Mazi, bet vareni — eksosomas, jauni starpšūnu vēstneši neirodeģenerācijā, 1. daļa

Vienkāršs kopsavilkums:

Eksosomas ir bioloģiskas nanodaļiņas, kas nesen atzītas par starpšūnu vēstnešiem. Tie satur daudz lipīdu, olbaltumvielu un RNS. Tās var pārsūtīt savu saturu ne tikai uz šūnām tuvumā, bet arī uz šūnām no attāluma.

Eksosomas ir jaunatklāts starpšūnu komunikācijas rīks, kas apkārtējās šūnās var izdalīt mazus un smalkus pūslīšus, nogādājot apkārtējās šūnās dažus proteīnus, signalizācijas vielas un citas vielas. Šīs vielas var palīdzēt šūnām mainīt stāvokli un pat ietekmēt citu šūnu augšanu, attīstību, vielmaiņu un citus aspektus. Pēdējos gados veiktie pētījumi liecina, ka eksosomām ir svarīga loma cilvēka smadzeņu darbībā, īpaši atmiņas uzturēšanā un uzlabošanā.

Pirmkārt, eksosomas var veicināt signālu pārraidi starp neironiem. Informācijas pārraide starp neironiem ir viens no nepieciešamajiem nosacījumiem normālai nervu sistēmas darbībai, un eksosomas pilda vēstnešu lomu, kas var padarīt informācijas pārraidi starp neironiem vienmērīgāku, tādējādi uzlabojot smadzeņu izziņu un atmiņu.

Otrkārt, eksosomas var regulēt arī neironu metabolismu. Neironu procesā, kas ražo un atbrīvo eksosomas, tiek iesaistīts liels skaits vielmaiņas procesu, kas veicina šūnu metabolisma līdzsvaru un regulēšanu. Šie procesi var ne tikai uzlabot neironu spēju, bet arī palīdzēt izvadīt vielmaiņas atkritumus un kaitīgās molekulas un uzturēt smadzeņu šūnas veselas.

Visbeidzot, eksosomas var arī palīdzēt neironiem novērst bojājumus. Daudzas olbaltumvielas un nukleīnskābes, ko pārnēsā eksosomas, ir labvēlīgas šūnu augšanai, atjaunošanai un reģenerācijai, kā arī var veicināt neironu atjaunošanos un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot smadzeņu šūnu izdzīvošanas spēju un stiprinot atmiņas centrus un kognitīvās spējas.

Rezumējot, pastāv cieša saikne starp eksosomām un atmiņu. Mēs varam mainīt bērnu atmiņu, sākot ar diētu. Aktīvi vadot bērnu uztura struktūru un ēdot vairāk pārtikas, kas bagāts ar labvēlīgām sastāvdaļām, piemēram, taukskābēm, olbaltumvielām un vitamīniem, var veicināt eksosomu veidošanos un atbrīvošanos, tādējādi palīdzot bērniem uzlabot mācīšanās un atmiņas spējas. Bērniem var arī nodrošināt dažas smadzeņu apmācības spēles un vingrinājumus, lai izaicinātu un vingrinātu viņu domāšanu, stimulētu eksosomu potenciālu un spēlētu labāku lomu. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche efektivitāti nodrošina dažādas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp miecskābe, polisaharīdi, flavonoīdu glikozīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību daudzos veidos.

Noklikšķiniet uz Zināt, lai uzlabotu īstermiņa atmiņu

Šī unikālā spēja dod viņiem iespēju modulēt saņēmēju šūnu fizioloģiju. Smadzenēs eksosomām ir nozīme neirodeģeneratīvās slimībās, piemēram, Alcheimera slimība, Parkinsona slimība un amiotrofiskā laterālā skleroze.

Abstract:

Endosomālas izcelsmes eksosomas ir viena ekstracelulāro pūslīšu klase, kas ir svarīga starpšūnu komunikācijā. Eksosomas izdala visas mūsu ķermeņa šūnas, un to kravai, kas sastāv no lipīdiem, olbaltumvielām un nukleīnskābēm, ir nospiedums, kas atspoguļo to vecāku izcelsmi.

Eksosomālajai kravai ir spēja modulēt saņēmēju šūnu fizioloģiju atbrīvojošo šūnu vai šūnu tuvumā no attāluma. Eksosomu potenciāla izmantošana ir atkarīga no eksosomu sagatavošanas tīrības.

