Sociālā imunitāte medus bitēm: peru pieniņš kā līdzeklis baktēriju patogēnu fragmentu pārnešanai starp ligzdas biedriem

KOPSAVILKUMS

Sociālā imunitāte ir uzvedības un fizioloģisko īpašību kopums, kas ļauj kolonijas locekļiem aizsargāt vienam otru no patogēniem un ietver imunoloģisko savienojumu perorālu pārnešanu starp ligzdas biedriem. Medus bitēm peru pieniņš ir dziedzeru sekrēts, ko ražo strādnieku apakšgrupa, kas tiek izbarota mātei un jauniem kāpuriem un kas satur daudzus pretmikrobu savienojumus. Saistīta sociālās imunitātes forma, transgenerational immune priming (TGIP), ļauj karalienēm pārnest patogēnu fragmentus savās jaunattīstības olās, kur tos atpazīst embrija imūnsistēma un izraisa lielāku patogēnu rezistenci jaunajos pēcnācējos. Šos patogēnu fragmentus transportē vitellogenīns (Vg), olu dzeltenuma prekursoru proteīns, ko medmāsas izmanto arī peru pieniņa sintezēšanai.

Tāpēc peru pieniņš var kalpot kā līdzeklis patogēnu fragmentu transportēšanai no strādniekiem uz citiem ligzdas biedriem. Lai to izpētītu, mēs nesen parādījām, ka uzņemtās baktērijas tiek transportētas uz medmāsu želeju ražojošajiem dziedzeriem, un šeit mēs parādām, ka patogēnu fragmenti ir iekļauti peru pienā. Turklāt mēs parādām, ka patogēnu šūnu patērēšana izraisa augstāku pretmikrobu peptīda, kas atrodams peru pienā, defensīna-1 līmeni.

Perorāla imūnsavienojumu lietošana var būtiski ietekmēt cilvēka imūno funkciju. Šie savienojumi var uzlabot imunitāti, stiprinot vai modulējot organisma imūnsistēmu. Imunitāte ir ķermeņa izturība pret slimībām, tostarp tādiem aizsardzības mehānismiem kā imūnās šūnas un antivielas. Perorālie imunizācijas savienojumi var aktivizēt imūno šūnu darbību, palielināt antivielu veidošanos organismā un kavēt patogēno baktēriju un vīrusu vairošanos, tādējādi uzlabojot imunitāti un samazinot infekcijas risku. Turklāt perorāla imūnsavienojumu lietošana var mazināt iekaisumu un mazināt ar slimību saistītās sāpes un diskomfortu, tādējādi uzlabojot dzīves kvalitāti. Tādējādi pastāv cieša saikne starp imūnsavienojumu perorālu lietošanu un imunitāti. No tā mēs redzam, ka mums jāpievērš uzmanība savas imunitātes uzlabošanai. Cistanche var uzlabot imunitāti. Gaļā esošie polisaharīdi var regulēt cilvēka imūnsistēmas imūnreakciju, uzlabot imūnsistēmu stresa spēju un pastiprināt imūnšūnu sterilizācijas efektu.

Noklikšķiniet uz cistanche ieguvumiem veselībai

ATSLĒGVĀRDI:

Medus bites, sociālā imunitāte, peru pieniņš, Amerikas peru peru.

IEVADS

Peru pieniņš jau sen ir fascinējis biologus, jo tam ir galvenā loma medus bišu kastu attīstībā. Šo dziedzeru sekrēciju ražo strādnieku kastas apakškopa, kas pazīstama kā medmāsas, un ar to baro karalieni visā viņas attīstības un pieaugušā mūža garumā, savukārt strādniekiem paredzētos kāpurus pirmajās 3 dzīves dienās baro ar peru pienu, pirms tiek pāriet uz vairāk. uz ziedputekšņiem balstīta diēta (Johansson, 1955; Haydak, 1970; Townsend un Lucas, 1940). Analītiskās ķīmijas metodēm attīstoties, zinātnieki sāka pētīt peru pieniņa uzturvērtības komponentus un atklāja, ka tajā ir daudz patogēnu nogalināšanas savienojumu, kas aizsargā karalieni un jaunos kāpurus no slimībām (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990; Okamoto et al., 2003; Romanelli et al., 2011; Sugiyama et al., 2012; Vucevic et al., 2007). Anti-patogēno savienojumu pārnešana starp ligzdas biedriem ir sociālās imunitātes forma, uzvedības un fizioloģisko iezīmju kopums, kas palīdz kolonijas locekļiem aizsargāt vienam otru no patogēniem (Cremer et al., 2007).

