNpc) un dažādu motoru un kognitīvu simptomu attīstība. (Aarsland et al., 2017).

Pierādījumi no pēcnāves un cilvēka attēlveidošanas pētījumiem liecina, ka a-sinukleīna agregāti ir vairāk sastopami neironu šķiedrās nekā šūnu ķermeņos, un dopamīnerģisko aksonu degradācija notiek lielākā mērā nekā dopamīnerģisko neironu zudums SNpc periodā, kas izraisa klīnisku sākumu. (Tagliaferro un Burke, 2016).

Lai gan molekulārā mijiedarbība, kas veicina progresējošu dopamīnerģisko neirītu pasliktināšanos, joprojām nav pilnībā izprotama, jaunākie pierādījumi liecina, ka neirīta deģenerāciju var izraisīt notikumi, kas nav atkarīgi no neironu nāves pamatā esošajām signalizācijas kaskādēm (Fukui, 2016; Geden un Deshmukh, 2016). Tādējādi pētījumi, kas tieši novērtē neirīta deģenerācijas fizioloģiskos pamatus, ir būtiski, lai izstrādātu terapiju, kas kavē agrīnu PD progresēšanu.

Reaģējot uz pierādījumiem par neirīta deģenerācijas centrālo lomu neirodeģeneratīvo traucējumu progresēšanā, ir izstrādātas dažādas metodes neirīta deģenerācijas mērīšanai, izmantojot kultivēto neironu mikrogrāfiju. Piemēram, ir izveidotas vairākas dažādas metodes, lai izmērītu neirīta deģenerāciju, izmantojot programmatūru, lai noteiktu samazinātu neitītu skaitu vai garumu (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Tomēr, tā kā šādas metodes tieši nenovērtē neirīta fragmentāciju, rezultātu interpretāciju, lai noteiktu mainīgā lieluma ietekmi uz neirīta deģenerāciju, var traucēt mainīgā iespējamā ietekme uz neirīta izaugumu. Dažas pētniecības grupas ir arī izmērījušas neirīta deģenerāciju, subjektīvi vērtējot neirītu attēlus, pamatojoties uz morfoloģiskām iezīmēm un šķietamās sadrumstalotības pakāpi (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Tomēr šī alternatīvā metode ir laikietilpīga un var izraisīt pētnieka kļūdu.

Viena metode, kas atvieglo objektīvu un tiešu neirīta fragmentācijas mērīšanu, ietver ImageJ Analyze Particles algoritma izmantošanu, lai izmērītu neirīta fragmentu laukumu kultivēto šūnu mikrogrāfijās. Mērījumus izmanto, lai aprēķinātu deģenerācijas indeksu (DI), skalu no {{0}}.0 līdz 1,0, kas atspoguļo neirīta deģenerācijas pakāpi (Sasaki et al., 2009).

Lai gan DI analīzes var izmantot, lai noteiktu dažādas pakāpes neirīta sadrumstalotību, mērījumu precizitāti parasti ierobežo vairāki kļūdu avoti, un metodes pielietojums galvenokārt aprobežojas ar eksplantu kultūrām vai šūnām, kas audzētas nodalījumos sadalītās mikrofluidiskās ierīcēs. Turklāt DI analīzes ir laikietilpīgas, ja tās ekstrapolē uz lielām attēlu kopām. Tādējādi mēs centāmies pārvarēt šos ierobežojumus, mainot DI analīzes procedūru, lai veicinātu lielāku precizitāti un efektivitāti, vienlaikus paplašinot pielietojamību.

Šajā pētījumā mēs identificējam vairākus kļūdu avotus, kas parasti ir saistīti ar DI analīzēm, un ziņojam par metodoloģiskajiem labojumiem, kas samazina dažādu veidu kļūdas. Mēs iekļaujam procesuālos uzlabojumus ImageJ makro ar nosaukumu Automated Neirite Degeneration Index (ANDI), lai pilnībā automatizētu DI analīzi no lielām attēlu kopām. ANDI makro darbībai ir nepieciešama tikai programmatūra un faili, kas ir atvērtā koda un brīvi pieejami. Mērījumi, kas iegūti, izmantojot ANDI, uzlabo precizitāti, vienlaikus ievērojami samazinot analīžu veikšanai nepieciešamo laiku.