Tādējādi ir izstrādātas daudzas izolācijas metodes, un mēs sniedzam īsu vairāku metožu kopsavilkumu. Neskatoties uz izolētību, ko uzliek asins-smadzeņu barjera, CNS šūnas nav imūnas pret eksosomu uzmācīgu ietekmi. Gan neironi, gan gliarelizē eksosomas, bieži vien atkarībā no aktivitātes.

Ir sniegts īss dažādu smadzeņu šūnu atbrīvoto eksosomu apraksts un to loma CNS homeostāzes uzturēšanā. Vairāku neirodeģeneratīvu slimību pazīme ir olbaltumvielu agregātu uzkrāšanās. Nesenie pētījumi ir saistīti ar eksosomu starpšūnu komunikatora lomu nepareizi salocītu proteīnu izplatīšanā, kas liecina par patoloģijas izplatīšanos.

Šajā pārskatā mēs apspriežam iespējamo eksosomu ieguldījumu Alcheimera slimības, Parkinsona slimības un amiotrofiskās laterālās sklerozes progresēšanā.

Izpratne par eksosomu ieguldījumu neirodeģenerācijas patoģenēzē paver iespēju eksosomas izmantot kā terapeitiskus līdzekļus zāļu ievadīšanai smadzenēs, jo eksosomas šķērso hematoencefālisko barjeru.

Atslēgvārdi: eksosomas; neironi; glia šūnas; centrālā nervu sistēma (CNS); neirodeģeneratīvas slimības;Alcheimera slimība; Parkinsona slimība; amiotrofiskā laterālā skleroze.

1. Ievads un vēsturiskais skatījums

Starpšūnu komunikācija ir ļoti svarīga embriju attīstībai, epitēlija reģenerācijai / aizstāšanai, gametoģenēzei un homeostāzes uzturēšanai.

Izmantojot ultrastrukturālos un bioķīmiskos pētījumus, tika identificēti vairāki šūnu-šūnu komunikācijas mehānismi, piemēram, endocitoze / eksocitoze un izvirzītu citoplazmas burbuļu absorbcija [1–3]. Tika identificēts vēl viens spēlētājs, ārpusšūnu pūslīši, taču to loma starpšūnu komunikācijā netika novērtēta uzreiz [4].

Ekstracelulārās pūslīši tika atklāti neticami, veicot pētījumu par plazmas membrānu saistīto enzīmu, ekto-ATPāzes un ekto-50-nukleotidāzes izdalīšanos šūnu kultūras vidē. 1981. gadā Tramsandas kolēģi kultivēja normālas un neoplastiskas peļu un cilvēku šūnu līnijas barotnē, kas nesatur serumu, jo bija zināms, ka serumam piemīt ATPāzes un 50-nukleotidāzes katalītiskā aktivitāte.

Pēc peldošo šūnu un gružu noņemšanas kondicionētā barotne tika centrifugēta ar ātrumu 310, 000 × g 90 minūtes Spinco Ti-70 rotorā, un granulas tika pārbaudītas zem elektronu mikroskopa. Tika atklātas divas ekstracelulāro membrānu apvalku vezikulu populācijas, viena ar vidējo diametru no 500 līdz 1000 nm un otra, mazāka populācija ar diametru ~ 40 nm.

Šīs vezikulas, kuras autori sākotnēji aprakstīja kā "atslāņojušās pūslīšus", saturēja gan 50-50-nukleotidāzes, gan ATPāzes enzīmu aktivitāti. Turklāt atslāņotie pūslīši saturēja RNS un fosfolipīdus, kas attiecīgi atšķīrās no sākotnējām šūnām un sākotnējās plazmas membrānas.

C6 gliomas šūnu eksfoliētu pūslīšu inkubācija ar 32P iepriekš iezīmētām neiroblastomas šūnām stimulēja neiroblastomas proteīnu defosforilāciju, vienlaikus atbrīvojot brīvu radioaktīvi iezīmētu fosforu (32P).

Šie dati atklāja, ka atslāņotie pūslīši nebija tikai šūnu atkritumu (enzīmu) nesēji, bet tiem bija fizioloģiska funkcija. Trams un kolēģi ieviesa terminu eksosomas, lai aprakstītu "izlobītās pūslīšus" [5] (skatiet [6] apskata rakstu par ārpusšūnu pūslīšu vēsturi pirms 1981. gada). Dažus gadus vēlāk divas pētījumu grupas neatkarīgi pētīja transferīna receptoru likteni retikulocītos ar elektronu mikroskopiju [7–9].

