Izdalītajam neitrofilu želatināzi saistītajam lipokalīnam ir spēcīgāka spēja kavēt ADPKD šūnu cistu palielināšanos, salīdzinot ar neizdalīto formu Ⅲ

3.4. mNGAL ietekme uz 2L3 šūnu cistu veidošanos 3D kultūrā

Šūnu proliferācijair neparasti palielināts 2L3 pelēm un izraisa cistu veidošanos un palielināšanos [17]. Pamatojoties uz iepriekšējiem rezultātiem, ko mNGAL inhibēja2L3 šūnu proliferācija 2D kultūrā(3. attēls), mēs spekulējām, ka mNGAL varētu vēl vairāk kavēt cistu veidošanos 2L3 šūnās. Lai izpētītu, vai mNGAL varētu kavēt cistu veidošanos 2L3 šūnās, mēs izveidojām 3D kultūras platformu, kas nodrošināja atbilstošu vidi ar Matrigel cistu veidošanai (6. attēls). Šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs (1000 šūnas/iedobē) virs iepriekš sagatavotā Matrigel uz nakti. Pēc tam, kad šūnas tika pievienotas gēlam, šūnām tika pievienots vairāk Matrigel, lai izveidotu sviestmaizi līdzīgu rakstu (6.A attēls). Šūnas tika turētas 3D kultūrā 37 ◦C temperatūrā un 5% CO2 vismaz 5 dienas, lai veidotos cistas. Cistas 3D kultūrā pieauga lielākas ar ilgāku kultivēšanas laiku (6.B attēls). Lai apstiprinātu, ka 3D kultūrā novērotās sfēriskās konstrukcijas bija cistas ar lūmenu, mēs tās fiksējām un iekrāsojām ar DAPI un E-kadherīna un aktīna antivielām, lai identificētu attiecīgi šūnu kodolus, šūnu šūnu adh, ēziju un apikālo membrānu. Ar konfokālo mikroskopiju tika novērotas dažādas 2L3 cistas optiskās z sekcijas 3D kultūrā no augšas (1. slānis) līdz vidum (5. slānis), un lūmenis tika apstiprināts sfēriskajā cistā (6.C attēls, Papildu materiāls

Peles NGAL (NP_032517.1) un cilvēka NGAL (NP_005555.2) ir attiecīgi 200-aa un 198-aa proteīni, un abiem ir {{6 }}aa signālpeptīds sekrēcijai, kas atrodas NGAL proteīna N-galā (7.A attēls). Secību salīdzinājums parādīja 62% identitāti un 80% pozitivitāti starp peles NGAL un cilvēka NGAL. Tika pierādīts, ka peles NGAL ir divas ar N-saistītas glikozilācijas vietas uz asparagīna (Asn, N) pie 81. un 85. aa, savukārt cilvēka NGAL bija viena vieta pie 85. aa (7.A attēls), atklājot atšķirību starp tām pēctranslācijas modifikācijā.

7. attēls. Transfekcijas ar pN + LS un pN - LS ietekme uz NGAL ekspresiju un šūnu proliferāciju 2L3 šūnās. (A) Peles NGAL (NP_032517.1) un cilvēka NGAL (NP_005555.2) proteīnu saskaņošana. 20-aa signāla peptīdi ir parādīti zilā krāsā. Divas ziņotās ar N saistītās glikozilācijas vietas uz Asn (N) peles NGAL 81. un 85. punktā un viena cilvēka NGAL 85. aa ir atzīmētas ar zvaigznīti (*). Identitātes: nepārtraukta līnija; pozitīvie punkti: pārī savienoti punkti. Iepriekš minētā secības informācija ir no BLASTP programmas Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) vietnē. (B) Izveidojiet mNGAL diagrammu ar (pN + LS) vai bez (pN − LS) izdalīto Igκ līdersekvenci uz pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd vektora. (C) Gēla elektroforēzes rezultāts apstiprināja pN + LS (647 bp) un pN - LS (587 bp) konstrukciju, kas sagremota ar NheI un NotI. (D) Infekcijas laika skala un 2L3 šūnu atlase ar pN + LSun pN − LS, attiecīgi. 2L3 šūnas tika inficētas pN + LS vai pN - LS 6a iedobes plāksnē 1. dienā. Selekcija ar blasticidīnu sākās 2. dienā, un barotne tika mainīta ik pēc 3 dienām. Pēc nedēļas atlases šūnas tika savāktas, lai tās analizētu ar RT-QPCR, Western blot un ELISA. (E) Reportera eGFP ekspresijas noteikšana, lai pārbaudītu pN + LS un pN - LS transfekcijas efektivitāti 2. dienā. Apmēram 10% šūnu bija inficētas ar GFP konstrukciju. Mēroga josla: 50 µm. RT-qPCR rezultāti parādīja, ka gan pN + LS, gan pN -LS bija augstāka Lcn2 (attēlots kopējais NGAL līmenis) (F) un c-myc (pārstāvēts transficēts eksogēnā NGAL līmenis) (G) ekspresija, salīdzinot ar kontroles grupu. (H) Starp grupām nebija būtiskas atšķirības oinSlc22a17 (NGAL-R). RQ: relatīvā kvantifikācija=2−∆∆Ct; Gapdh tika izmantots kā katra parauga iekšējā kontrole. Vērtības tika normalizētas kontroles grupai. (I) Western blot rezultāti parādīja, ka pN + LS un pN - LS bija augstāka NGAL ekspresija nekā kontroles grupai. (J) ELISA parādīja, ka pN + LS un pN - LS šūnas ganizdalīja ievērojami augstāku NGAL nekā kontroles grupa, savukārt izdalītais pN-LS šūnu NGAL daudzums bija ievērojami mazāks nekā pN + LS šūnas. (K) BrdU iekļaušana parādīja, ka pN + LS un pN - LS šūnām bija zemāks šūnu proliferācijas koeficients nekā kontroles grupai, savukārt pN - LS šūnām bija augstāka nekā pN + LS šūnām. Studenta t-tests tika veikts, lai noteiktu nozīmīgumu starp abām grupām (n=3 RT-qPCR un ELISA, n=4 Western blot un BrdU inkorporācijā). *p < 0.05; ** p < {{10}}.01; *** p < 0,001 pret katras grupas 2L3; # p < 0,05; ### p < 0,001 pret pN + LS grupu; ns: nav būtiskas atšķirības.

