Uz RNS Seq balstīta de Novo transkripta montāža un Cistanche Deserticola gaļīgā stumbra gēnu atklāšana -Ⅰ

Foni

Cistanche deserticola ir pilnīgi nefotosintējošs parazitārs augs ar lielu ārstniecisku vērtību un galvenokārt izplatīts Ķīnas ziemeļrietumu tuksnesī. Tās žāvētais gaļīgais kāts ir ļoti svarīgs tonikstradicionālā ķīniešu medicīnaar lomu galvenokārt vīriešu seksuālās funkcijas uzlabošanā un imunitātes stiprināšanā, bet daži mehāniski pētījumi ir veikti daļēji genoma un transkripta resursu trūkuma dēļ.

DABĪGA CISTANČE TUBULOSA Ķīnas TRADICIONĀLĀ MEDICĪNA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultāti

Šajā pētījumā mēs veicām dziļu transkripta sekvencēšanu C. deserticola gaļīgajā stumbrā, un aptuveni 80 miljoni nolasījumu tika ģenerēti, izmantojot Illumina pair-end sekvencēšanu HiSeq2000 platformā. Izmantojot trīsvienības montētāju, mēs ieguvām 95 787 transkripta sekvences ar transkripta garumu no 200 bp līdz 15 698 bp, kuru vidējais garums ir 950 bāzes un N50 garums 1519 bāzes. Tika identificēti 63 957 transkripti kā aktīvi izteikti ar FPKM, kas ir lielāks vai vienāds ar 0,5, kuros 30 098 transkripti tika anotēti ar gēnu aprakstiem vai gēnu ontoloģijas terminiem, veicot secību līdzības analīzi pret vairākām publiskām datubāzēm (Uniprot, NR un Nt NCBI un KEGG). . Turklāt mēs identificējām galvenos enzīmu gēnus, kas iesaistīti lignīna un feniletanoīdu glikozīdu (PhG) biosintēzē, kas, kā zināms, ir galvenās aktīvās sastāvdaļas. Pamatojoties uz secību salīdzinājumu un filoģenētisko analīzi, tika identificēti četri fenilalanīna amonjaka liāzes (PAL) gēni, pirmais galvenais lignīna un PhG biosintēzes enzīms. Pirmo reizi tika ierosināti arī divi PhG biosintēzes ceļi.

Secinājumi

Kopumā mēs pabeidzām C. deserticola gaļīgā stumbra transkripta globālo analīzi, izmantojot RNA-seq tehnoloģiju. No samontētajiem un anotētajiem transkriptiem tika identificēta fermentu gēnu kolekcija, kas saistīta ar lignīna un feniletanoīdu glikozīdu biosintēzi, un tika prognozēta arī PAL gēnu saime. Šī pētījuma secības dati būs vērtīgs resurss, lai turpmāk veiktu feniletanoīdu glikozīdu biosintēzes pētījumus un funkcionālos genomikas pētījumus šajā svarīgajā ārstniecības augā.

Ievads

C. deserticola ir vispasaules daudzgadīgo tuksneša augu ģints no Orobanchaceae dzimtas, un tā ir pilnīgi nefotosintētiska suga un parasti aug pazemē holoparazītu augs. Tas parazitē uz psammofīta Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) saknēm, kas galvenokārt apdzīvo tuksnešus un pustuksnešus, jo ir ļoti izturīgi pret sausumu un sāļumu. C. deserticola ir spēcīga pretestība skarbajiem vides apstākļiem un galvenokārt izplatīta Ķīnas ziemeļrietumos, īpaši Iekšējā Mongolijā, Gansu un Siņdzjanā. Pēdējos gados tā tiek uzskatīta par apdraudētu savvaļas sugu, jo pieaug cilvēku patēriņš. C. deserticola, ko bieži sauc par tuksneša žeņšeņu, ir plaši pazīstama kā tuksneša slota, un žāvētais gaļīgais stublājs ir plaši izmantots kā tradicionāli svarīgs toniks Ķīnā un Japānā daudzus gadus. Sākotnēji tas tika ierakstīts Shen Nong Ben Cao Jing (ķīniešu valodas Materia Medica vārdnīca, 1977) aptuveni pirms 1800 gadiem un tika uzskatīts par vienu no galvenajiem avotiem.Ķīniešu ārstniecības augs Cistanche.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

