Spike un Nsp6 ir galvenie SARS-CoV-2 Omicron BA.1 vājināšanās noteicošie faktori

SARS-CoV-2 Omicron variants ir vairāk imunitāti izvairīgs un mazāk virulents nekā citi galvenie vīrusa varianti, kas līdz šim ir atzīti 1.–12. Omicron smaile (S) proteīns, kuram ir neparasti liels mutāciju skaits, tiek uzskatīts par galveno šo fenotipu virzītāju. Šeit mēs izveidojām himērisku rekombinanto SARS-CoV-2, kas kodē Omicron S gēnu (BA.1 līnija) senču SARS-CoV-2 izolāta mugurkaulā, un salīdzinājām šo vīrusu ar dabiski cirkulējošo Omicron. variants. Omicron S nesošais vīruss spēcīgi izvairījās no vakcīnas izraisītās humorālās imunitātes, galvenokārt receptoru saistošā motīva mutāciju dēļ; tomēr atšķirībā no dabiski sastopamā Omicron tas efektīvi replikējas šūnu līnijās un primārajām līdzīgām distālajām plaušu šūnām. Līdzīgi K18-hACE2 pelēm, lai gan vīrusu nesošais Omicron S izraisīja mazāk smagu slimību nekā senču vīruss, tā virulence netika novājināta līdz Omicron līmenim. Turpmākā izpēte parādīja, ka nestrukturālā proteīna 6 (nsp6) mutācija papildus S proteīnam bija pietiekama, lai apkopotu Omicron novājināto fenotipu. Tas norāda, ka, lai gan Omicron vakcīnas aizbēgšanu veicina mutācijas S, Omicron patogenitāti nosaka mutācijas gan S proteīnā, gan ārpus tā.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

No 2022. gada decembra COVID-19 pandēmijas secīgos viļņus izraisīja pieci galvenie SARS-CoV-2 varianti, kas pazīstami kā problemātiskie varianti (VOC): Alfa (B.1.1.7.) , Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2 un AY līnijas) un Omicron (BA līnijas)13. Omicron ir visjaunākais GOS, un to pirmo reizi dokumentēja Dienvidāfrikā, Botsvānā un ceļotājs no Dienvidāfrikas Honkongā 2021. gada novembrī (GISAID ID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Tas ātri pārņēma pasauli, dažu nedēļu laikā izspiežot iepriekš dominējošo Delta variantu un līdz 2022. gada janvārim veidojot lielāko daļu jauno SARS-CoV{20}} infekciju (atsauce 16.–18.). Līdz šim ir identificētas vismaz piecas Omicron līnijas: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 un BA.5. BA.1 (turpmāk saukts par Omicron) uzrāda ievērojamu izvairīšanos no infekcijas un vakcīnas izraisītas humorālās imunitātes3,19. Turklāt tas ir mazāk virulents nekā citi GOS cilvēkiem un in vivo infekcijas modeļi 4, 5, 7, 11, 12, 20. Omicron atšķiras no SARS-CoV-2 prototipa Wuhan-Hu-1 ar 59 aminoskābēm; 37 no šīm izmaiņām ir S proteīnā, palielinot iespēju, ka S ir Omicron patogēnās un antigēnās uzvedības pamatā.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

S mutācijas ietekmē Omicron replikāciju šūnu kultūrā

Salīdzinot ar Wuhan-Hu-1, Omicron S proteīns satur 3 0 aminoskābju aizstāšanas, 6 dzēšanas un vienu 3 aminoskābju ievietojumu (paplašinātie dati 1. att.). Divdesmit piecas no šīm izmaiņām ir raksturīgas tikai Omicron attiecībā pret citiem GOS, lai gan dažas no tām ir ziņots notekūdeņos un nelielos SARS-CoV-2 variantos21,22. Lai pārbaudītu S proteīna lomu Omicron fenotipā, mēs izveidojām himērisku rekombinanto vīrusu, kas satur Omicron S gēnu (USA-lh01/2021) un visus citus senču SARS-CoV-2 (GISAID EPI{) gēnus. {16}}ISL_2732373)23 (paplašinātie dati, 2.a att.). Šis himēriskais vīruss ar nosaukumu Omi-S tika iegūts, izmantojot modificētu cirkulārās polimerāzes pagarināšanas reakcijas (CPER)24 formu (paplašinātie dati 2.b att.), kas radīja ļoti koncentrētus vīrusu krājumus, kas satur 0,5 × 106 -5 × 106 aplikumu veidojošus. vienības (PFU) uz ml, no transfektētajām šūnām divu dienu laikā pēc transfekcijas (paplašinātie dati 2.c, d att.), tādējādi novēršot nepieciešamību pēc turpmākas vīrusa pastiprināšanas.

