Sidt2 ir galvenais proteīns autofagijas-lizosomu degradācijas ceļā un ir būtisks nieru struktūras un filtrācijas funkcijas uzturēšanai Ⅱ
Nov 07, 2023
DISKUSIJA
Liels skaits pētījumu ir parādījuši, ka LMP ir iesaistīti nieru darbībā vai strukturālā homeostāzē [21–25]. Mūsu iepriekšējais pētījums atklāja, ka LMP Sidt2 ietekmē iekaisuma signālu ceļu un izraisa peles glomerulāro mezangiālo šūnu bojājumus [28]. Šajā pētījumā pirmo reizi mēs pētījām LMP Sidt2 izraisīto ietekmi uz peles nieru struktūru un darbību. Tika konstatēts, ka Sidt2 dzēšana izraisīja peles nieres pēdas procesu saplūšanu, bazālās membrānas sabiezēšanu, nieru kanāliņu epitēlija šūnu tūsku, mikrovillu bojājumus un palielinātu proteīnūriju 24 stundās, kas liecina, ka Sidt2 zudums izraisa filtrācijas funkcijas traucējumus. un peles nieres struktūra, taču tās detalizētais mehānisms nav skaidrs.
Tā kā LMP ir svarīgas lizosomas funkcionālās vienības [17] unlizosomu disfunkcijair viens no izplatītākajiem daudzu hronisku nieru slimību (CDK) patogēniem faktoriem (atsauce [4, 29]), mēs esam veikuši saistītus lizosomu pētījumus pēc Sidt2 dzēšanas un konstatējuši, ka skābo lizosomu skaits ir samazinājies un nieru pH līmenis ir samazinājies. lizosomas palielinājās in vitro. Tomēr ar elektronu mikroskopijas analīzi nebija acīmredzamu izmaiņu primāro lizosomu skaitā, kas saistīti ar autofagosomām, un kopējo lizosomu skaitu. Katepsīni ir lielākā proteolītisko enzīmu grupa lizosomās [30], starp kurām CTSB ir viena no visbiežāk sastopamajām lizosomu proteāzēm [31].
Tā kā katepsīni ir jāpaskābina nobriešanai (aktivizēšanai), pH izmaiņas galu galā novedīs pie ievērojamas olbaltumvielu sadalīšanās samazināšanās [32]. In vivo un in vitro līmeņi uzrādīja samazinātu lizosomu skābes hidrolāzes aktivitāti un saturu, vēl vairāk apstiprinot, ka Sidt2 inhibē lizosomu funkciju, ietekmējot proteāžu nobriešanu lizosomās.
KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTU AUGU FORMULU CISTANHE NIERĒM
Tikmēr lizosoma darbojas kā pārstrādes centrs šūnu metabolītu un atkritumu produktu noārdīšanai autofagijas beigās [1]. Normāla lizosomu degradācijas funkcija ir būtiska autofagijai, saglabājot šūnu homeostāzi un ļaujot šūnām izdzīvot fizioloģiskos stāvokļos [33–36]. Ir pierādīts, ka daudzu nieru slimību rašanās un attīstība ir saistīta ar patoloģisku autofagiju [37–39]. Nesenie pētījumi atklāja, ka Sidt2 ir lizosomu DNS / RNS transportētājs. Netradicionālie autofagijas veidi, izmantojot RNautofagiju un DNautofagiju (RDA), ir svarīgi selektīvai RNS/DNS degradācijai [40]. Mēs jau iepriekš esam noskaidrojuši, ka Sidt2 dzēšana bojā autofagosomu un lizosomu saplūšanu, izraisot bojāto mitohondriju nespēju noārdīties, kā rezultātā tiek bojāta skeleta muskuļu struktūra un funkcija [41]. Tāpēc šajā pētījumā mēs pētījām autofagiju, kad nieru bojājumus izraisīja Sidt2 dzēšana. Mēs novērojām, ka ar elektronu mikroskopijas palīdzību Sidt2 - / - peļu nierēs tika uzkrātas autofagolizosomas. Autofagija ir dinamisks process, kas ietver autofagosomu veidošanos un autofagolizosomu veidošanos un noārdīšanos. Agrīnu autofagosomu veidošanos kontrolē Atg gēns, un LC3-II veidošanās liecina par autofagosomu veidošanos [42]. Mēs atklājām, ka ar autofagiju saistīto proteīnu Atg un LC3-II ekspresijas palielinājās pēc Sidt2 dzēšanas, norādot, ka autofagijas aktivitāte var tikt pastiprināta. Tomēr LC3-II uzkrāšanos var izraisīt arī autofagolizosomu ceļa bloķēšana autofagijas beigās