C. deserticola ekstraktiem piemīt plašs ārstniecisko funkciju klāsts, īpaši izmantošanai seksuālās funkcijas uzlabošanā, nieru tonizācijā, aknu aizsardzībā, aperienta aktivitātē, atmiņas uzlabošanā, imūnmodulējošā, antioksidanta aktivitātē, pretiekaisuma, pretvīrusu aktivitātē utt. galvenās C. deserticola bioaktīvās sastāvdaļas ir feniletanoīdu glikozīdi (PheGs, PhGs). Līdz šim no C.deserticola sulīgā stumbra ir izolēti vairāk nekā 20 feniletanoīdu glikozīdi. Viņu vidūakteozīds un ehinakozīdsir divas galvenās sastāvdaļas ar ievērojamām farmakoloģiskām aktivitātēm, un tās ir dokumentētas kā C. deserticola kvalitātes standarti Ķīnas farmakopejā (2005. un 2010. gada izdevumos). Trīs PhG ķīmiskās sastāvdaļas ir organiskā skābe, saharīds un feniletanoīds, tomēr sīkāka informācija par feniletanoīdu biosintēzes ceļiem joprojām ir slikti saprotama C. deserticola.

Neskatoties uz C.deserticola komerciālo un medicīnisko nozīmi, šīs sugas genomikas un transkriptomijas dati ir ļoti ierobežoti. NCBI datubāzē nav pieejami EST, un pilnīga informācija par genomu par šo sugu joprojām nav pieejama, izņemot hloroplastu genoma secību. Ierobežotie transkriptomiskie dati kavē PhG biosintēzes mehānismu izpēti. RNS-seq tehnoloģija var ģenerēt mērķa genoma izteikto daļu sekvences un identificēt gēnus [18], izmantojot NGS tehnoloģiju platformas (piemēram, Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq un Roche 454). Tas kļūst arvien populārāks transkriptu de novo montāžā, jo tā ir rentabla un jaudīga pieeja ar augstu izšķirtspēju un plašu dinamisko diapazonu, jo īpaši tāpēc, ka tai ir priekšrocība izpētīt zemas pārpilnības transkriptus. Dažādo priekšrocību dēļ RNA-seq ir īpaši pievilcīgs organismiem, kas nav modeļi ar ierobežotiem ģenētiskajiem resursiem. Tomēr nav detalizētu pētījumu par C. deserticola transkriptu ar RNS-seq.

Šajā pētījumā mēs globāli sekvencējām C. deserticola cilmes transkriptu, izmantojot Illumina Hiseq2000 platformu, un ieguvām 7,9 G neapstrādātus datus. Veicot montāžu un anotāciju, mēs ieguvām PhG biosintēzē iesaistītos gēnus un gēnus, kas ir atbildīgi par visu lignīna biosintēzi. Mūsu RNS-seq analīze radīja pirmo C. deserticola konsensa transkriptu un sniedza jaunu ieskatu visaptverošā izpratnē par C. deserticola ārstniecisko vērtību. Turklāt šeit aprakstīto metodi var plaši izmantot profila transkriptiem, lai atvieglotu gēnu atklāšanu, kas iesaistīti specifiskos zāļu komponentu biosintēzes ceļos citā ārstniecības augā ar ļoti ierobežotiem genoma resursiem.

Materiāli un metodes

Augu materiālu savākšana

Svaigie sulīgie C. deserticola stublāji rakšanas stadijā tika savākti no augu bāzes BayanHot City of Alxa League Iekšējā Mongolijā Ķīnas ziemeļrietumos. Kolekcionēšanas atļauja tika iegūta no rūpnīcas bāzes īpašnieka (HongKui CongRong Group). Vaučera paraugs tika deponēts Ķīnas Zinātņu akadēmijas Pekinas Genomikas institūta Genomikas pamatstruktūrā. Pēc tīrīšanas sulīgos stublāju audus sagriež mazos gabaliņos un nekavējoties sasaldēja šķidrā slāpeklī, un pēc tam uzglabāja -80 grādu temperatūrā līdz turpmākai apstrādei.