Saistīta sociālās imunitātes forma, transgenerational immune priming (TGIP), arī pēdējos gados ir izpelnījusies lielu uzmanību (Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López et al., 2014; Knorr et al., 2015; Salmela et al., 2015). Šeit kukaiņu mātītes, kas izdzīvo patogēna uzbrukumā, var pārnest patogēnu fragmentus uz savām olām un radīt pēcnācējus, kas ir izturīgāki pret slimībām. Šie patogēnu fragmenti satur ar patogēniem saistītus molekulāros modeļus, strukturālas sastāvdaļas, kas atrodamas mikrobu šūnu sieniņās, kas izraisa imūnreakciju jaunattīstības pēcnācējiem. Lai gan TGIP ir pierādīts medus bitēm, pētījumi balstījās uz mātēm injicēšanu ar inokulātu, un tas radīja problēmu: kā bišu māti varētu inokulēt ar patogēniem dabiskos apstākļos, ņemot vērā, ka viņa barojas tikai ar bišu māšu pienu un tai nav iespējas patērēt piesārņots nektārs un ziedputekšņi, ko savākuši viņas lopbarības meklētāji? Liels mūsu grupas atklājums liecināja par jaunu iespējamo ceļu. Karalienes pārnes patogēnu fragmentus savās olās, izmantojot vitellogenīnu (Vg) (Salmela et al., 2015), olu dzeltenuma prekursoru proteīnu, ko medmāsas izmanto arī peru pieniņa sintezēšanai (Amdam et al., 2003).

Tādējādi medus bites var izmantot peru pienu kā līdzekli, lai pārnestu patogēnu fragmentus starp medmāsām un mātēm, un kāpurus kā daļu no kolonijas līmeņa imūnsistēmas. Pirmajā solī, lai noskaidrotu šo ceļu, mēs parādījām, ka medmāsas, kuras uzņēma baktērijas, spēja tās pārnest no viduszarnām uz želeju veidojošajiem dziedzeriem un ka vg ekspresijas samazināšanās kavēja šo procesu (Harwood et al., 2019). Tagad mēs cenšamies noteikt, vai medmāsas, kas uzņem baktēriju patogēnus, var tos iekļaut savā peru pienā un vai patogēnu uzņemšana palielina arī citu pretmikrobu komponentu koncentrāciju peru pienā.

Medus bišu imūno ceļu izpratne ir svarīga ne tikai organisma bioloģijas jomā, bet arī cilvēku nodrošinātībai ar pārtiku. Medus bites ir galvenais kukaiņu apputeksnētājs lauksaimniecībā, kas katru gadu palielina vismaz 15 miljardus USD ražas vērtībai tikai ASV vien (USDA paziņojums presei, 2020. gada 6. aprīlis.

Tomēr lielie ikgadējie saimju zudumi joprojām nomoka amerikāņu biškopjus (ASV Lauksaimniecības departaments, 2019), ko izraisa vairāki stresa faktori, piemēram, pesticīdu iedarbība un slikta uztura. Taču bišu kaitēkļi un patogēni ir arī galvenie veicinātāji, un tie bieži tiek atklāti gājušās kolonijās (Amerikas Savienoto Valstu Lauksaimniecības departaments, 2019). Šie patogēni ietver daudzas baktērijas, sēnītes un vīrusus, no kuriem daudziem nav farmakoloģiskas ārstēšanas. Izpratne par to, kā sociālā imunitāte ir starpnieks patogēnu infekcijās, varētu nodrošināt visaptverošākas ārstēšanas shēmas un palīdzēt samazināt slimību slogu, kas veicina koloniju zudumu.

Ir svarīgi saprast, kā sociālās imunitātes mehānismi Saņemts 2020. gada 12. jūnijā; Pieņemts 2021. gada 17. februārī, papildina atsevišķu bišu imunoloģisko aizsardzību.

Medus bitēm ir vairāki aizsardzības slāņi, sākot ar strukturāliem šķēršļiem, piemēram, ūdensnecaurlaidīgu kutikulu, kas bloķē patogēnu iekļūšanu (Moret un Moreau, 2012). Patogēni, kas tiek norīti, nonāks viduszarnā, orgānā, kas ir atbildīgs par gremošanu un uzsūkšanos, un šeit tie saskaras ar citu fizisku barjeru, peritrofisko matricu (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009). Šī ir hitīna viela, kas izdalās no viduszarnu epitēlija šūnām, kas darbojas kā siets, lai bloķētu lielu daļiņu, piemēram, patogēnu šūnu, uzsūkšanos.

Ja patogēni pārkāpj šīs fiziskās barjeras, tos nosaka patogēnu modeļa atpazīšanas receptori, kas aktivizē vairākas šūnu un humorālās imūnās atbildes. Šūnu aizsardzība var ietvert hemocītu izraisītu fagocitozi (Evans un Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine un Strand, 2002), savukārt humorālās reakcijas var ietvert melanīna ražošanu, lai iekapsulētu svešas daļiņas (González-Santoyo un Cóguirdolar, 2012) un antimikrobiālo peptīdu (AMP) ražošanu, kas tieši nogalina patogēnus (Bulet and Stöcklin, 2005; Bulet et al., 1999; Evans et al., 2006). Melanizācijas reakcija tiek izraisīta, kad bišu indes serīna proteāze (Bi-VSP) aktivizē fenoloksidāzes kaskādi, kas izraisa melanīna veidošanos (Choo et al., 2010). AMP, piemēram, lizocīms un defensīns-1, tiek inducēti pēc Toll vai imūndeficīta (IMD) ceļu aktivizēšanas (De Gregorio et al., 2002).