Šajā pētījumā mēs izmantojām peles Igκ ķēdes līdersekvenci (LS) [44], nevis sākotnējo mNGAL signālpeptīdu, lai nodrošinātu palielinātu eksogēnā mNGAL proteīna sekrēciju. Lai pārmērīgi ekspresētu izdalīto vai neizdalīto NGAL, tika izmantoti NGAL ar vai bez LS pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd vektori, proti, pN + LS un pN − LS, un tie ir parādīti 7.B attēlā. Divi promotori, pCMV un hPGK, tika izmantoti, lai vadītu divu proteīnu, NGAL-c-myc-His6 un eGFP, neatkarīgu ekspresiju. Lai nodrošinātu konstrukcijas ievietošanu, abu plazmīdu sagremošanai tika izmantoti NheI un NotI, un gēla elektroforēzes rezultāti parādīja 647-bp joslu no pN + LS un 587-bp joslu no pN − LS (jo trūkst 60-bp līdera secības) (7. C attēls).

Lai inficētu pN + LS un pN-SP 2L3 šūnās, šūnām pievienoja polibrēnu un lentivīrusu un inkubēja 37 ◦C 24 stundas, kam sekoja selekcija ar blasticidīnu (7.D attēls). GFP ekspresijas noteikšana tika veikta ar fluorescences mikroskopiju pēc inficēšanās (7.E attēls). Inficētās šūnas tika novāktas vienu nedēļu pēc blasticidīna atlases RT-qPCR, Western blot un ELISA, lai analizētu NGAL ekspresijas līmeni (7.F – J attēls). RT-qPCR rezultāti parādīja, ka 2L3 šūnu inficēšanās ar pN + LS un pN - LS izraisīja Lcn2 (7.F attēls) un Lcn2-c-myc (7.G attēls), kas atspoguļo kopējās koncentrācijas līmeni. un attiecīgi eksogēnā NGAL, kamēr Slc22a17 (NGAL-R) ekspresijas līmeņos nebija atšķirību (7.H attēls). Western blot rezultāti parādīja, ka pN + LS un pN - LS šūnām bija augstāks intracelulārās NGAL ekspresijas līmenis nekā kontroles 2L3 šūnām (7.I attēls). Šūnu supernatanta ELISA rezultāti parādīja, ka gan pN + LS, gan pN -LS šūnām bija ievērojami augstāks izdalītā NGAL līmenis nekā 2L3 šūnu kontroles grupā (7.J attēls). Turklāt pN – LS šūnu izdalītais NGAL daudzums bija ievērojami mazāks nekā pN + LS šūnu sekrētais daudzums (7.J attēls), savukārt abām grupām bija līdzīgi NGAL ekspresijas līmeņi (7.I attēls). Šis atklājums apstiprināja mūsu prognozi, ka NGAL pārmērīga ekspresija bez signālpeptīda (pN – LS) ierobežoja NGAL sekrēciju, neskatoties uz augsta intracelulārā NGAL līmeņa klātbūtni. Lai noskaidrotu, vai izdalītais NGAL, nevis neizdalītais NGAL kavē šūnu proliferāciju, tika veikts BrdU iekļaušanas tests, kas parādīja, ka pN + LS un pN - LS šūnām bija ievērojami zemāka proliferācija nekā kontroles grupai (7.K attēls). Turklāt pN - LS šūnām bija ievērojami augstāka proliferācija nekā pN + LS šūnām (7K attēls). Šie rezultāti liecināja, ka NGAL sekrēcija no 2L3 šūnām bija nepieciešama, lai kavētu šūnu proliferāciju.