Nobriedušiem retikulocītiem nav nepieciešams transferīns, tāpēc tie zaudē transferīna receptorus. Abas grupas novēroja, ka kultivētie retikulocīti ekstracelulārajā telpā izdala mazas vezikulas ar diametru ~ 50 nm.

Šīs mazās vezikulas saturēja nesadalītus transferīna receptorus. 1987. gadā Džonstons un kolēģi izmantoja terminu eksosomas, lai aprakstītu mazas pūslīši, kas satur transferīna receptorus [10]. Pēc šiem sākotnējiem gadiem eksosomu potenciāls tika realizēts kā jauni starpšūnu ziņotāji, kas var modulēt mērķa šūnu fizioloģiju.

Interesanti, ka eksosomu ģenēze šūnās tiek uzsākta ar endocitozi (process, kas identificēts 1883. gadā; pārskatīts ar [3]), un eksosomu izdalīšanās intracelulārajā telpā izmanto eksocitozes procesu. Kopš to sākotnējās atklāšanas mēs zinām, ka eksosomas ir ārpusšūnu zaru apakštips. endocītiskas izcelsmes ar izmēru diapazonu no 40 līdz 160 nm diametrā [11].

Marķieru pētījumi parādīja, ka makromolekulas tiek endocitētas ar sariem pārklātās (ti, ar klatrīnu pārklātās) invaginācijās vai bedrēs uz šūnas virsmas. Šīs invaginācijas galu galā atdalās no plazmas membrānas un tiek atklātas citoplazmā.

Pēc saru (ti, klatrīna) zaudēšanas endocitoze pārklātās pūslīši kļūst gludi un saplūst ar agrīnām endosomām, lai vai nu ātri atgrieztos atpakaļ uz šūnu virsmu (pārstrādā endosomas 1. attēlā) [12], vai tiek veikta nogatavināšana, veidojot vēlīnās endosomas.

Agrīnās un vēlīnās endosomas darbojas kā "šķirošanas mezgli", lai atbilstoši virzītu to saturu: (i) retrogrādai transportēšanai uz trans-Golgi tīklu (ti, endosoma-TGN izguvei) [13,14]; (ii) uz lizosomām makromolekulu degradācijai līdz vienkāršiem produktiem atkārtotai izmantošanai šūnā [15,16]; un/vai iii) otrreizējai pārstrādei uz šūnu virsmu caur multivezikulāriem ķermeņiem [17].

Agrīnu endosomu nobriešanas laikā endosomu iekšienē tiek veikta iekšējā endosomu membrāna invaginācija, kā rezultātā veidojas intraluminālie pūslīši (tagad apzīmēti kā eksosomas). Specifiskas makromolekulas, piemēram, citozola proteīni, nukleīnskābes un lipīdi, tiek sakārtotas jaunattīstības eksosomās.

Vēlīnās endosomas, kas pildītas ar eksosomām, tiek identificētas kā multivezikulāri ķermeņi, kas migrē uz plazmas membrānu. Saplūstot ar plazmas membrānu, multivezikulārie ķermeņi eksocitozes procesā izdala eksosomas ekstracelulārajā telpā (1. attēls) [18,19]. Liela proteīnu apakškopa, kas tiek pieņemta darbā, spēlē izšķirošu lomu endocitozes procesā uz agrīnām endosomām, endosomu nobriešanu līdz vēlīnām endosomām un to turpmāko intracelulāro likteni (apskatīts ar [17, 18, 20]).

Šo proteīnu nozīmi izceļ to zudums un/vai mutācijas, kas izraisa dažādas slimības. Piemēram, Strumpellin un SWIP proteīni ir daļa no WASH kompleksa, kas piedalās aktīna polimerizācijā, kā arī endosomu skaldīšanā un šķirošanā. Mutācijas Strumpellin gēnā izraisa iedzimtu spastisku paraplēģiju, ko raksturo motoro neironu deģenerācija [21].

Viena punkta mutācija (Pro1019Arg) SWIP proteīnā destabilizē WASH kompleksu. Destabilizētais WASH komplekss kavē endolizosomu tirdzniecību, izraisot endosomu salipšanu. Bojāta endosomālā satiksme ietekmē izziņu un motorneironu darbību, un simptomi tiek aprakstīti kā nesindromiska garīga atpalicība [22,23].