Neskatoties uz spēcīgu pretpatogēnu arsenālu, medus bitēm ir mazāk ar imūnsistēmu saistītu gēnu nekā vientuļajām bišu sugām (Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006), galvenokārt pateicoties sociālās imunitātes attīstībai. Peru pieniņš satur daudzus tikko apspriestos fermentus un peptīdus, tostarp Bi-VSP, lizocīmu un defensīnu-1, kā arī glikozes oksidāzi, kas ražo ūdeņraža peroksīdu, kas arī nogalina patogēnus (Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990; Romanelli et al., 2011; Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012). Šī bagātinātā barība ir īpaši svarīga visneaizsargātākajiem kolonijas locekļiem, jaunajiem kāpuriem, kuru imūnsistēmas aizsargspējas joprojām attīstās. Piemēram, jauniem kāpuriem ir zemāks fenoloksidāzes līmenis (Chan un Foster, 2008; Chan et al., 2009) (svarīgs melanizācijas kaskādē) un AMP (Chan un Foster, 2008), un to joprojām nobriestajā viduszarnā un peritrofiskā matrica atstāj to viduszarnu epitēliju neaizsargātu pret pārrāvumiem (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez and Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016).

Tā rezultātā kāpuri ir uzņēmīgi pret dažām slimībām, kas pieaugušajiem ir diezgan nekaitīgas. Tas ietver Amerikas peru peru, ko izraisa sporas veidojošās grampozitīvās baktērijas Paenibacillus larvae (Genersch, 2010; Hansen un Brødsgaard, 1999). Amerikāņu peru peru infekcija ir ne tikai letāla saimēm, bet arī dārga biškopjiem, jo ​​sporas ir izturīgas un saglabā dzīvotspēju gadiem ilgi, kas nozīmē, ka biškopji ir spiesti iznīcināt inficētos stropus. Tādējādi kāpuri gūst labumu no pārtikas, kas papildināts ar savienojumiem, kas nogalina patogēnus, vai ar patogēnu daļiņām, kas var izraisīt imūnsistēmas aktivizēšanu.

Šajā pētījumā mūsu mērķis bija divējāds: pirmkārt, noteikt, vai medmāsas, kas patērē Amerikas peru veģetatīvās šūnas, varētu iekļaut patogēnu fragmentus savā peru pienā, un, otrkārt, noskaidrot, vai tas izraisa augstāku imūno proteīnu līmeni, kas atrodams peru pienā. Šim nolūkam mēs barojām medmāsas ar fluorescējoši marķētām un termiski nogalinātām P. kāpuru šūnām un pēc tam pārbaudījām viņu ražoto peru pienu. Mēs izmantojām fluorescences mikroskopiju, lai apstiprinātu baktēriju šūnu fragmentu klātbūtni peru pienā, un masas spektrometriju, lai salīdzinātu peru pieniņa proteomisko profilu no inficētajām un kontroles kolonijām. Jo īpaši mēs pārbaudījām hipotēzi, ka peru pienā no inficētām kolonijām būtu augstāks imūno proteīnu glikozes oksidāzes, Bi-VSP, lizocīma un defensīna saturs-1.

MATERIĀLI UN METODES

Patogēno baktēriju kultivēšana

P. larvae veģetatīvās šūnas tika iegūtas no Gēteburgas Universitātes kultūru kolekcijas un kultivētas normālos baktēriju augšanas apstākļos. Īsumā, šūnas tika suspendētas MYPG buljonā un turētas 37 grādos pa nakti kratīšanas inkubatorā, pirms tās tika uzklātas uz MYPG agara un atstātas inkubācijai 1 nedēļu 37 grādos. Pēc tam veģetatīvās šūnas tika novāktas un suspendētas 1 × fosfātu buferšķīdumā (PBS), pirms tās tika termiski nogalinātas autoklāvā. Pēc tam iegūtās dzīvotnespējīgās baktēriju šūnas tika konjugētas ar fluorescējošu krāsu, izmantojot pHrodo™ sarkano fagocitozes daļiņu marķēšanas komplektu (Invitrogen #a10026), ievērojot ražotāja norādījumus. Pēc nokrāsošanas P. larvae šūnas tika suspendētas 1 × PBS līdz koncentrācijai 10 mg ml-1 un uzglabātas 4 grādu temperatūrā, līdz tās bija gatavas lietošanai.

Bites un barošanas eksperiments

Dabiski pārojušās Eiropas medus bites Apis mellifera Linnaeus 1758 tika turētas standarta Langstroth stropu kastēs Helsinku Universitātē Vikki pilsētiņā Somijā. Šie standarta Langstroth stropi kalpoja kā donori mazākām bez karalienes kolonijām, kas tika izmitinātas mazos pārošanās stropos. Lai izveidotu šīs mazākās bezdzemdību kolonijas, no donora stropa tika izgriezta peru ķemmes daļa, kurā bija 1-dienu veci kāpuri, kuru izmērs bija 12 cm × 12 cm, un pārvietots uz mini pārošanās Nuc kastīti. Aptuveni 100–200 medmāsas arī tika pārvietotas no tā paša donoru stropa un ievietotas mini pārošanās Nuc kastē. Medmāsas tika identificētas kā tās personas, kuras tika novērotas, iekļūstot peru šūnās un barojot kāpurus donoru stropā.