RNS ekstrakcija, cDNS bibliotēkas veidošana un Illumina sekvencēšana

Kopējā RNS tika ekstrahēta no sulīgā stumbra, izmantojot TRIzol reaģentu (Invitrogen Inc., Kalifornija, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Iegūtie paraugi tika apstrādāti ar DNāzi I, lai noņemtu jebkādu genoma DNS. Ekstrahēto RNS kvantitatīvi noteica, izmantojot Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent Technologies), un pārbaudīja integritāti, izmantojot denaturējošā agarozes gēla elektroforēzi ar etīdija bromīda krāsošanu. Turpmākajās analīzēs tika izmantoti RNS paraugi ar A260/A280 attiecību no 1,9 līdz 2,1, RNS 28S:18S attiecību, kas lielāka par 1,0, un RNS integritātes skaitļiem (RIN) -8,5.

RNS-seq bibliotēkas tika izveidotas, izmantojot Illumina Truseq RNS paraugu sagatavošanas komplektus. Poli(A)+ RNS tika izolēta no kopējās RNS, izmantojot Dynal ligo(dT)25 lodītes saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc attīrīšanas tika pievienots fragmentācijas buferis, lai sadalītu mRNS īsos fragmentos. Pirmās virknes cDNS tika sintezēta, izmantojot šos īsos fragmentus kā veidnes, kā arī SuperScript III reverso transkriptāzi un N6 izlases heksamēra praimeru. Pēc tam otrās virknes cDNS tika sintezēta, izmantojot buferšķīdumu, dNTP, RNāziH un DNS polimerāzi I. Iegūtā divpavedienu cDNS tika pakļauta gala remontam, izmantojot T4 DNS polimerāzi, DNS polimerāzes I Klenova fragmentu un T4 polinukleotīda kināzi, un ligēja ar T4 polinukleotīdu kināzi. adapteri, izmantojot T4 DNS ligāzi. Ar adapteri ligētie fragmenti tika attīrīti, izmantojot QiaQuick PCR ekstrakcijas komplektu, un eluēti ar EB buferšķīdumu. Pēc analīzes, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi, piemēroti fragmenti tika atlasīti kā veidnes PCR amplifikācijai. Iegūtās cDNS bibliotēkas sekvencēšana tika veikta ar Illumina HiSeq 2000 sistēmu.

Transkriptu de novo montāža un gēnu ekspresijas kvantitatīva noteikšana

Neapstrādāti nolasījumi, kas iegūti no sekvencēšanas, tika notīrīti, noņemot adaptera secības (ATCTCGTATGCCGTC), izmantojot iekšējo metodi. Pēc tam mēs veicām stingru zemas kvalitātes filtrēšanas procesu. Pirmkārt, bāzes, kuru phred kvalitātes rādītājs ir zemāks par 20, tiks apgrieztas no secības 3' gala, līdz tās nonāk vienā bāzē ar augstāku kvalitāti (lielāka par vai vienāda ar 20). Ja lasīšanas garums būtu mazāks par 50 bp, tas tiktu atmests. Otrkārt, lasījumi tiks tālāk filtrēti pēc kritērija, ka vienā lasījumā 70% bāzu ir augstas kvalitātes rādītāji (lielāks vai vienāds ar 20). Treškārt, turpmākai montāžai tika izmantoti tikai pāra gala nolasījumi. De novo transkripta montāža tika veikta, izmantojot Trinity laidienu_20130216 [30], kas sastāvēja no trim secīgiem programmatūras moduļiem: Inchworm, Chrysalis un Butterfly. Montāžas parametri tika iestatīti šādi: -seqType fq-JM 300G -min_contig_longth 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.

Lai kvantitatīvi noteiktu transkriptu pārpilnību, sekvencētie pāra gala nolasījumi tika atkārtoti saskaņoti ar saliktajiem transkriptiem, izmantojot skriptu programmā Trinity. Kartētie nolasījumi tika izmantoti kvantitatīvai noteikšanai, izmantojot RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) programmatūru. Gēnu vai izoformu pārpilnība tika attēlota ar fragmentu uz transkripta kilobāzi uz miljonu kartēto fragmentu (FPKM) vērtību; tie transkripti, kuru FPKM vērtība ir vienāda vai lielāka par 0.05, tika definēti kā izteikti.