Citoplazmā eksosomas rodas no endosomām, izmantojot transportēšanai nepieciešamos endosomu šķirošanas kompleksus (ESCRT), kas pazīstams arī kā no ESCRT atkarīgais eksosomu bioģenēzes mehānisms (pārskatīts ar [18, 20]).

Divas grupas neatkarīgi ziņoja par lipīdu mediētu eksosomu bioģenēzi, kas ir no ESCRT neatkarīgs mehānisms. Šajos pētījumos tika identificēti divi lipīdi: bis(monoacilglicero)fosfāts/lizobisfosfatidskābe (BMP/LBPA) un keramīds [29,30].

Rab31 ir vēl viens no ESCRT neatkarīgs mehānisms eksosomu bioģenēzei citoplazmā. Rab31 aktivizēšana stimulē intraluminālo pūslīšu veidošanos [31]. Ir vēl viens mehānisms, par kuru pašlaik netiek runāts un kas nav pietiekami izpētīts.

Šis mehānisms ir balstīts uz ultrastrukturāliem novērojumiem, kas veikti 1950. gadu beigās līdz 1970. gadiem, kas liecināja, ka šūnu kodoli var būt vieta, kur rodas multivezikulāri ķermeņi, kas pildīti ar maziem pūslīšiem. Šajos pētījumos aprakstītās mazās pūslīši, iespējams, bija eksosomas, taču termins eksosoma tajā laikā netika izdomāts. Kilarskis un Jasinski novēroja procesu, ko sauc par kodola izspiedumu vai kodola ekstrūzijas asaru zivs Perca fluviatilis L. peldpūšļa šūnās (2.a attēls) [24] ar saturu, kas līdzīgs nukleolārkarioplazmai [32].

Šie autori atzīmēja, ka kodolu burbuļošanu var stimulēt, izvadot gāzi no asari zivju peldpūšļa [24]. Šķiet, ka kodolizplūdes process ir vērtīgs kā ar nukleīnskābēm un/vai ribonukleoproteīnu bagātinātu eksosomu izcelsmes vieta.

Kodola pūslīši bija piepildīti ar mazām pūslīšiem, kas radās no kodola pūslīšu iekšējās membrānas vienvirziena locījumu (2.b attēls), kas ir līdzīgs intraluminālo pūslīšu veidošanās endosomās. Kodola pūslīši, kas piepildīti ar “maziem pūslīšiem”, galu galā atdalījās no kodoliem, lai kļūtu par citoplazmas daļu (2.c attēls).

Kilarskis un Jasinskis savā manuskriptā minēja kodola pūtītes kā multivezikulārus ķermeņus labākas terminoloģijas trūkuma dēļ. Nejauši šiem autoriem varēja būt taisnība, jo turpmākajos pētījumos tika ziņots par multivezikulāru ķermeņu klātbūtni šūnu kodolos [33]. Ar maziem pūslīšiem piepildītajiem kodola pūtītēm ir morfoloģija, kas līdzīga multivezikulāriem ķermeņiem, kas cēlušies no endosomām citoplazmā (1. un 2. attēls).

Tā kā kodolu multivezikulārie ķermeņi ir līdzīgi vīrusa nukleokapsīdiem, pētnieki pievērsa uzmanību virusoloģijai un kodolizplūduma fenomenam, un tā šūnu funkcija palika nepietiekami izpētīta [34].

Neatkarīgi no bioģenēzes veida eksosomas sastāv no alipīdu divslāņa un satur makromolekulāru saturu, kas sastāv no lipīdiem, olbaltumvielām un nukleīnskābēm.

Dažas makromolekulas ir kopīgas eksosomām, kuru izcelsme ir no visām šūnām, un tāpēc tās tiek klasificētas kā eksosomu marķieri un tiek izmantotas kā apstiprinājuma līdzeklis, lai atšķirtu eksosomas no citām ārpusšūnu pūslīšiem. Unikālās makromolekulas, kas atrodas eksosomā, mīkstina atspoguļo to vecāku izcelsmi, un tāpēc tās, visticamāk, tiks apzīmētas kā biomarķieris (-i).