Kopumā tika izveidotas N{{0}} mazas bezdzemdību kolonijas, katra no atsevišķa donoru stropa. Kolonijas tika padarītas bez karalienes, lai stimulētu medmāsas ražot vairāk peru pieniņa, lai izveidotu jaunu karalieni (Sahinler un Kaftanoglu, 1997). Māsiņas un jaunie kāpuri tika noslēgti mini pārošanās Nuc kastēs uz 3 dienām un tika nodrošināti ar 30% saharozes šķīdumu šļirces padevējā, kas tika piekārta pie griestiem. N=3 kolonijas saņēma kontroles diētu, savukārt N=3 saharozei bija pievienoti ar fluorescenti iezīmēti P. kāpuri līdz patogēna galīgajai koncentrācijai 0,6 mg ml-1. Kontroles un patogēnu diētas katru dienu tika papildinātas ar svaigu pārtiku. Pēc 3 dienām no katras kolonijas strādnieku peru ķemmēm tika novākta tikko nogulsnētā peru pieniņš un sadalīta vienā no divām darbplūsmām: fluorescences mikroskopija vai proteomikas analīze.

Fluorescences mikroskopija

Peru pieniņš no katras ķemmes tika pārnests 200 µl reakcijas mēģenēs. Lai novērtētu no katra stropa iegūtā želejas tilpumu, mēs iepriekš piepildījām 30 reakcijas mēģenes ar pieaugošu ūdens tilpumu no 1 līdz 30 µl, un divi novērotāji neatkarīgi un akli novērtēja, kurš ūdens tilpums atbilst peru pieniņa tilpumam. Visos 6 gadījumos katrs peru pieniņa paraugs saņēma vienādu tilpuma novērtējumu no diviem novērotājiem. Pēc tam katrs peru pieniņa paraugs tika atšķaidīts ar 1 × PBS (pH 7,4) līdz galīgajai koncentrācijai 10 tilpuma procentiem un maisīja virpuļtīklu. Pēc tam paraugi tika uzlikti hemocitometram un pārbaudīti ar Leica DM6000 fluorescences mikroskopu. Hemocitometrā redzes lauks ir vienmērīgi sadalīts 9 sekcijās, un mēs veicām novērojumus kopumā 5 sekcijās: 4 stūra sekcijās un vidusdaļā. Tas ļāva aprēķināt fluorescējošo daļiņu koncentrāciju uz mikrolitru peru pieniņa (C), izmantojot šādu formulu:

kur P ir katrā paraugā novēroto pozitīvo fluorescējošo daļiņu kopējais skaits, S ir hemocitometrā novēroto kvadrātu kopējais skaits (N{0}}), V ir katra hemocitometrā novērotā kvadrāta tilpums (0,1 µl) un D ir peru pieniņa atšķaidīšanas koeficients (10x atšķaidījums). Visi paraugi tika novēroti identiskos mikroskopa iestatījumos.

Kamera tika iestatīta uz {{0}}bitu izšķirtspēju (Waters, 2009), kas nodrošina spilgtuma intensitātes vērtību diapazonā no 0 līdz 65 535. Lai identificētu pozitīvos fluorescences signālus mūsu patogēnu uztura paraugos, mums vispirms bija jānosaka fona trokšņa bāzes līmenis, virs kura mēs varētu noteikt, vai signāls ir īsta fluorescence vai tikai artefakts. Lai to izdarītu, mēs pārbaudījām intensitātes vērtības no katra mūsu kontroles diētas paraugu attēla un katrā no maksimālās intensitātes vērtības atņēmām minimālo intensitātes vērtību, lai iegūtu fona trokšņa diapazonu (Waters, 2009). Pēc tam mēs salīdzinājām visus mūsu kontroles diētas paraugu attēlus, lai iegūtu fona trokšņa diapazona vidējo un standarta novirzi. Pēc tam mēs uzskatījām, ka jebkurš signāls, ko novērojām savos patogēnu uztura paraugos, ir pozitīvs fluorescences signāls virs fona trokšņa, ja tas bija vismaz par 3 standarta novirzēm (P mazāks vai vienāds ar 0, 01) virs vidējā fona intensitātes diapazona. Vidējais (sd) fona intensitātes diapazons bija 329±27

Papildu pozitīvās un negatīvās kontroles

Lai apstiprinātu, ka marķētās baktērijas var fluorescēt peru pienā, mēs savācām peru pieniņa paraugus no vairākiem Eiropas un Ziemeļamerikas reģioniem (Austrija, Norvēģija, Arizonas štatā un Ilinoisā, ASV), atšķaidījām tos līdz 10 procentiem PBS buferšķīdumā, un pievienoja iezīmētās baktērijas (1 tilpuma procents) tieši paraugiem. Mēs izmantojām PBS buferšķīdumu ar standarta pH 7,4 (kā izmantots iepriekš) vai ar samazinātu pH 4.{7}}, kas atbilst peru pieniņa skābumam, lai noteiktu, vai vides skābums ietekmē fluorescences līmeni, kā norādīts marķēšanas komplekta ražotājs. Turklāt mēs veicām arī papildu negatīvo kontroli (pH 4, 0 PBS, bez marķētām baktērijām), lai apstiprinātu, ka fluorescences novērojumi nav saistīti ar mikroskopijas artefaktiem vai materiāla komponentu autofluorescenci. Mēs noskaidrojām, ka peru pieniņa paraugi no visiem ģeogrāfiskajiem reģioniem uzrādīja fluorescenci, kad tika pievienotas marķētas baktērijas, neatkarīgi no izmantotā bufera pH (S1 att.). Šis mikroskopijas darbs tika veikts ar Zeiss AxioZoom V16, izmantojot Axiocam HRm vienkrāsaino kameru.