Turklāt mēs parādām, kā jauno analīzes metodi var izmantot, lai veiktu precīzu un ātru neirīta deģenerācijas mērījumu PD šūnu kultūras modelī, kurā iesaistītas disociētas šūnas, kas audzētas bez sadalīšanas. Kopumā šie metodoloģiskie uzlabojumi var radīt jaunu ieskatu faktoros, kas ir pamatā svarīgam šūnu procesam, kas saistīts ar neirodeģenerāciju.

Materiāli un metodes

Šūnu kultūra

Lundas cilvēka mezenencefālo (LUHMES) šūnu kultūras tika izveidotas Lab Tek II astoņu iedobju priekšmetstikliņos, kas pārklāti ar poli-L-ornitīnu (PLO) un fibronektīnu, poli-D-lizīnu (PDL) un laminīnu, visiem četriem substrātiem vai bez tiem. substrāti, kā norādīts. Lai pārklātu ar PLO un fibronektīnu, priekšmetstikliņus inkubēja nakti istabas temperatūrā ar šķīdumu, kas satur 200 mg / ml PLO (Sigma-Aldrich, katalogs Nr. P3655).

Pēc mazgāšanas ar sterilu ūdeni (Avantor) priekšmetstikliņus inkubēja ar 2 mg/ml fibronektīnu (Sigma-Aldrich, katalogs #F0895) 3 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēc tam priekšmetstikliņus nomazgāja ar sterilu PBS (Corning Life Sciences, katalogs Nr. 21-040-CV) un ļāva tiem nožūt. Lai pārklātu ar PDL un laminīnu, priekšmetstikliņus inkubēja istabas temperatūrā ar šķīdumu, kas satur 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalogs Nr. P7280) un 10 mg/ml laminīna (Corning, katalogs Nr. 354232).

Pēc inkubācijas uz nakti priekšmetstikliņus mazgā ar sterilu PBS un ļāva nožūt. Lai pārklātu ar visiem četriem substrātiem, iepriekš minētās procedūras tika veiktas secīgi. LUHMES šūnas (ATCC, RRID: CVCL_B056) tika pārklātas pārklātajos kameras priekšmetstikliņos norādītajos blīvumos diferenciācijas barotnē, kas sastāv no DMEM/F12 (Invitrogen, kataloga nr. 11330057), kas papildināts ar 2 mM glutamīnu (VWR), 1% (v/v) N-2 papildinājums, 1 mg/ml tetraciklīna (Sigma-Aldrich, kataloga Nr. 87128-25G), 1 mM N6, 29-Odibutiriladenozīna cAMP (db-cAMP) ; Enzo Life Sciences, katalogs #BML-CN125-0100) un 2 ng/ml glia šūnu līnijas atvasināts neirotrofiskais faktors (GDNF; R&D Systems, katalogs Nr. 212-GD-010).

Ja vien nav norādīts citādi, visas kultūras tika izklātas ar blīvumu 115,000 šūnas vienā iedobē. 50% tilpuma barotnes nomaiņa tika veikta ik pēc 48 stundām līdz ārstēšanai. Lai novērstu ģenētisko novirzi, visos eksperimentos tika izmantoti šūnu krājumi, kas tika pasēti sešas vai mazāk reizes.

Eksperimentus, kuros iesaistītas simpātisko neironu primārās kultūras, apstiprināja Austrumu Kentuki universitātes vai Virdžīnijas universitātes Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja. Augšējie dzemdes kakla gangliji tika atdalīti no pēcdzemdību dienas 0–6 C56Bl/6 pelēm, inkubēti 37 grādu temperatūrā fermentatīvās disociācijas buferšķīdumā un mazgāti ar augšanas barotni, lai noņemtu proteolītiskos enzīmus, un triturēti.