Lai turpinātu izpētīt Sidt2 ietekmi uz nieru autofagijas stāvokli, tika izmērīta P62 kravas proteīna ekspresija un veidošanās, kā arī pētīta to zāļu iedarbība, kuru mērķis ir autofagija (CQ un RAPA). P62 ir jāapvieno ar LC3B un pēc tam jāsadala lizosomā. P62 proteīna līmeņa paaugstināšanās bieži norāda uz autofagijas plūsmas bloķēšanu [43]. Lai novērstu P62 ražošanas pieauguma cēloni, mēs izmērījām P62 mRNS līmeni un konstatējām, ka P62 ražošana ir samazināta, tāpēc LC3-II uzkrāšanās, iespējams, bija traucēta degradācijas dēļ. Lai turpinātu izpētīt autofagijas procesu, mēs veicām hlorokvīna flip eksperimentu. Hlorokvīns var neitralizēt lizosomas skābo vidi un pēc tam iznīcināt lizosomas darbību un kavēt autofagiju [44]. LC3-II proteīna palielināšanās pirms un pēc CQ apstrādes atspoguļo lizosomu degradēto autofagosomu skaitu, kas var atspoguļot autofagijas aktivitāti. To pašu CQ flip testu var izmantot arī, lai noteiktu P62 noārdīšanās apjomu autofagolizosomu ceļā. Saskaņā ar mūsu rezultātiem Sidt2 dzēšana izraisīja autofagijas plūsmas samazināšanos autofagijas bloķētā gala dēļ. Tajā pašā laikā RAPA eksperimentā LC3-II un P62 proteīna līmenis ievērojami palielinājās Sidt2−/− grupā, kas var vēl vairāk apstiprināt, ka Sidt2 trūkums pasliktina autofagijas beigu fāzi.
Autofagijas beigu fāze ietver autofagolizosomu veidošanos un degradāciju. Mēs izmantojām LAMP1 un LC3B imunofluorescences koplokalizācijas eksperimentus, lai noteiktu autofagosomu un lizosomu saplūšanu [45, 46], un rezultāti parādīja, ka pēc Sidt2 dzēšanas tika bloķēta autofagosomu un lizosomu saplūšana. Ad-mCherry-GFP-LC3B dubultās marķēšanas eksperiments nosaka autofagolizosomu veidošanos un noārdīšanos [27]. Tas arī apstiprināja, ka autofagolizosomu veidošanās un degradācijas bloķēšana ir galvenais iemesls nieru struktūras un funkcijas bojājumiem pēc Sidt2 dzēšanas.
No iepriekšminētajiem rezultātiem mēs varam secināt, ka Sidt2 trūkums izraisa skābo lizosomu skaita samazināšanos un ka lizosomu paskābināšanas disfunkcija ietekmē hidrolizēto enzīmu nobriešanu. Tas var būt vissvarīgākais autofagijas-lizosomu degradācijas ceļa bojājumu cēlonis papildus autofagosomu un lizosomu saplūšanas traucējumiem. Tikmēr traucētais autofagijas process var būt cieši saistīts ar bojāto nieru struktūru un filtra funkciju pēc Sidt2 dzēšanas (8. att.). Mūsu pētījumā aplūkota tikai daļa no Sidt2 ietekmes uz nieru struktūru un darbību, bet interesanti ir tas, ka galveno autofagijas proteīnu uzkrāšanās un nieru struktūras un funkcijas traucējumi, ko izraisa Sidt2 dzēšana, ir līdzīgi izmaiņām galvenajos autofagijas proteīnos un ievērojami palielināja proteīnūriju, kas novērota diabētiskās nefropātijas gadījumā [37, 47]. Lizosomu funkcijas atjaunošana var būt potenciāla jauna stratēģija diabētiskās nefropātijas ārstēšanā [37]. Mēs sagaidām, ka Sidt2 nodrošinās veidu, kā nākotnē izpētīt nieru slimību patoģenēzi un ārstēšanu.