Parauga sagatavošana proteomikas analīzei

Peru pieniņa paraugi tika atšķaidīti, pievienojot 150 µl 8 mol l-1 urīnvielas, un apstrādāti ar ultraskaņu ūdens vannā. Olbaltumvielu koncentrācija tika noregulēta uz 2,1 mg ml-1, izmantojot Bredforda testu ar galīgo tilpumu 100 µl. Cisteīna saites tika reducētas ar 45 mmol l-1 ditiotreitolu (#D0632, Sigma-Aldrich) 20 minūtes 37 grādu temperatūrā un istabas temperatūrā alkilētas ar 0,1 mol l-1 jodacetamīdu (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich). Paraugi tika sagremoti, pievienojot 0,75 µg tripsīna (Sekvences pakāpes modificētais tripsīns, V5111, Promega) nakti 37 grādu temperatūrā. Pēc sagremošanas peptīdi tika attīrīti ar C18 mikro spin kolonnām (Harvard Apparatus) saskaņā ar ražotāja protokolu. Žāvētie peptīdi tika atjaunoti buferšķīdumā A (30 µl 0,1% trifluoretiķskābes 1% acetonitrilā).

Šķidruma hromatogrāfija savienota ar tandēma masas spektrometriju (LC-MS/MS)

Analīze tika veikta ar EASY-nLC1{{10}00 šķidruma hromatogrāfu (Thermo Fisher Scientific), kas savienots ar Velos Pro-Orbitrap Elite hibrīda masas spektrometru (Thermo Fisher Scientific) ar nanoelektrosmidzināšanas jonu avotu ( Thermo Fisher Scientific). LC-MS/MS paraugi tika atdalīti, izmantojot divu kolonnu sistēmu, kas sastāvēja no 2 cm C18-Pepmap slazdu kolonnas (Thermo Fisher Scientific), kam sekoja 15 cm C18-Pepmap analītiskā kolonna ( Thermo Fisher Scientific). Lineārās atdalīšanas gradients sastāvēja no 5% bufera B (0,1% trifluoretiķskābes 98% acetonitrilā) 5 minūtes, 35% buferšķīduma B 60 minūtes, 80% bufera B 5 minūtes un 100% bufera B 10 minūtes pie plūsmas. ātrums 0,3 µl min-1. Katrai LC-MS/MS darbībai tika injicēti un analizēti 6 ul parauga. Pilna MS skenēšana tika iegūta ar izšķirtspēju 60,000 normālā masas diapazonā orbītas slazdā, un tam sekoja CID-MS2 20 visintensīvākie prekursoru joni jonu slazdā (enerģija 35). Dati tika iegūti, izmantojot LTQ Tune programmatūru.

Olbaltumvielu identifikācija

Šāviena proteomikas pieejā proteīni tiek fermentatīvi sagremoti mazākos peptīdos, un pēc tam šie peptīdi tiek saskaņoti ar proteīniem anotētā genomā. Dažas no šīm peptīdu sekvencēm var būt kopīgas vairākiem proteīniem, savukārt dažas ir unikālas vienam proteoma proteīnam. Mūsu analīze kopumā sniedza 496 proteīnu trāpījumus, kas satur vismaz 1 peptīdu spektra atbilstību (PSM) un 1 unikālu peptīdu.

Lai vēl vairāk izslēgtu viltus pozitīvus rezultātus, mēs uzskatījām tikai olbaltumvielas ar vismaz 2 unikāliem peptīdiem par uzticamiem proteīnu trāpījumiem, kā tas tika darīts citos peru pieniņa proteomikas pētījumos (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014) un daļēji tāpēc, ka eksperimentālās izmaiņas paraugu sagatavošanas posmos visvairāk ietekmē vismazāk sastopamos proteīnus masas spektrometriskajos paraugos (Zhang et al., 2010). Olbaltumvielas tika anotētas Amel_4.5 medus bišu genomā, un mēs izmantojām UniProt un GenBank, lai apstiprinātu to identitāti un funkcijas. Pēc tam mēs salīdzinājām 4 ar imūnsistēmu saistītu proteīnu pārpilnību kontroles diētā un patogēnu diētas peru pienā: glikozes oksidāze, BiVSP, lizocīms un defensīns-1.