3.6. Garīgās pārmērīgas ekspresijas ietekme, kas noved pie signalizācijas ceļiem 2L3 šūnās

Pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem rezultātiem, kas liecina, ka mNGAL var inhibēt ERK un AKT ceļus 2L3 šūnās (4. attēls) un vēl vairāk samazināt šūnu proliferāciju (3. attēls) un cistu palielināšanos (6. attēls), mēs izmantojām Western blotēšanu, lai analizētu, vai ERK un AKT. ceļi tika ietekmēti pN + LS un pN - LS šūnās (8. attēls). Western blot rezultāti parādīja, ka pN + LS un pN − LS grupām bija ievērojami zemāka p-ERK (T202/Y204)/ERK attiecība nekā kontroles grupai, un pN − LS grupā bija augstāka p-ERK attiecība. (T202/Y204)/ERK nekā pN + LS grupa (8.A attēls). P-AKT (S473)/AKT attiecība bija zemāka pN + LS grupā nekā kontroles grupā, savukārt pN - LS šūnas būtiski neatšķīrās no kontroles un pN + LS grupām (8.B attēls). P-CREB (S133)/CREB attiecība bija ievērojami augstāka pN − LS grupā nekā pN + LS grupā, savukārt ne pN + LS, ne pN − LS neuzrādīja būtisku atšķirību no kontroles grupas (8. C attēls). Šie rezultāti liecināja, ka pN + LS un pN − LS bija statistiski nozīmīgas p-ERK/ERK attiecības atšķirības (8.A attēls), savukārt pN + LS grupa neuzrādīja labāku efektu AKT (8.B attēls) un CREB. 8C) aktivizēšana.

Saskaņā ar iepriekšējiem rezultātiem, ka mNGAL lietošana var izraisīt apoptozi (3. attēls) un autofagiju 2L3 šūnās (5. attēls) un samazināt šūnu proliferāciju (3. attēls) un cistu palielināšanos (6. attēls), mēs izmantojām Western blot, lai izpētītu ietekmi uz apoptozi. un autofagija pN + LS un pN - LS šūnās (9. attēls). Western blot rezultāti parādīja, ka pN + LS šūnām bija ievērojami augstāka šķelto/pro-kaspāzes -3 (9.A attēls) un šķelto/pro-PARP (9.B attēls) attiecība nekā kontroles grupā; pN − LS šūnas neuzrādīja būtisku atšķirību šķelto/pro-kaspāzes-3 (9.A attēls) un šķelto/pro-PARP (9.B attēls) attiecībās, salīdzinot ar kontroles grupu, un šķelto-kaspāzes attiecību. /pro-kaspāzes -3 bija ievērojami zemāks nekā pN + LS grupā (9.B attēls). Šie rezultāti parādīja, ka izdalītā NGAL pārmērīga ekspresija, nevis neizdalītā NGAL, izraisīja apoptozi 2L3 šūnās.

Lielāka LC3B II/LC3B I attiecība (9.C attēls) un zemāka p62/GAPDH attiecība (9.D attēls) tika identificēta pN + LS šūnās, salīdzinot ar kontroles grupu; pN − LS šūnām nebija būtisku atšķirību LC3B II/LC3B I (9.C attēls) un p62/GAPDH (9.D attēls) attiecībās, salīdzinot ar kontroles grupu, un LC3B II/LC3B I attiecība bija ievērojami zemāka nekā pN + LS grupa (9.C attēls). Šis rezultāts atklāja, ka izdalītā NGAL pārmērīga ekspresija, nevis neizdalītā NGAL, izraisīja autofagiju 2L3 šūnās.

3.7. mNGAL pārmērīgas ekspresijas ietekme uz 2L3 šūnu cistu veidošanos 3D kultūrā

Pamatojoties uz iepriekšējiem rezultātiem, ka mNGAL inhibēja 2L3 šūnu proliferāciju un cistu palielināšanos attiecīgi 2D un 3D kultūrā (3. un 6. attēls), mums bija aizdomas, ka izdalītā NGAL pārmērīga ekspresija varētu vēl vairāk kavēt 2L3 šūnu cistu palielināšanos, kavējot šūnu proliferāciju ( 7K attēls).