Izteikto atšifrējumu funkcionālā anotācija

C. deserticola gēnu anotācijas kopas nav, izņemot hloroplasta genomu [1]. Mēs anotējām izteiktos atšifrējumus, salīdzinot tos ar Genbank Nt, Genbank Nr un TAIR10_ pep_20101214_atjauninātajām datu kopām atsevišķi, izmantojot programmu BLAST (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Gēnu ontoloģijas un KEGG ceļa anotācija Pēc secības līdzības pielīdzināšanas Uniprot datu bāzei (Gēnu ontoloģijas (GO) anotācija visiem saliktajiem transkriptiem tika iegūta, izmantojot asociācijas failu, kas lejupielādēts no (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/). datu bāzes/GO/goa/UNIPROT/gene{0}}goa_uniprot.gz). CC, BP ​​un ​​MF kategorijas atsevišķi.

KEGG ceļa informācija tika piešķirta visām prognozētajām olbaltumvielu sekvencēm, izmantojot tiešsaistes rīku KAAS (KEGG automātisko anotāciju serveris) [34]. Sekvences fasta formātā tika iesniegtas KAAS pieprasījumam, un tika lejupielādēti iegūtie faili ar visu ceļu informācijas informāciju, kas saistīta ar C. deserticola stumbra transkriptu. Anotācijai tika izmantotas 13 augu organismu gēnu datu kopas KEGG, izmantojot BBH (bi-directional best hit) metodi.

NATURAL CISTANHE TUBULOSA CISTANHE EKSTRAKTS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RT-qPCR analīze

Pēc sagremošanas ar DNāzi I aptuveni 5 ug kopējās RNS tika pārveidoti par pirmās virknes cDNS, izmantojot reversās transkripcijas reakciju ar oligo(dT)15 primeriem un GoScript reversās transkripcijas sistēmu (Promega). Pēc tam cDNS produkti tika atšķaidīti 10-kārtīgi ar dejonizētu ūdeni, kas nesatur nukleāzi, pirms tos izmantoja kā veidni reāllaika PCR. Specifiskas cDNS tika pastiprinātas ar GoTaq 2-Step RT-qPCR sistēmu (Promega) 20 ul tilpumā. PCR amplifikācija tika veikta 60 grādu atkausēšanas temperatūrā ar 7500 reāllaika PCR noteikšanas sistēmu (Applied Biosystems) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Relatīvais transkriptu daudzums tika aprēķināts, izmantojot salīdzinošo cikla sliekšņa metodi ar gēnu “comp10579_c0” kā iekšējo standartu, izmantojot programmatūru 7500 Manager.

Primeru pāri RT-PCR tika izstrādāti, pamatojoties uz tiešsaistes programmatūru (//primer3.ut.ee/), un ir uzskaitīti S1 datu kopā.

Rezultāti

C. deserticola gaļīgā stumbra RNS sekvencēšana un de novo transkripta montāža

C. deserticola kāts ir plaši izmantots kā tradicionāli svarīgs toniks Ķīnā un Japānā daudzus gadus. Lai iegūtu globālu pārskatu par gēnu ekspresiju C. deserticola gaļīgajā stublājā, mēs savācām vienas un tās pašas augu bāzes C. deserticola stumbra paraugus attiecīgi 2013. un 2014. gadā. Kopējās RNS tika ekstrahētas un poliA + RNS tika attīrītas, lai izveidotu pāra gala RNS-seq bibliotēkas. Izmantojot Illumina HiSeq 2000 sekvencēšanu, tika iegūti 79 433 734 un 86 019 176 pāru gala nolasījumi, kas atbilst gandrīz 8 miljardiem un 8,6 miljardiem secības bāzu.

platforma 2013-gada un 2014-gada paraugos (1. tabula). Pēc adapteru secību noņemšanas un zemas kvalitātes nolasījumu filtrēšanas (sīkāku informāciju skatiet sadaļā Metodes), de novo transkripta montāžai tika izmantoti 64 831 040 augstas kvalitātes pāru gala nolasījumi 2013-gada paraugā. Izmantojot Trinity secību montētāju [30], tika ģenerēti 51 719 gēni un 95 787 transkripta sekvences ar transkripta garumu no 200 līdz 15 698 bp. Vidējais salikto stenogrammu garums ir 950 bāzes un N50 garums ir 1519 bāzes. Dažāda garuma transkriptu skaits atklāja, ka 57, 32% no saliktajiem transkriptiem bija aptuveni 500 bp vai garāki (1.A attēls). Augstas kvalitātes pāru beigu lasījumi 2014-gada paraugā tika kartēti ar salikto transkriptu. Turklāt mēs noskaidrojām, ka katra samontētā gēna transkripta numurs mainījās un 69% gēnu ar vienu izteiktu izoformu, savukārt 31% gēnu izteica divus vai vairākus transkriptus (1.B attēls).