Šūnu suspensijas tika izklātas ar blīvumu 7000 šūnas vienā iedobē Lab Tek II astoņu iedobju kameras priekšmetstikliņos. Barotnes tika nomainītas dienā in vitro (DIV) 1, kam sekoja barotnes nomaiņa katru otro dienu. Barotne tika papildināta ar citozīna arabinofuranozīdu (Ara-C, Millipore-Sigma) uz DIV1 – DIV3, lai novērstu neneironu šūnu augšanu, kam sekoja Ara-C noņemšana no barotnes vismaz 24 stundas pirms ārstēšanas, kā norādīts. Eksperimentos, kas tika veikti Austrumkentuki universitātē, kas ietver apstrādi ar ūdeņraža peroksīdu, kameras priekšmetstikliņi tika pārklāti ar 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalogs Nr. P3655), 2 mg/ml fibronektīnu, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalogs). #P7280) un 10 mg/ml laminīna (Corning, katalogs Nr. 354232) pirms lietošanas, un disociācija tika veikta, izmantojot 30-minušu inkubāciju buferšķīdumā, kas sastāv no DMEM (ThermoFisher, kataloga Nr. 11960- 044), kas satur 0,025% tripsīns (Corning Life Sciences, katalogs Nr. 25-053-CI) un 0,3% kolagenāzes (Worthington Biochemical, katalogs Nr. LS004176).

Augšanas barotne šādiem eksperimentiem sastāvēja no DMEM, kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (Invitrogen, kataloga Nr. 26140-079), 2 mM L-glutamīna (Corning, kataloga Nr. 25-005-CI) un 40 ng/ml. nervu augšanas faktors (Fisher Scientific, katalogs Nr. 13-257-019); Neneuronu šūnu noņemšanai tika izmantots 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich).

Virdžīnijas Universitātē veiktajiem eksperimentiem, kas ietvēra NGF izņemšanu, šūnas tika izklātas uz kameras priekšmetstikliņiem, kas pārklāti ar 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) un 10 mg/ml laminīnu (Invitrogen), un disociācija tika veikta 20-min. inkubācija buferšķīdumā, kas sastāv no DMEM/F12, kas satur BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), 2. tipa kolagenāzi (4 mg/ml, Worthington Biochemical), dezoksiribonukleāzi 1 (Millipore Sigma) un hialuronidāzi (Sigma-Aldrich). Augšanas barotne šādiem eksperimentiem sastāvēja no DMEM, kas papildināts ar 10% liellopu augļa serumu (Invitrogen), 1 U/ml penicilīna/streptomicīna (Invitrogen) un 45 ng/ml NGF (attīrīts no siekalu dziedzeriem); Neneironu šūnu noņemšanai tika izmantots 10 mM Ara-C.

Šūnu apstrāde

Diferencētās LUHMES šūnas tika pakļautas norādītajām koncentrācijām {{0}}hidroksidopamīna (6-OHDA; Sigma-Aldrich, katalogs Nr. 162957) vai nesēja šķīdumam to piektajā dienā diferenciācijas vidē. 6- OHDA krājumi tika sagatavoti atdzesētā PBS, kas satur 0,02% askorbāta (Sigma-Aldrich, katalogs Nr. A5960), un alikvotas tika uzglabātas no gaismas aizsargātos flakonos inertā gāzē 80 grādu temperatūrā. Pēc 24 stundu ilgas apstrādes šūnas tika fiksētas, inkubējot PBS, kas satur 4% paraformaldehīdu (PFA), 25 minūtes istabas temperatūrā.

Lai noteiktu c-Jun N-termināla kināzes (JNK) lomu oksidatīvā stresa izraisītā neirīta deģenerācijā, kultūras 1 stundu iepriekš apstrādāja ar 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, kataloga nr. S5567) vai nesēja šķīdumu. pirms pilnīgas barotnes nomaiņas ar barotni, kas satur 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA un 10 mM SP600125, vai nesēju šķīdumus. SP600125 krājumi tika sagatavoti, izšķīdinot inhibitoru sterilā dimetilsulfoksīdā (DMSO), un saldētas alikvotas tika uzglabātas gaismas aizsargātos flakonos, kas piepildīti ar inertu gāzi 20 grādu temperatūrā. Apstrāde tika veikta tā, lai šūnas tiktu pakļautas ne vairāk kā 0, 1% DMSO.