Statistiskā analīze

Lai novērtētu ar imūnsistēmu saistīto proteīnu pārpilnību starp kontroles diētu un patogēnu diētu peru pieniņu, mēs salīdzinājām mūsu izvēlēto proteīnu PSM vērtības. Mēs izmantojām neparametriskus Vilkoksona rangu summas testus, lai noteiktu mūsu ierobežoto izlases lielumu (N=3 vienā ārstēšanā). Mēs izmantojām vienpusīgus salīdzinājumus, jo mūsu plānotās hipotēzes paredzēja, ka šīs atlasītās imūnās olbaltumvielas tiks pārregulētas peru pienā no patogēniem barotām kolonijām. Olbaltumvielu daudzuma izmaiņas tika aprēķinātas kā (PSMpathogen-PSMcontrol) / PSMcontrol. Visas analīzes tika veiktas R (versija 3.5.2).

REZULTĀTI

Patogēna fragmenti peru pienā

Mēs noskaidrojām, ka peru pieniņa paraugos no visām patogēnu uztura kolonijām bija daļiņas, kas fluorescēja ar ievērojami lielāku intensitāti nekā mūsu noteiktais fona fluorescences slieksnis (skatīt Materiāli un metodes), kas liecina, ka baktēriju fragmenti tika iekļauti peru pienā. Neviens kontroles diētas peru pieniņa paraugs nesaturēja daļiņas, kas pārsniedza šo slieksni (1. att.). Vidēji patogēnu uztura kolonijās bija 66,67 ± 28,87 (vidēji ± sd) fluorescējošas daļiņas uz mikrolitru peru pieniņa (N=3), savukārt kolonijās, kas barotas ar kontroli, bija 0 fluorescējošās daļiņas uz mikrolitru peru pieniņa ( N=3) (1. att.).

Proteomika

Mēs atradām pavisam 496 proteīnu trāpījumus, un no tiem 44 tiem bija piešķirti vismaz 2 unikāli peptīdi (1. tabula). Kā bija paredzēts, visizplatītākie proteīni visos paraugos bija galvenie peru pieniņa proteīni. Kopumā olbaltumvielas, ko novērojām savos paraugos, diezgan saskanēja ar citiem nesenajiem peru pieniņa proteomikas pētījumiem (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2012, 2013). 2019; Zhang et al., 2014), taču šajā pētījumā ir identificēti daži proteīni, par kuriem citur nav ziņots. Tie ietver transferrīnu, dzelzs transportēšanas molekulu (Kucharski un Maleszka, 2003), kas atrodama arī medus bišu indes dziedzeru audos (Peiren et al., 2008); Serpin-5, serīna proteāzes inhibitors, kas, kā zināms, regulē propenoloksidāzes aktivāciju citos kukaiņos (Li et al., 2016); Artišoks, ķīmiski sensors proteīns ar funkcijām Drosophila melanogaster kāpuru kustībā (Andrés et al., 2014); un NPC{15}}līdzīgs holesterīna transportētājs ar netiešām aloparentālām funkcijām medus bitēm (Thompson et al., 2006). Mēs arī atradām 3 papildu proteīnus mūsu patogēnu diētas peru pieniņa paraugos: glutationa peroksidāzi, peptidil-prolilcis-trans izomerāzi un neraksturīgu proteīnu (LOC725202). Šīs olbaltumvielas tika atrastas arī mūsu kontroles diētas paraugos, taču tās neatbilda mūsu kritērijiem, ka tiem ir 2 unikāli peptīdi (1.

Salīdzinot kontroles diētas un patogēnu diētas paraugus, mēs novērojām ļoti nelielas relatīvā olbaltumvielu daudzuma izmaiņas peru pienā (1. Starp mūsu fokusa imūno proteīniem mēs nekonstatējām būtiskas atšķirības olbaltumvielu līmeņos starp glikozes oksidāzes (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5, P=0.134), vai lizocīmu (U=2, P=0.184). Tomēr mēs atklājām ievērojami vairāk AMP defensīna-1 patogēnu uztura paraugos nekā kontroles diētas paraugos (U=0, P=0.05) ( 2. att.). Tam bija locījuma maiņa plus 0,68.

DISKUSIJA

Šis pētījums parāda, ka medmāsas, kas uzņem patogēna P. kāpuru šūnas, šķiet, iekļauj šūnu fragmentus ražotajā peru pienā (1. att.). Mēs nesen parādījām, ka strādnieku uzņemtās baktērijas tiek transportētas uz hipofaringeālajiem dziedzeriem, peru pieniņa sintēzes vietu (Harwood et al., 2019), un šeit mēs parādām, ka tās ir iekļautas peru pienā. Šis atklājums ir aizmirsts sociālās imunitātes ceļš, kas var ļaut ligzdām dalīties imunoloģiskajā atmiņā. Mūsu rezultāti arī liecina, ka peru pieniņa sastāvs var būt jutīgs pret svešķermeņiem, kas sistēmiski cirkulē hemolimfā. Līdzīgā nesen veiktā pētījumā pētnieki atklāja, ka medmāsas, kuras baroja ar divpavedienu RNS (dsRNS), spēja iekļaut šīs molekulas peru pienā un pārnest tās uz kāpuriem, kur dsRNS palika bioloģiski aktīva (Maori et al., 2019). dsRNS aktivizē pretvīrusu RNS traucējumu (RNAi) ceļu, kas izraisa sekvences specifisku gēnu klusēšanu, un sintētisko dsRNS bieži izmanto mērķtiecīgiem gēnu notriekšanas pētījumiem (Fire et al., 1998). Turklāt cits pētījums parādīja, ka medmāsas, kas barotas ar pesticīdiem, var iekļaut šo agroķīmisko vielu niecīgu daudzumu savā peru pienā (Böhme et al., 2018), lai gan šeit uzsvars tika likts uz to, cik labi hipofaringeālie dziedzeri novērš sistēmisku pesticīdu iekļūšanu peru pienā. .