Visas šūnas atbrīvo eksosomas ekstracelulārajā telpā. No ārpusšūnu telpas eksosomas nonāk dažādos bioloģiskajos šķidrumos un sasniedz šūnas lokāli un no attāluma. In vitro kultivētās šūnas atbrīvo savas eksosomas barotnēs. Nepārtraukta eksosomu izdalīšanās ekstracelulārajā telpā padara barotni un bioloģiskos šķidrumus par bagātīgu avotu eksosomu izolēšanai.

Eksosomas satur ievērojamu daudzumu kodējošu un nekodējošu RNS, divpavedienu genoma DNS fragmentus un mitohondriju DNS. Trams un kolēģi bija pirmie, kas aprakstīja RNS klātbūtni "atslāņotās pūslīšos", kas ir eksosomu un mikrovezikulu maisījums.

Viņi noteica, ka "atslāņotie pūslīši vai eksosomas" satur 5% RNS [5]. Valadi un kolēģi bija pirmie, kas sistemātiski analizēja RNS iepakotas ineksosomas. Eksosomālās RNS ietvēra translējamās mRNS un mikroRNS (miR) [35].

MikroRNS ir nekodējošu RNS (ncRNS) klase. To garums ir ~22 nukleotīdi, un tie regulē gēnu ekspresiju pēctranskripcijas līmenī, saistoties ar 30-netranslētajiem mērķa messenger RNS reģioniem [36]. Interesanti, ka dažas ar eksosomām bagātinātas miRNS nav konstatētas vecāku šūnās, kas liecina par selektīvu RNS šķirošanas/iepakošanas sistēmu eksosomu bioģenēzes laikā [35, 37].

Atšķirībā no šūnām, eksosomas satur maz vai nemaz nav ribosomu RNS, bet satur tRNS fragmentus [38]. RNS šķirošana eksosomās ir atkarīga no (1) ar RNS inducētu trokšņa slāpēšanas kompleksu (RISC) saistītā proteīna, (2) RNS sekvences motīviem un vadošajiem proteīniem, (3) nukleotīdu pievienošanas miRNS 30. galā, (4) miRNS šūnu pieejamības un (5) keramīds [39,40].

Mēs uzskatām, ka kodolizplūdums ir vēl viens šūnu process, kas ļauj diferencēti šķirot RNS, RNS-proteīna kompleksus un genoma DNS eksosomās. Šim viedoklim ir vairāki iemesli: (1) “intraluminālo pūslīšu” saturs bija līdzīgs nukleolārajai karioplazmai [32]. “vezikulas” kodolmultivezikulārajos ķermeņos (MVB II) bija bagātinātas ar RNS, skābiem un bāziskiem proteīniem, un tāpēc autori uzskatīja intraluminālie pūslīši” kā RNS sintēzes vieta papildus tonucleolus [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin eksosomas [43–47].

Starp citu, genoma DNS tika atklāta tikai eksosomās, kas iegūtas no vēža šūnu līnijām, nevis normālām šūnām [47]. Vēža šūnām ir patoloģisks hromatīns hromatīna pārkārtošanās/translokācijas dēļ un, iespējams, ploidija [48], kas var izraisīt genoma DNS fragmentāciju vēža šūnu kodolos. Šos DNS fragmentus var viegli iekļaut II tipa MVB (un eksosomās), kas attīstās kodolos. (3) Kilarski un Jasinski [24] aprakstītais “mazo pūslīšu” bioģenēzes veids kodolpūslīšos ir līdzīgs intraluminālo pūslīšu veidošanās vēlīnās endosomās citoplazmā.

Mēs esam stingri pārliecināti, ka genoma DNS klātbūtne eksosomās ir patoloģiska, un tāpēc tās klātbūtni eksosomās var izmantot kā diagnostikas līdzekli patoloģisku (vai vēža) šūnu attīstībai organismā. (4) No aktivitātes atkarīgais šūnu atbrīvoto eksosomu skaita pieaugums [49] ir salīdzināms ar gāzu šūnām, kas uzrādīja palielinātu kodolu izplūšanu pēc gāzes izņemšanas no asari zivju peldpūšļa [24].

Pavisam nesen mitohondriju proteīni un DNS tika atklāti dažu vēža pacientu plazmas eksosomās, un to klātbūtne ir saistīta ar vēža agresivitāti [50, 51].

Mitohondriju sadalīšanās bieži tiek novērota deģenerējošās šūnās [52,53]. Mitohondriju kristāli, kas atbrīvoti no deģenerējošajiem mitohondrijiem, var tikt internalizēti ar multivezikulāriem ķermeņiem, un galu galā tās tiek iepakotas ineksosomās.