Simpātisko neironu primārās kultūras tika apstrādātas ar DIV5. Eksperimentos ar ūdeņraža peroksīda izraisītu neirīta deģenerāciju kultūras tika pakļautas 500 mM ūdeņraža peroksīdam (Sigma-Aldrich, katalogs #H1009-100ML) vai nesēja šķīdumam, kas sastāvēja no sterila ūdens (Cytiva, katalogs Nr. SH30529.02). uz 24h.

Eksperimentos, kas ietvēra NGF izņemšanu, SCG kultūras vai nu tika aizstātas ar barotni, vai arī tika pakļautas NGF atņemšanai. SCG kultūras, kurām tika atņemta NGF, trīs reizes izskaloja ar NGF nesaturošu augšanas barotni un pēc tam inkubēja NGF nesaturošā augšanas barotnē 80 stundas bez barotnes izmaiņām. Pēc apstrādes šūnas tika fiksētas, 30 minūtes inkubējot 4% PFA PBS, kam sekoja PFA noņemšana, skalojot ar PBS.

Krāsošanas un fluorescences mikroskopija

Eksperimentiem ar LUHMES šūnām, kā arī eksperimentiem ar simpātiskajiem neironiem, kas apstrādāti ar ūdeņraža peroksīdu, astoņu iedobju kameras priekšmetstikliņi, kas satur fiksētas šūnas, tika caurlaidīgi ar 0,1% Triton X-100 PBS un bloķēti uz laiku. 1 stunda ar 10% normāla kazas seruma PBS, kas satur 0,1% Triton X-100. Pēc tam priekšmetstikliņus inkubēja ar primāro antivielu, kas ir specifiska b I tubulīnam (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) bloķējošā šķīdumā 4 grādu temperatūrā nakti. Pēc tam priekšmetstikliņus mazgā ar PBS, inkubēja ar sekundāro antivielu, kas savienota ar Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) 90 minūtes istabas temperatūrā un tika pakļauta papildu mazgāšanai.

Eksperimentos ar tirozīna hidroksilāzes (TH) krāsošanu priekšmetstikliņi tika pakļauti papildu inkubācijai PBS, kas satur 10% normāla kazas seruma, 0,1% Triton X-100, TH specifisku antivielu (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) 4 grādos naktī. Pēc tam priekšmetstikliņus mazgā ar PBS, inkubēja ar sekundāro antivielu, kas savienota ar Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), un tika pakļauta papildu PBS mazgāšanai.

Pēc b III-tubulīna vai TH imūnmarķēšanas pabeigšanas priekšmetstikliņus 5 minūtes inkubēja ar 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-fenilindolu (DAPI; kataloga Nr. D9542) PBS. Pēc tam priekšmetstikliņi tika mazgāti ar PBS, un segstikliņi tika uzstādīti, izmantojot Fluoromount G montāžas līdzekli (Southern Biotech, katalogs Nr. 0100-01).

Eksperimentos ar simpātiskiem neironiem, kas pakļauti NGF izņemšanai, priekšmetstikliņus 1 stundu bloķēja, inkubējot istabas temperatūrā buferšķīdumā, kas sastāvēja no 5% normāla kazas seruma (Life Technologies) un 0.0005% Triton X-100 PBS, kam seko inkubācija primārajā antivielu šķīdumā, kas satur peles anti-peles Tuj1 (1:1000, Covance) nakti 4 grādu temperatūrā. Pēc tam priekšmetstikliņus skaloja ar PBS, 1 stundu inkubēja kazu anti-peļu IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) un 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) bloķēšanas buferšķīdumā, pakļāva papildu PBS skalošanu un ļāva. žāvēt. Priekšmetstikliņi tika uzstādīti ar Fluoromount-G (Southern Biotech, katalogs Nr. 0100-01) un uzglabāti istabas temperatūrā.