Urīna proteīna testēšana pelēm Nejauši atlasītas 12-nedēļu vecas WT peles un Sidt2−/− vīriešu kārtas peles tika ievietotas vielmaiņas būros un tukšā dūšā, bet tika dotas ar ūdeni. Tika savākti 24 stundu urīna paraugi un pēc tam pārbaudīti urīna proteīni (Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts, CHN, C035-2-1) (sīkākas metodes, lūdzu, skatiet Papildu materiālos). Šūnas MPC5 peles glomerulārie podocīti tika iegādāti no BeNa Culture Collection un kultivēti ar 10% FBS (Excell Bio, Dienvidamerika, FSP500) un zema glikozes līmeņa DMEM (Sigma-Aldrich, 6046). SV40 MES 13 peles glomerulārās mezangiālās šūnas tika iegādātas no Ķīnas Zinātņu akadēmijas tipiskās kultūras saglabāšanas komitejas šūnu bankas un kultivētas ar 10% FBS (Excell Bio, Dienvidamerika, FSP500) un augsta glikozes līmeņa DMEM (Sigma-Aldrich, 6429). . Šūnu kultūras kastes CO2 koncentrācija tika uzturēta 5% un temperatūra tika uzturēta 37 grādu līmenī. Hlorokvīns (CQ) un rapamicīns (RAPA) tika iegādāti no Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ un 25 mg / ml rapamicīna tika izšķīdināti īpaši tīrā ūdenī. CQ tika pievienots Petri trauciņā tā, lai galīgā koncentrācija būtu 50 μM, un inkubēja 16 stundas kā autofagijas inhibitoru. Rapamicīnu pievienoja Petri trauciņai ar galīgo koncentrāciju 15 μM un inkubēja 2 stundas kā autofagijas aktivatoru. CRISPR/Cas9 gēnu rediģēšanas lentivirus vektoru sistēma tika izmantota, lai noņemtu Sidt2 gēnu Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang), tika iegādātas plazmīdas, un tika izmantots sgRNA tiešsaistes projektēšanas rīks (http://crispr.mit.edu/). izstrādāt sgRNS, kas mērķētas uz Sidt2.
Praimeru secības bija šādas: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, sintezēja biotehnoloģijas uzņēmums (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Izmantojot CRISPR/Cas9 lentivirus sistēmu, Lenticrispr-v2 plazmīda tika linearizēta un savienota ar atkvēlināto sgRNS dupleksu, lai izveidotu Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2 rekombinanto plazmīdu. Vigofect (Vigorous Biotechnology, Pekina, CHN) transfekcijas reaģents tika izmantots, lai transfekētu Lenticrispr-v2 plazmīdu un Lenticrispr-v2-Sidt2 rekombinanto plazmīdu, lai izveidotu lentivīrusu. Iegūtais lentivīruss tika transfekēts MPC5 šūnās un SV40 MES 13 šūnās. Pēc 48 stundām šūnas tika inkubētas ar purinomicīnu 72 stundas līdz atlasei. Izdzīvojušās šūnas bija Sidt2+/+ grupa un Sidt2−/− grupa, kas tika veiksmīgi transfektētas. RNS izolācija un reālā laika PCR tests Trizol (Invitrogen) tika izmantots, lai iegūtu RNS no peles nieru šūnām, un specifiskā RT-PCR metode bija tāda, kā aprakstīts iepriekš [21]. RT-PCR praimeru secības bija šādas: aktīns (sense: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (sense: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2 (sajūta: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′GGATG:TAGCAG'-GTG, RGTCATAG:5 {48}}′). Western blotēšana Specifiskā metode ir tāda, kā minēts iepriekš [28]. Šajā pētījumā primārās antivielas ietvēra trušu anti-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), trušu anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719), peles anti- -aktīnu (1:1000; Sigma Aldrich). A5316), trušu anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), trušu anti-Atg5 (1:1000; šūnu signalizācijas tehnoloģija 9980S), trušu anti-Atg7 (1:1000; šūnu signalizācijas tehnoloģija 8558S) , trušu anti-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), peles anti-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), trušu anti-katepsīns B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Šūnas tika inokulētas uz Nunc Petri trauciņiem ar stikla dibenu. Pēc audzēšanas līdz piemērotam blīvumam tika pievienots Ad-mCherry-GFP-LC3B (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 ml), kā rezultātā gala koncentrācija bija 10–11 vp/ml. Pēc 48 stundu stimulēšanas mCherry un GFP fluorescences punktu skaits tika tieši novērots lāzera konfokālajā mikroskopā (Leica SP8, Vācija). Imunofluorescence Šūnas tika inokulētas uz Petri