Šo priekšstatu apstiprina cilvēka limfoblastoīdu šūnu un paviānas prostatas acini lūmena ultrastrukturālie attēli, kuros bija “mikrovezikulas” (vai eksosomas), kas radušās mitohondriju kristālu sadalīšanās rezultātā [54].

Pamatojoties uz iepriekšminēto diskusiju un apstiprinošiem eksperimentāliem pierādījumiem, mēs ierosinām, ka eksosomu neviendabīgais raksturs izriet no multivezikulāro ķermeņu un saistīto eksosomu bioģenēzes dažādās subcelulārās vietās, nevis pilnībā citoplazmā, kā saskaņā ar mūsu pašreizējo uzskatu. Mūsu priekšlikums var izskaidrot eksosomu neviendabīgumu. kā arī neatbilstība starp teorētiskajiem aprēķiniem un eksperimentālajiem datiem par mazu RNS vai olbaltumvielu molekulu skaitu, kas atrodas vienā eksosomā, kas attīrīta no seruma [55].

Pamatojoties uz teorētiskiem aprēķiniem, izmantojot vidējo eksosomu izmēru, Li un kolēģi paredzēja, ka katra eksosoma uzņems aptuveni 70–25 000 mazas RNS vai olbaltumvielu molekulas.

Tomēr viņu eksperimentālie dati liecināja par vienas RNS molekulas klātbūtni katrā eksosomā, kas attīrīta no seruma [55]. Saskaņā ar mūsu hipotēzi ir jāturpina pētīt kodolpūslīšu veidošanos, kodolmultivezikulāros ķermeņus un RNS/ribonukleoproteīnus saturošu eksosomu bioģenēzi, kodolu multivezikulāros ķermeņus. Lipīdi ir svarīga eksosomu membrānu daļa, un tie ir asimetriski sadalīti starp divām eksosomu membrānas lapiņām. Lipīdu sastāvs atšķiras starp sākotnējo šūnu membrānu un eksosomu membrānu.

Parasti lipīdi, kas bagātināti ar eksosomemmbrānu, ir sfingomielīna, keramīda, holesterīna un ar holesterīnu bagāti lipīdu plostu mikrodomēni, gangliozīds GM3, piesātinātie lipīdi un fosfatidilserīns [56–58]. Eksosomu proteīni sastāv no tiem, kas ir kopīgi vairumam eksosproomu, kā arī unikālie. uz noteiktu vecāku šūnu.

Visu eksosomu proteīnu saturs parasti ir bagātināts ar mērķa un saplūšanas olbaltumvielām, piemēram, tetraspanīniem, integrīniem, chaperoneproteīniem, piemēram, karstuma šoka proteīniem (Hsp60, Hsp70 un Hsp90), mazajiem HSP membrānas trafika proteīniem, Rab proteīniem, ARF GTPāzes, aneksīniem un olbaltumvielas, kas iesaistītas multivezikulāru ķermeņu veidošanā, piemēram, ALIX un TSG101 [59].

Jaunāki pētījumi liecina par RNS saistošu proteīnu klātbūtni, kas veido RNS-olbaltumvielu kompleksus eksosomās [38]. Vairāki šūnu procesi, kas nodrošina proteīnu augšupielādi eksosomās, ir (1) ESCRT mehānismi proteīniem ar noteiktām pēctranslācijas modifikācijām, piemēram, ubikvitināciju, Wnt stimulētu arginīna metilēšanu, oksidāciju, fosforilāciju, glikozilāciju un citrullināciju; (2) chaperona mediētā autofagija (CMA), kas balstās uz mijiedarbību starp karstuma šoka radniecīgo 71 kDa proteīnu (HSC70) un proteīniem ar KFERQ motīvu.

Pēc HSC70 saistīšanas ar proteīniem ar KFERQ motīvu olbaltumvielas tiek mērķētas uz multivezikulāriem ķermeņiem. Šaperona mediētā autofagija parasti darbojas proteīnu noārdīšanai lizosomās. Jaunāki dati liecina, ka CMA ir nozīme eksosomu izdalīšanā un eksosomu izraisītā proteīna agregātu izplatīšanā dažās neirodeģeneratīvās slimībās [60–63].