Priekšmetstikliņi, kuros bija LUHMES šūnas, tika vizualizēti ar Nikon Eclipse II Ti-U apgrieztā mikroskopa sistēmas 20 objektīvu ar Lumencor Mira 4-Channel LED gaismas avotu. 1280 1024-pikseļu attēli tika uzņemti, izmantojot Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD kameru un NIS Elements 3.22.15 (738. būvējums). Izņemot gadījumus, kad norādīts citādi, visi fāzes kontrasta attēli tika uzņemti, izmantojot gaismas intensitātes un ekspozīcijas laika iestatījumus, kas radīja vidējo fona intensitāti 165 8-bitu attēlos.

Lai samazinātu fona ēnojumu vai citas neatbilstības, pirms katras mikroskopijas sesijas tika uzņemts tukšas iedobes attēls un izmantots fona korekcijai LUHMES šūnu attēlveidošanas laikā. Priekšmetstikliņi, kas satur simpātiskus neironus, kas kultivēti Austrumkentuki universitātē vai Virdžīnijas universitātē, tika attēloti, izmantojot attiecīgi Zeiss LSM 800 mikroskopa sistēmu vai Zeiss LSM 980 mikroskopa sistēmu. Attēli tika uzņemti ar 20 palielinājumu un 1024 1024 izšķirtspēju, izmantojot Zen programmatūru (Carl Zeiss Microscopy).

Šūnu dzīvotspējas analīze

Diferencētas LUHMES šūnu kultūras tika izveidotas uz Lab Tek II astoņu iedobju priekšmetstikliņiem, kas tika pārklāti ar dažādiem substrātiem, kā norādīts. 50% barotnes maiņa tika veikta ik pēc 48 stundām, un šūnas tika fiksētas ar 4% PFA PBS sestajā diferenciācijas dienā. Priekšmetstikliņi, kuros bija fiksētas šūnas, tika krāsoti ar DAPI, un kodoliekrāsojuma attēli tika uzņemti ar Nikon Eclipse II Ti-U apgrieztā mikroskopa sistēmu un Nikon DS-Fi1 5 MP CCD kameru.

Pamatojoties uz kodolu izskatu, akls pētnieks novērtēja šūnas kā veselas vai neveselīgas. Šūnas ar samazinātu kodola laukumu vai kodola sadrumstalotību tika novērtētas kā neveselīgas. Katrā eksperimentā veselo šūnu skaits vienā attēlā tika novērtēts vismaz piecos redzes laukos katrā stāvoklī.

DI mērījumi

Tradicionālie DI mērījumi tika veikti, izmantojot Fiji Is Just ImageJ (FIJI) pakotni, kas satur ImageJ 1.52p, izmantojot metodi, kas ietver plaši citētus parametrus DI analīzei (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin and Cho, 2020). Diferencētu LUHMES šūnu astoņu bitu attēli ar labi atdalītiem aksonu traktiem tika pakļauti binarizācijai, izmantojot noklusējuma binarizācijas algoritmu, ar binārajām opcijām, kas konfigurētas, lai izveidotu attēlu ar melnām šūnām priekšplānā un baltu fonu.

Brīvrokas zīmēšanas rīks tika izmantots, lai manuāli izsekotu visiem attēla apgabaliem, kuros ir šūnu korpusi, un visi melnie pikseļi tika pārveidoti par baltiem izsekotajos apgabalos. ImageJ mērīšanas rīks tika izmantots, lai izmērītu bināro attēlu kopējo melno laukumu, kurā ir tikai neirīti. Pēc tam tika lietots Daļiņu analīzes rīks, izmantojot izmēra iestatījumu 20–10,000 pikseļi un cirkularitātes iestatījumu 0,2–1,0, lai noteiktu neirīta fragmentus. Pēc tam visu neirīta fragmentu summētais laukums tika dalīts ar kopējo melno laukumu, lai aprēķinātu attēla DI.