Lai izpētītu NGAL pārmērīgas ekspresijas ietekmi 2L3 šūnās uz cistu veidošanos, 2L3 kontroles, pN + LS un pN - LS šūnas tika apstrādātas ar forskolīnu 1.–3. dienā, lai izraisītu cistu veidošanos. Cistu diametrs, laukums un skaits tika mērīts katru dienu pēc forskolīna indukcijas (10.A attēls). 2L3 kontroles, pN + LS un pN - LS šūnu cistas 3D kultūrā pieauga atkarībā no kultivēšanas dienām (10.B attēls), un tām bija acīmredzamas cistu lieluma atšķirības no 4. līdz 8. dienai. pN + LS grupai bija ievērojami mazāki cistu diametri (10.C attēls) un laukumi (10.D attēls) nekā kontroles grupai no 4. līdz 8. dienai, savukārt pN – LS grupai cistu diametrs bija ievērojami mazāks nekā kontroles grupai 6. un 8. dienā (10. C. attēls). Starp kontroles un pN - LS grupām nebija būtiskas atšķirības cistu zonā. Turklāt pN - LS grupai bija ievērojami lielāki cistu diametri un laukumi nekā pN + LS grupai 8. dienā (10C, D attēls). Lai gan nebija būtiskas atšķirības cistu skaita pieauguma ātrumā starp kontroles, pN + LS un pN − LS šūnām (10. E attēls), pN + LS un pN - LS grupās abās lielās (diametrs > 100 µm) cistas nekā kontroles grupai (10.F attēls) no 4. līdz 8. dienai. Šie rezultāti parādīja, ka pN + LS un pN - LS abi kavē cistu palielināšanos, savukārt pN - LS inhibējošā iedarbība bija vājāka nekā pN + LS. . Šis atklājums atklāja, ka izdalītā mNGAL pārmērīga ekspresija spēja kavēt 2L3 šūnu cistu palielināšanos 3D kultūrā nekā neizdalītā mNGAL.

-Tika veikts tests, lai noteiktu nozīmīgumu starp grupām (n=3). * p < 0.05; *** p < 0,001 pret kontroles grupu; # p < 0,05 pret pN + LS grupu

kaspāzes {{0}} (A) un šķelto/pro-PARP (B) nekā kontroles grupai, kas pārstāvēja apoptozes indukciju ar izdalīto mNGAL. pN − LS šūnām nebija būtiskas atšķirības šķeltās-/pro-kaspāzes-3 un šķeltās/pro-PARP attiecībās salīdzinājumā ar kontroles grupu. pN + LS šūnām bija augstāka LC3B II/LC3B I (C) attiecība un zemāka p62 (D) attiecība, salīdzinot ar kontroles grupu. pN-LS šūnām nebija būtiskas atšķirības LC3B II/LC3B I un p62 attiecībās, salīdzinot ar kontroles grupu. Tubulīns, Vinculīns un GAPDH tika izmantoti kā katra parauga iekšējās kontroles. Vērtības tika normalizētas kontroles grupai. Studenta t-tests tika veikts, lai noteiktu nozīmīgumu starp grupām (n=3). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 pret kontroles grupu; # p < 0,05; ## p < 0,01 vs.pN + LS grupa.

9. attēls. mNGAL proteīna pārmērīgas ekspresijas ietekme uz apoptozi un autofagiju 2L3 šūnās. Western blot rezultāti parādīja, ka pN + LS šūnām bija ievērojami augstāka šķeltās-/pro-kaspāzes-3(A) un šķeltās/pro-PARP (B) attiecība nekā kontroles grupā, kas atspoguļoja apoptozes indukciju. ko izdala mNGAL. pN −LS šūnām nebija būtiskas atšķirības šķeltās-/pro-kaspāzes-3 un šķeltās/pro-PARP attiecībās, salīdzinot ar kontroles grupu. pN + LS šūnām bija augstāka LC3BII/LC3B I (C) attiecība un zemāka p62 (D) attiecība, salīdzinot ar kontroles grupu. pN - LS šūnām nebija būtiskas atšķirības LC3B II/LC3B I un p62 rtheatijā salīdzinājumā ar kontroles grupu. Tubulīns, Vinculīns un GAPDH tika izmantoti kā katra parauga iekšējās kontroles. Vērtības tika normalizētas kontroles grupai. Tika veikts Studenta t-tests, lai noteiktu nozīmīgumu starp grupām

(n {{0}}). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 pret kontroles grupu; # p < 0,05; ## p < 0,01 pret pN + LS grupu