Tomēr šie rezultāti liecina, ka peru pieniņa sastāvs var būt jutīgs pret māsu bišu stāvokli. Šie atklājumi liecina, ka peru pieniņš var kalpot par AB kanālu 1. att.. Peru pieniņa paraugu fluorescences un spilgtā lauka mikrogrāfijas no kontroles diētas un patogēnu diētas ārstēšanas, kas novērotas hemocitometrā. Visi paraugi (A, ārstēšana ar kontroles diētu; B, ārstēšana ar patogēnu diētu) tika sagatavoti vienlaikus, izmantojot identiskus protokolus, un novēroti identiskos mikroskopa iestatījumos, izmantojot Leica DM6000. Tumšie attēli kreisajās kolonnās tika uzņemti ar TRITC lāzeru, lai identificētu fluorescenci Teksasas sarkanā viļņa garumā, savukārt attēli labajās kolonnās ir tā paša apgabala spilgti lauka attēli, lai parādītu peru pieniņa nogulsnēšanos hemocitometrā. Pozitīvi fluorescences plankumi (baltas bultiņas) tika novēroti tikai patogēna uztura paraugos (B), nevis kontroles diētas paraugos (A). 4 tūlītēji jautājumi.

Pirmkārt, kā patogēna iedarbība noved pie tā, ka medmāsas rada paaugstinātu defensīna{0}} līmeni peru pienā? Viena iespēja ir, ka P. larvae fragmenti saistās ar patogēnu modeļa atpazīšanas receptoriem Toll ceļā (Grampozitīvām baktērijām) un inducē lielāku defensīna-1 gēnu transkripciju, taču pierādījumi par to ir nedaudz pretrunīgi. Pētījumi liecina, ka pieaugušie strādnieki, kas pakļauti baktērijām, tostarp amerikāņu peru peru iedarbībai, palielinās defensīna -1 ekspresiju (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994), taču nesen veiktā pētījumā netika novērota būtiska defensīna-1 ekspresija medmāsas galvas audos pēc saskares ar Amerikas peru peru (López-Uribe et al., 2017).

Tomēr kukaiņu AMP, piemēram, defensīnu-1, var novērot hemolimfā vairākas nedēļas pēc patogēna iedarbības (Casteels, 1998), pat ja šādu AMP gēnu transkripcija šajā laikā samazinās (Uttenweiler-Joseph et al., 1998), tāpēc tikai mērot gēnu ekspresiju, var palaist garām svarīgu informāciju par gala peptīdu produktu pieejamību. Alternatīvi, patogēna iedarbība var pārregulēt defensīna-1 mRNS translāciju peptīdos vai palielināt pēctranslācijas modifikāciju ātrumu, ko izmanto, lai aktivizētu peptīdu (Casteels-Josson et al., 1994), taču tam būs jābūt pētīja tālāk.

Otrs jautājums, ko rada šie rezultāti, ir, vai relatīvā defensīna 0,68 reize ir bioloģiski nozīmīga. Parasti daudzos cilvēka proteomikas pētījumos tiek izvēlēts plus 1,2 slieksnis nozīmīgai regulēšanai (Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009), tāpēc defensīns -1 neatbilstu šim kritērijam. Tomēr pat neliela defensīna-1 koncentrācijas palielināšanās peru pienā var uzlabot kāpuru izturību pret Amerikas peru peru. Ir pierādīts, ka defensīns-1 ne tikai tieši inhibē Amerikas peru peru veidošanos (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001), bet arī ir efektīvs pret grampozitīvām baktērijām koncentrācijā, kas ir līdz 1 µmol l−. 1 (Fujiwara et al., 1990). Turklāt ir zināms, ka vairāki iedzimtas imūnsistēmas komponenti darbojas sinerģiski, tādējādi diviem komponentiem, kas darbojas kopā, ir lielāka patogēnu inhibējošā iedarbība nekā katra komponenta summai, kas darbojas neatkarīgi.