Eksperimentos, kas saistīti ar izmēru parametru optimizāciju neirīta fragmentu identificēšanai, visiem daļiņu mērījumiem tika izmantoti {{0}}.2–1.00 apļveida kritēriji. Daļiņu noņemšanas spraudnis (2. versija0{{10}}4/02/09), ko izstrādājis Veins Rasbends, tika iegūts no vietnes https://imaj.nih.gov/. Ja norādīts, tika veikta daļiņu noņemšanas spraudņa lietojumprogramma, izmantojot izmēra parametrus 0–9 pikseļi un cirkularitātes parametrus 0, 0–1, 0, lai noņemtu mazus, neirītus nesaturošus objektus no binārizētiem attēliem, kas iegūti no fāzes kontrasta mikrogrāfijām.

Līdzīgi tika izmantoti {{0}}–4 pikseļu izmēra parametri un 0–1,0 apļveida parametri, lai noņemtu mazus objektus no binārizētiem attēliem, kas iegūti no fluorescences mikrogrāfijām, kas attēlo b III-tubulīna imūnkrāsošanu. Ja nav norādīts citādi, pirms DI analīzes visi fāzes kontrasta attēli tika pakļauti kontrasta uzlabošanai, izmantojot ImageJ, lai lietotu uzmeklēšanas tabulu (LUT) ar vismaz 90 un maksimālo 205.

Mākslīgās sadrumstalotības mērīšana

Kultūras, kas satur veselas LUHMES šūnas, tika fiksētas ar 4% PFA to sestajā diferenciācijas dienā un imūnmarķētas ar b III-tubulīnu. Izmantojot 20 objektīvus, no nejauši atlasītiem reģioniem tika uzņemti 1280 1024-pikseļu fāzes kontrasta mikrogrāfi un fluorescences mikrogrāfi, kas katrs attēlo identiskus redzes laukus. Kopumā tika uzņemti desmit attēlu komplekti no deviņām atsevišķām kultūrām.

ImageJ tika izmantots, lai ģenerētu oriģinālo fāzes kontrasta un fluorescences mikrogrāfiju bināras kopijas, kā arī fāzes kontrasta mikrogrāfiju kopijas, kas tika binārizētas pēc kontrasta uzlabošanas, izmantojot LUT ar vismaz 90 un maksimālo 205. Katrai kopai attēlu, akls pētnieks identificēja nelielu 150 150-pikseļu apgabalu sākotnējā fāzes kontrasta mikrogrāfijā, kurā bija tikai veseli un neskarti neirīti.

Pēc tam reģiona lielums un koordinātas tika saglabātas ImageJ interesējošā reģiona (ROI) pārvaldniekā un izmantotas, lai veiktu DI mērījumus analogos bināro attēlu reģionos no vienas un tās pašas attēlu kopas. DI mērījumi tika veikti, izmantojot tradicionālo metodi, kuras fragmenta lieluma parametri ir 20 -10,000 pikseļi. Tā kā visi izmērītie reģioni saturēja tikai neskartus neironus, visi atklātie fragmenti tika uzskatīti par mākslīgiem fragmentiem.

ANDI Makro

ANDI makro tika uzrakstīts, izmantojot ImageJ Macro valodu. Makro ietver virkni darbību, kas ļauj lietotājam izvēlēties ceļus trim direktorijiem, viens direktorijs satur neironu attēlus, kas imūnmarķēti neironu marķierim, piemēram, b III-tubulīns, otrs direktorijs satur atbilstošus attēlus, kas attēlo kodoliekrāsošanos, un trešais direktorijs. paredzēts rezultātu failu saglabāšanai. Attēlu fragmentu apgabali un kopējie neirīta apgabali atlasītajos direktorijos tiek aprēķināti, izmantojot vairākas ImageJ darbības. Īsāk sakot, attēls, kurā attēlots kodolmateriālu marķējums, tiek atvērts, tiek pakļauts kontrasta uzlabošanai un binārizēts. Daļiņu noņemšanas spraudnis tiek izmantots, lai no binārā attēla noņemtu mazus artefaktus, kas nav saistīti ar kodolu, un binārais attēls tiek pakļauts virknei izplešanās un erozijas.