Samontēto stenogrammu izteiksmju kvantitatīva noteikšana un funkcionālā anotācija

Gēnu vai transkriptu pārpilnība tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot RSEM pakotni, kurā secīgie nolasījumi tika atkārtoti saskaņoti ar samontētajiem gēniem vai transkriptu sekvencēm, izmantojot Bowtie, un šie kartētie nolasījumi tika izmantoti kvantitatīvai noteikšanai. Katram gēnam vai transkriptam tika aprēķināta FPKM vērtība, un, visbeidzot, mēs identificējām 63 957 un 52 857 aktīvi izteiktus transkriptus (FPKM vērtība ir lielāka vai vienāda ar 0.5) C. deserticola gaļīgajos stumbra paraugos 2{{17} }attiecīgi 13 un 2014. Divos atkārtojumos parasti tika izteikti 44 776 atšifrējumi (70,01% 2013-gadu izlasē, 84,71% 2014-gadu izlasē), un to izteiksmes datu korelācija (Pīrsona korelācijas koeficients: 0,91979) parādīts S1 attēlā. Sekvences izejas dati tika augšupielādēti NCBI SRA datu bāzē (piekļuves numuri: SRX857402 un SRX858938). Tālākai analīzei izmantojām izteiktus gēnus, kas identificēti 2013-gada paraugā. Funkcionālās anotācijas informācija visiem izteiktajiem transkriptiem tika iegūta, izmantojot divas metodes. Pirmkārt, visi izteiktie transkripti tika saskaņoti ar zināmām nukleotīdu (GenBank nt) un peptīdu secību datu bāzēm (GenBank nr un Arabidopsis peptīds) atsevišķi, izmantojot BLAST algoritmu. No 63 957 izteiktajiem atšifrējumiem,

29 220 (45,7%) tika anotēti un uzrādīja homoloģiju ar sekvencēm jebkurā no trim subjektu datubāzēm ar E-vērtības robežvērtību 1e-20. Tikmēr kandidātu kodēšanas reģioni visām izteiktajām transkripta sekvencēm tika prognozēti, izmantojot programmatūru TransDecoder, un Pfam domēna meklēšanai tika izmantoti katra transkripta garākie ORF. Rezultātā, pamatojoties uz Pfam datu bāzi, tika anotēti 21 358 (33, 4%) atšifrējumi. Kopumā 30 098 (47, 1%) transkripti tika būtiski saskaņoti ar zināmiem gēniem publiskajās datu bāzēs, apvienojot abas iepriekš minētās metodes. Pilns izteikto transkriptu saraksts ar funkciju anotāciju tika parādīts papildu datos (S2 datu kopa).

Mēs aptaujājām 20 visaugstāk izteiktos transkriptus (2. tabula), kas atbilst 18,99% no visiem sekvencēšanas nolasījumiem, un noskaidrojām, ka lielākā daļa no tiem ir gēni, kas reaģē uz abiotiku.

stresa stimuls. Dehidrīns (DHN), hidrofilu un termostabilu stresa proteīnu klase ar lielu lādētu aminoskābju skaitu, kas pieder pie II grupas vēlīnās embrioģenēzes bagātīgās (LEA) ģimenes, ir visizteiktākais gēns. Trīs dažādi Dehirīna transkripti (komp28713_c0_seq1/2/4) tika atklāti kā izteikti gaļīgos kātos, kas var būt iesaistīti šūnu aizsardzībā no sausuma stresa izraisītiem bojājumiem. Tika konstatēti arī citi ar stresu saistīti gēni, piemēram, karstuma šoka proteīns, ar patogēnu saistīts proteīns un metalotioneīns, kas izteikti izteikti, kas var būt saistīts ar tā smago izdzīvošanas vidi. Turklāt daži konstitutīvi gēni, tostarp 26S ribosomu RNS gēns (samp ADP-ribosilācijas faktors (comp20499_ c0_seq1) arī bija ļoti transkribēts.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA IMUNITĀTES UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%