trauciņiem ar stikla dibenu un fiksētas ar paraformaldehīdu. Pēc bloķēšanas šūnas inkubēja nakti ar primāro antivielu un pēc tam inkubēja ar sekundāro antivielu 90 minūtes tumsā. Šūnas tika fotografētas, izmantojot lāzera skenēšanas konfokālo mikroskopu (Leica SP8, Vācija) pēc kodolu krāsošanas ar DAPI (1 ug / ml). Primārās antivielas ietvēra P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); sekundārās antivielas ietvēra pretpeles sekundāro anti-Cy{128}}konjugēto Affinipure goat anti-peles IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-konjugēto Affinipure goat anti-peles IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- konjugēts Affinipure kazas anti-trušu IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Lietojumprogrammai LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046) mēs arī inokulējām šūnas uz Petri trauciņiem ar stikla dibenu. Pēc audzēšanas līdz piemērotam blīvumam šūnām tika pievienots šūnu kultūras šķidrums, kas satur LysoTracker galīgo koncentrāciju 75 nM, un kuras tika fotografētas pēc 45 m stimulācijas. Izmantojiet ImageJ, lai saskaitītu fluorescējošo punktu skaitu un Pīrsona korelācijas koeficientu. Transmisijas elektronu mikroskopa novērojumi No katras grupas nejauši tika atlasītas 3-5 12-nedēļas vecas Sidt2-/- un WT peļu tēviņi, lai sagatavotu nieru audu elektronu mikroskopijas paraugus, un konkrētā metode ir tāda, kā aprakstīts iepriekš [48] , nejauši nofotografējiet sekcijas, izmantojot elektronu mikroskopu, katrai pelei ir vairāk nekā 10 attēli, kas uzņemti no nieru sekcijām, nejauši izvēlieties 3–5 attēlus ar 8000 × palielinājumu no katras peles elektronu mikroskopa attēliem, aprēķiniet autofagolizosomu skaitu attēlā un salīdziniet Sidt2−/− grupu ar WT grupu. Attiecībā uz šūnu elektronu mikroskopa paraugu sagatavošanu nokasiet ne mazāk kā 105 šūnas ar šūnu skrāpi un savāciet tās EP mēģenē, pēc tam centrifugējiet ar ātrumu 800 apgr./min 5 m, izmetiet supernatantu un piepildiet to ar elektronu mikroskopa fiksatoru. Pēc uzglabāšanas 4 grādu ledusskapī ilgāk par 1 stundu to var nodot apskatei. Elektronu mikroskopa šāvienu uzņēma KingMed Diagnostics (Guandžou, Ķīna). LysoSensor Šūnas tika inokulētas uz 96-iedobes plāksnes. Pēc audzēšanas līdz piemērotam blīvumam tika pievienota iepriekš uzkarsēta (37 grādi) barotne, kas satur 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Šūnas tika inkubētas 5 minūtes 37 grādos, un pēc tam barotne tika noņemta un aizstāta pēc šūnu trīs reizes mazgāšanas ar PBS. WellScan režīms tika izmantots, lai nolasītu plāksni BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, ASV). Fluorescence tika mērīta, izmantojot Ex360nm/Em450nm un Ex380nm/Em540nm ierosmes/emisijas viļņu garumus, un lizosomu pH noteica no attiecības Em540 līdz Em450. Statistiskā analīze Rezultāti tika izteikti kā vidējais ± SEM. Divu grupu statistiskais salīdzinājums tika veikts, izmantojot nesapārotus t-testus. Kad statistiskajai analīzei tika izmantota programmatūra Graphics 8.0, P < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu. Katra eksperimentu grupa šajā pētījumā tika atkārtota vismaz trīs reizes neatkarīgi. DATU PIEEJAMĪBA Pašreizējā pētījuma laikā ģenerētās un/vai analizētās datu kopas pēc pamatota pieprasījuma ir pieejamas no attiecīgā autora.
ATSAUCES
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Signāli no lizosomas: šūnu attīrīšanas un enerģijas metabolisma kontroles centrs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lizosoms: vielmaiņas signālu centrs. Satiksme. 2019;20:27–38.
3. Ballabio A. Lieliskā lizosoma. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J u.c. Augsta tauku satura diētas izraisīta lizosomu disfunkcija un traucēta autofagiskā plūsma veicina lipotoksicitāti nierēs. J Am Soc Nephrol. 2017; 28:1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP u.c. Cauruļvadu ievainojumi un reģenerācija žurku nierēs pēc akūtas gentamicīna iedarbības: laika kursa pētījums. Ren Fail. 1992;14:507–21.
Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:
E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