Tiek atvērts atbilstošs šūnu attēls, kas imūnmarķēts ar b III-tubulīnu (vai citu neironu marķieri) un tiek pakļauts kontrasta uzlabošanai. Binarizētais attēls, kas attēlo palielinātus šūnu kodolus, pēc tam tiek atņemts no attēla, kurā attēlotas šūnas, kas imūnmarķētas ar b III-tubulīnu, tādējādi radot attēlu, kurā ir tikai neirīti. Pēc tam neirīta attēls tiek binarizēts un pakļauts daļiņu noņemšanai no 0 līdz 4 pikseļiem. Neirīta fragmenta laukums tiek aprēķināts, izmantojot algoritmu Analyze Particle, lai izmērītu daļiņas ar cirkularitāti starp 0.2 un 1.0 un izmēru no 5 līdz 10,0000 pikseļiem. Kopējo neirīta laukumu aprēķina, izmantojot rīku Measure, lai aprēķinātu kopējo melno laukumu. Attēls, kurā attēlots binārais neirīta apgabals ar izceltiem fragmentiem, tiek saglabāts lietotāja norādītajā direktorijā, kā arī .csv faili, kas ziņo par sadrumstaloto neirīta apgabalu un kopējā neirīta laukuma mērījumiem.

Papildus iepriekšminētajām darbībām makro ir iekļautas vairākas papildu darbības, lai atvieglotu lietošanu un ierobežotu lietotāja kļūdas. Tās ietver funkcijas, kas no attēliem noņem mēroga informāciju un nodrošina, ka mērījumi tiek iegūti pikseļu vienībās; konfigurēt ImageJ krāsu iestatījumus un binārās opcijas atbilstošai attēla atņemšanai un binarizācijai; pārbaudiet, vai atlasītajos direktorijos b III-tubulīna krāsošanas un DAPI krāsošanas attēliem ir vienāds attēlu skaits; aizveriet iepriekš izmantotos attēlus, lai palielinātu apstrādes laiku; skaidrus iepriekšējo analīžu rezultātus pirms jaunu analīžu veikšanas; un novērstu kļūdas, kas saistītas ar .ini faila izveidi operētājsistēmā Windows 10.

Eksperimentiem, kas saistīti ar simpātisko neironu analīzi, ANDI makro tika pārskatīts, lai iekļautu darbību, kas parāda dialoglodziņu, kas ļauj lietotājam kontrolēt, cik reižu binārie kodolu attēli tiks paplašināti. ANDI versija ar šo versiju tika nosaukta par ANDI v1.1. Mainot vērtību dialoglodziņā uz lielāku skaitli, palielinās somas noņemšanas lielums, savukārt, mainot vērtību uz mazāku skaitli, samazinās somas noņemšanas lielums. Noklusējuma vērtība ir 12, kas ir paplašinājumu skaits, kas izmantots visos eksperimentos, kuros iesaistītas LUHMES šūnas. Simpātisko neironu analīzes laikā tika izmantota vērtība 16, lai noņemtu lielākus šūnu ķermeņa reģionus.

ANDI makro ir atvērtā koda, un tas ir brīvi pieejams lietošanai vai modificēšanai, izmantojot šo URL: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. ANDI precīza darbība ir pārbaudīta, izmantojot vairākus personālos datorus ar operētājsistēmu Windows 10. Iepriekš minētajā tīmekļa adresē ir pieejams arī attēlu komplekts, kurā attēlotas LUHMES šūnu kultūras, kurām ir dažādas neirīta deģenerācijas pakāpes, un to var izmantot, lai izpētītu precīzu makro izpildi cita veida datoros. Tīmekļa adrese nodrošina arī piekļuvi protokolam, kurā aprakstīts, kā izmantot makro.