Kopš 1990. gadiem ir bijis eksponenciāls eksosomu pētījumu pieaugums, un ir iegūti daudz datu par eksosomu kravu. Ir izveidotas datu bāzes, lai nodrošinātu eksosomālu kravu apkopojumu, pirms kļūst pārāk grūti pārvaldīt lielas datu kopas.

Publicēto datu par eksosomām atkārtojamība ir vēl viens iemesls, jo lielākā daļa laboratoriju izmanto dažādu metožu variācijas, kas izstrādātas, lai izolētu eksosomas. Piemēram, Vesiclepediais ir manuāli izveidots molekulāro kravu (lipīdu, RNS un olbaltumvielu) apkopojums, kas identificēts dažādās ekstracelulāro pūslīšu klasēs [64]. Vesiclepedia ir vērtīgs resurss pētniekiem.

Datubāze Vesiclepedia ir publiski pieejama un ļauj lietotājiem meklēt un lejupielādēt eksosomus kravas datus, pamatojoties uz lietotāja ievadītiem meklēšanas kritērijiem. EV pedia, Exocarta, ExoRbase un EV miRNA ir papildu datu bāzes, kas kataloģizē eksosomālos proteīnus un RNS [64].

Datu bāzes tiek vadītas ar kopienas anotācijām. Šajās datubāzēs apkopotie dati tiek iegūti, izolējot eksosomas, izmantojot dažādas atdalīšanas metodes, kas nav iekļautas datu bāzē.

Tādējādi eksosomālās kravas saturs var atšķirties atkarībā no izmantotās izolācijas metodes, radot zināmu neskaidrību ziņojumos. Lai uzlabotu eksperimentālo reproducējamību un caurspīdīgumu, tika izstrādāta atvērtā koda zināšanu bāzes EV-TRACK rīku kopa. EV-TRACK ietver datus par eksosomu sagatavošanu un eksosomu raksturojumu [65].

Galvenā EV-TRACK iezīme ir EV-METRIC, kas parāda eksperimentālo parametru ziņošanu procentos no deviņu saraksta izpildītajām sastāvdaļām [66]. Šos komponentus noteica EVTRACK konsorcijs, un tie tika uzskatīti par nepieciešamiem nepārprotamai datu interpretācijai un eksperimentālo datu reproducēšanai. Tādējādi EV-METRIC tika izstrādāts, lai palīdzētu pētniekiem un recenzentiem sniegt visaptverošu datu pārskatu.

2. Pašreizējās eksosomu izolācijas metodes

Eksosomas ir bagātīgs resurss biomarķieru atklāšanai un jaunām terapeitiskām stratēģijām, tostarp reģeneratīvajai medicīnai. Šo mērķu panākumu pamatā ir tīru eksosomu izolācija, izmantojot reproducējamu metodi.

Funkcionāli kompetentu eksosomu izolācija ir īpaši svarīga potenciālajiem terapeitiskajiem lietojumiem. Eksosomas ir attīrītas no dažādiem bioloģiskiem šķidrumiem, piemēram, asinīm, plazmas, cerebrospinālā šķidruma, siekalām, urīna un piena. Katram bioloģiskajam šķidrumam ir atšķirīgas fizikālās un ķīmiskās īpašības, kas jāņem vērā pirms eksosomu izolācijas.

Dažos gadījumos eksosomu izolācijai var būt nepieciešami īpaši piesardzības pasākumi. Attīrītu eksosomu gala izmantošana ir vēl viens noteicošais faktors, kas ietekmē eksosomu izolācijas metodi.

Līdz šim ir izstrādātas vairākas eksosomu izolācijas metodes, un dažas no tām ir balstītas uz eksosomu raksturlielumiem, piemēram, to lielumu, blīvumu, virsmas lādiņu un olbaltumvielām, kas saistītas ar eksosomas virsmu (3. attēls) [67].

Dažas no pašlaik izmantotajām eksosomu izolācijas metodēm ir uzskaitītas 1. tabulā. Lielākā daļa no tām nav atsevišķas metodes, un tām ir nepieciešamas iepriekšējas pēcparauga apstrādes darbības. Galvenās metodes ir īsi apskatītas turpmāk.

3. attēls. Parasti izmantotās metodes eksosomu izolēšanai un to pakārtotie pielietojumi. Vairākas līdz šim izstrādātās metodes eksosomu izolēšanai ir balstītas uz to peldošo blīvumu, 1., 13. shēma un 1,19 g/mL, ultracentrifugēšanas metode (UC) tika tālāk pilnveidota, lai izolēt tīrus eksosomu preparātus, pamatojoties uz to peldošo blīvumu, izmantojot izopikniskās ultracentrifugēšanas pārsaharozes vai jodiksanola blīvuma gradientu (DG).