Piemēram, baktēriju augšanas kavēšanas testi ir parādījuši, ka AMP un lizocīms darbojas kopā, lai ievērojami uzlabotu viens otra efektivitāti (Chalk et al., 1994). Ir arī pierādīts, ka lizocīms cīnās pret patogēniem sinerģiski ar apolipoproteīnu-III (ApoLp-III) (Zdybicka-Barabas et al., 2013), lipīdus transportējošu proteīnu ar anti-patogēnām funkcijām kukaiņiem (Whitten et al., 2004; Kim un Jin, 2015), kas ir atrodams peru pienā (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Zhang et al., 2014; Fujita et al., 2013). Visbeidzot, jauno medus bišu kāpuru imūnsistēmai, kas nobriest, var rasties grūtības, lai ražotu defensīnu{13}}, ja tiem uzbrūk Amerikas peru pāri, jo pētījumi ir parādījuši, ka šāds izaicinājums maz vai nemaz neinducē defensīna{14}} ekspresiju kāpuros (Romanelli et al. al., 2011 Cremer et al., 2007; Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009, lai gan izņēmuma gadījumā skatīt Bachanová et al., 2002). Tādējādi papildu defensīns-1 no pakļautajām medmāsām var papildināt kāpuriem šī svarīgā AMP trūkumu. Kopumā šie atklājumi liecina, ka pat neliels defensīna{21}} palielinājums peru pienā var būt bioloģiski nozīmīgs, aizsargājot kolonijas visneaizsargātākos locekļus.

Šis pētījums arī parādīja Vg proteīna kritisko lomu medus bišu imunitātē. Pateicoties tā lomai kā patogēnu modeļu atpazīšanas receptoram, kas ir dokumentēts plašā dzīvnieku taksonu diapazonā (Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al. al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011), kā arī tā lomu olu veidošanā, Vg ir identificēts kā nesējproteīns, kas transportē imūno izsaucējus karalienes olās (Salmela et al. al., 2015). Tāpat jaunākie atklājumi medmāsām liecina, ka Vg ir galvenā loma uzņemto patogēnu transportēšanā uz hipofaringeālajiem dziedzeriem (Harwood et al., 2019). Vg uzņem medmāsu hipofaringeālie dziedzeri, lai tos izmantotu kā aminoskābju donoru peru pieniņa ražošanā (Amdam et al., 2003), un Vg var transportēt baktērijas dziedzeros, lai tās tiktu iekļautas želejā. Tādējādi Vg var būt nozīme visos koloniju līmeņa TGIP posmos medus bitēm, sākot no pirmās inokulācijas un iekļaušanas peru pienā līdz piegādei mātei vai kāpuriem un, visbeidzot, transportēšanā mātes olnīcās.

Šis pētījums parādīja, ka peru pieniņa sastāvu var mainīt patogēna iedarbība, gan iekļaujot patogēnu fragmentus, gan palielinot AMP defensīna-1 līmeni. Spēja pārnest patogēnu fragmentus peru pienā nozīmē, ka transpaaudžu imūnsistēma medus bitēm var darboties visas kolonijas līmenī. Papildus imūno stimulatoru vertikālai pārnešanai no reproduktīvas mātītes uz viņas pēcnācējiem, medus bitēm var būt sarežģītāks ceļš, kas iet no pieaugušiem pēcnācējiem (medmāsām) līdz reproduktīvai mātītei uz nākamajiem pēcnācējiem, kā arī horizontāla transmisija no pieaugušiem pēcnācējiem uz nenobriedušiem. pēcnācēji. Ieguvums šeit būtu tāds, ka kāpuri tiek inokulēti ar lielāku imūno stimulatoru repertuāru, kas uzkrāts no kolektīvās imunoloģiskās pieredzes darbiniekiem, kuri savāc resursus ārpus ligzdas, padarot kāpurus izturīgākus pret patogēniem, ar kuriem tie varētu saskarties, izkāpjot no ligzdas. .

Pateicības

Mēs pateicamies Siiri Fuchs, Salla Lohi, Mati Leponiemi, Franziska Dickel, Maarit Nurminen, Marianne Teichmann un Taina Stark par palīdzību datu vākšanā un konsultācijās par analīzi. Mēs arī pateicamies Austin Cyphersmith par tehnisko palīdzību saistībā ar mikroskopiju.

Konkurējošas intereses

GH un GA nedeklarē nekādas konkurējošas vai finansiālas intereses. HS un DF ir uzskaitīti kā izgudrotāji patentā (WO2017017313A1) par ēdamo bišu vakcīnu. Šis patents ir piešķirts Dalan Animal Health Inc., kur DF darbojas kā galvenais zinātniskais darbinieks. Šajā rakstā aprakstītais pētījums tika veikts neatkarīgi, bez finansiāliem, materiāliem vai analītiskiem resursiem, ko nodrošināja Dalan Animal Health Inc. vai kāds cits komercuzņēmums.

Autoru ieguldījums

Konceptualizācija: GH, HS, GA; Metodoloģija: GH, HS; Validācija: GH; Formālā analīze: GH, HS; Izmeklēšana: GH, HS; Resursi: HS, DF, GA; Datu pārzināšana: GH; Rakstīšana - oriģinālais melnraksts: GH; Rakstīšana - pārskatīšana un rediģēšana: GH, HS, DF, GA; Vizualizācija: GH; Uzraudzība: GA; Projekta administrācija: DF, GA; Finansējuma iegūšana: GH, DF, GA

Finansējums

GH atbalstīja Arizonas štata universitātes absolventu pētniecības un atbalsta programma (LM51097GH). DF tika atbalstīta ar Business Finland grantu (2348/31/2017) un Somijas akadēmijas stipendiju (6303369). GA atbalstīja Norges Forskningsråd (262137).

For more information:1950477648nn@gmail.com