Laika aprēķini

Lai novērtētu laiku, kas nepieciešams, lai manuāli veiktu DI mērījumus, fāzu kontrasta mikrogrāfijās attēlotas LUHMES šūnas, kas apstrādātas ar nesēja šķīdumu, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA vai 7,5 mM 6-OHDA tika pakļauti DI vērtēšanai, izmantojot iepriekš noteiktas metodes (Kraemer et al., 2014). Katrs attēls tika pakļauts kontrasta uzlabošanai un binarizācijai. Pēc tam tika izmantots ImageJ brīvrokas rīks, lai digitāli noņemtu visus attēlotos šūnu ķermeņus no binārajiem attēliem. Daļiņu analīzes rīks tika izmantots, lai izmērītu fragmentus ar cirkularitāti no 0.2 līdz 1,0 un izmēru no 20 līdz 10,000 pikseļiem, un rīks Measure tika izmantots, lai noteiktu kopējo neirīta laukumu.

Vērtības par sadrumstaloto neirīta laukumu un kopējo neirīta laukumu tika pārnestas uz izklājlapu programmā Microsoft Excel, un DI punktu aprēķināšanai tika izmantota matemātiska darbība programmā Excel. Pēc attēla atvēršanas ar ImageJ tika izmērīts laiks, kas nepieciešams, lai manuāli veiktu katru no šīm procedūrām. Vidējais analīzes laiks tika aprēķināts no 36 kopējiem attēliem. Attēli tika iegūti no deviņiem neatkarīgiem šūnu kultūras preparātiem, un analīzes tika veiktas, izmantojot vienu attēlu katrā ārstēšanas stāvoklī no katra šūnu kultūras preparāta. Lai noteiktu DI mērījumu ātrumu, kas veikts, izmantojot ANDI makro, tika izmantotas tās pašas attēlu kopas, lai noteiktu laiku, kas nepieciešams makro atvēršanai programmā ImageJ, makro operāciju palaišanai, datu pārsūtīšanai uz Excel izklājlapu un DI aprēķināšanai.

Statistika

Kvantitatīvie salīdzinājumi tiek parādīti kā lodziņu un ūsu diagrammas, kur vidējā līnija apzīmē mediānu, kastes sniedzas līdz 25. un 75. procentilei, un ūsas attēlo 5. un 95. procentili. Vidējie rādītāji tika statistiski salīdzināti GraphPad Prism 9.1.2, izmantojot atkārtotus mērījumus ANOVA ar post hoc salīdzinājumiem, izmantojot Sidák korekciju. Kvantitatīvo datu normālums tika pārbaudīts, izmantojot Shapiro-Wilk testu IBM SPSS 26.

Kad tika pārkāpts normalitātes pieņēmums (1.C, 3.D att.), grupu salīdzināšana tika veikta, izmantojot neparametrisko Frīdmena testu ar Danna testu, kas veikts post hoc salīdzinājumiem. Korelācijas analīzes tiek attēlotas kā izkliedes diagrammas, un tās ietver vispiemērotākās līnijas. Šādas attiecības tika analizētas, izmantojot Pīrsona produkta un momenta korelācijas vai Spīrmena r, kad tika pārkāpts normalitātes pieņēmums. Korelācijas analīzes atlikumu normalitāte tika novērtēta, vizuāli pārbaudot atbilstošos QQ parauglaukumus.

Pīrsona produkta momenta korelācijas koeficienti tika salīdzināti savā starpā, izmantojot Steigera asimptotisko z testu (Steiger, 1980; Lee and Preacher, 2013). Netika izslēgtas nekādas novirzes. Statistiskais nozīmīgums tika pieņemts ar p, 0,05. P vērtības tiek noapaļotas līdz četrām zīmēm aiz komata un norādītas visā galvenajā tekstā. Ietekmes lielumi un 95% ticamības intervāli ir norādīti arī parametru analīzēm, un efekta lielumi ir aprakstīti galvenajā tekstā un ticamības intervāli, kas norādīti 1. tabulā.

Datu pieejamība

Papildu dati par šo rakstu tiks kopīgoti pēc pamatota pieprasījuma.

Koda pieejamība

Rakstā aprakstītais kods/programmatūra ir brīvi pieejama tiešsaistē vietnē https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Kods ir pieejams kā paplašinātie dati 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com