Lai noņemtu augstu olbaltumvielu saturu proteīnūrijā, ultracentrifugēšanas metode tika apvienota ar izmēra izslēgšanas hromatogrāfiju (SEC). Laika ierobežojumi, kas saistīti ar ultracentrifugēšanas metodi, noveda pie filtrēšanas metodes (UF) izstrādes.

Atšķaidītu paraugu, piemēram, barotnes un urīna, izlaišana caur nano- vai mikromembrānas koncentratoru ļāva veikt eksosomu attīrīšanu. Membrānas aizsērēšana un slikta eksosomālo proteīnu atgūšana padarīja šo metodi nepopulāru pakārtotajos lietojumos, piemēram, RNS izolācijā un lielas caurlaidības lietojumos.

Vēl viena metode, kas izstrādāta, lai izolētu eksosomas no ļoti atšķaidīta bioloģiskā šķidruma hidrostatiskās filtrēšanas dialīzes (HFD *) kombinācijā ar centrifugēšanu. Izmantojot HFD metodi, paraugu dializē caur dialīzes membrānu ar 1000 kDa molekulmasu zem hidrostatiskā spiediena, ļaujot no parauga noņemt nevēlamās makromolekulas, un eksosomas tiek atgūtas, centrifugējot.

Eksosomu izgulsnēšanas metode, kuras pamatā ir šķīdība vai izkliedējamība un agregācija, tika izstrādāta, lai vienlaicīgi apstrādātu vairākus paraugus. Uz šīs stratēģijas ir balstīti komerciāli komplekti eksosomu attīrīšanai.

Izmantojot šo metodi, urīna orascītus sajauc ar polietilēnglikolu (PEG) 6000 vai kombinācijā ar protamīnu (plus PEG35 000) un inkubē nakti vai 1 stundu uz ledus.

T iegūto duļķaino maisījumu centrifugē, lai atgūtu eksosomas, kuras izmanto pakārtotajām RNS un olbaltumvielu analīzēm. Citi reaģenti, ko izmanto eksosomu izgulsnēšanai, ir: (1) 0.1 M nātrija acetāts pH 4,75 (izsālīšanas metode) (NaAc), (2) 4-kārtīgs aukstā acetona tilpums (-20 ◦C) ( PROtein Organic Solvent Precipitation un saīsināti kā PROSPR), (3) un PEG un dekstrāna šķīduma maisījums (līdz 1,5%) (divfāžu metode, kas ļauj atdalīt olbaltumvielas no eksosomām).

Eksosomu virsmas proteīnu identificēšana noveda pie imūnafinitātes uztveršanas metožu izstrādes, izmantojot antivielas pret eksosomu virsmas proteīniem, piemēram, Tim4, aneksīnu, EpCAM, kopējo eksosomu virsmas proteīnu, CD63 un karstuma šoka proteīniem (afinitātes mijiedarbība). Lai izstrādātu eksosomu izolācijas metodes, tika izmantota afinitāte pret lektīnu (kas saistās ar glikoproteīniem uz eksosomu virsmas) un heparīnu (kas saistās ar heparāna sulfāta proteoglikāniem uz eksosomu virsmas).

Uz afinitāti balstītām eksosomu attīrīšanas metodēm tika izmantotas vairākas platformas, piemēram, magnētiskās lodītes, ļoti poraini monolīta silīcija dioksīda mikrouzgaļi, plastmasas plākšņu virsma, celulozes filtri, membrānas afinitātes filtri, agarozesorbents un mikrofluidiskās ierīces, un tām ir dažādas priekšrocības. diagnostikas, prognostiskās, kā zāļu piegādes sistēmas un foreksosomālas kravas noteikšana un analīze.

Pielāgots ar Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP atļauju. Ekstracelulāro pūslīšu izolēšana: vispārīgās metodoloģijas un jaunākās tendences.Biomed Res Int. 2018. gada 30. janvāris; 2018:8545347. doi: 10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Autortiesības © 2022 Maria Yu. Konošenko u.c.

Šis ir brīvpiekļuves raksts, kas tiek izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution License, kas atļauj neierobežotu izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā datu nesējā, ja oriģinālais darbs ir pareizi citēts [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com