1. att.|S ietekme uz Omicron augšanas kinētiku in vitro. vīrusu shēma. S, smaile; N, nukleokapsīds. b–e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnas (b,d) un Vero E6 šūnas (c,e) tika inficētas ar MOI 0.01, un N-pozitīvo šūnu procentuālais daudzums (n=6 atkārtojumi) (b, c) un infekciozo daļiņu izdalīšanās (n=3 atkārtojumi) (d, e) tika noteikts ar plūsmas citometriju un aplikuma testu, attiecīgi. f, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnas tika inficētas ar vīrusu maisījumiem attiecībā 1:1, lai iegūtu galīgo MOI 0.005 katram vīrusam . Šūnas tika fiksētas norādītajos laikos un pakļautas plūsmas citometrijai. Kreisais, reprezentatīvs punktu gabals; pa labi, neinficēto, ar Omi-S/mCherry inficēto, ar Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG) un divreiz inficēto šūnu procentuālais daudzums. Kompensācijai tika izmantotas atsevišķi inficētas šūnas. Kļūdu joslas, vidējais ± sd (n {{20}} atkārtojumi). g, Plāksnīšu izmēri. Kreisajā pusē attēloti reprezentatīvi plāksnīšu attēli uz ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnām. Pa labi, plāksnīšu diametrs ir attēlots kā vidējais ± sd no 20 plāksnēm uz vienu vīrusu. h, cilvēka iAT2 epitēlija šūnas tika inficētas ar MOI 2, 5 48 vai 96 stundas. Šūnu apikālā puse tika mazgāta ar 1 × fosfātu buferšķīdumu (PBS), un infekciozo vīrusu daļiņu līmenis tika mērīts ar plāksnes testu. Kļūdu joslas, vidējais ± sd (n=4 atkārtojumi). Eksperimenti tika atkārtoti divreiz, katrs eksperimenta atkārtojums saturēja 3 (b – g) vai 4 (h) atkārtojumus. P vērtības tika aprēķinātas ar divpusēju, nesapārotu t-testu ar Velča korekciju. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 un ****P < 0,0001; NS, nav būtiski. Plūsmas citometrijas noteikšanas stratēģija ir parādīta 1. papildu attēlā.

Vispirms mēs salīdzinājām Omi-S infekcijas efektivitāti ar senču D614G saturošu vīrusu (GISAID EPI_ISL_2732373; ģenerēja CPER; turpmāk saukts par savvaļas tipu (WT)) un Omicron izolātu. (ASV-lh01/2021) šūnu kultūrā (1.a attēls). Šim nolūkam mēs inficējām ACE2- un TMPRSS2-, kas izsaka Caco-2 (turpmāk ACE2/TMPRSS2/Caco-2) un Vero E6 šūnas ar Omi-S, WT un Omikrons ar infekcijas daudzveidību (MOI) 0,01 un uzraudzīta vīrusa izplatīšanās ar plūsmas citometriju un aplikuma veidošanās testu. WT vīruss un Omi-S strauji izplatījās ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnās, radot attiecīgi 89% un 80% inficēto šūnu 24 stundas pēc inficēšanās (HPI) (1.b attēls). Turpretim Omicron replikējās lēnāk, izraisot 48% inficēto šūnu ar 24 hpi. Līdzīgs modelis tika novērots Vero E6 šūnās, kurās attiecīgi 60% un 41% šūnu bija pozitīvi attiecībā uz WT un Omi-S pie 48 hpi, pretstatā 10% Omicron (1.c attēls). Plāksnes tests parādīja, ka, lai gan gan Omi-S, gan Omicron radīja zemāku infekciozo vīrusu daļiņu līmeni, salīdzinot ar WT, Omi-S vīrusa titrs bija ievērojami augstāks nekā Omicron. ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnās Omi-S ražoja 5.1- reizes (P=0.0006) un 55- reizes (P {{49}). }.0312) vairāk infekciozu daļiņu nekā Omicron ar ātrumu attiecīgi 12 hpi un 24 hpi (1.d attēls). Līdzīgi, Vero E6 šūnās Omi-S infekciozā vīrusa titri bija 17- reizes (P=0,0080) un 11- reizes (P=0,0078) augstāki. nekā Omicron ar jaudu attiecīgi 24 hpi un 48 hpi (1.e attēls). Atšķirība starp vīrusiem vēlākos laika punktos kļuva mazāk acīmredzama, jo Omi-S, salīdzinot ar Omicron, izraisīja augstāku citotoksicitāti (paplašinātie dati 3.a att.). Paaugstināta Omi-S replikācijas efektivitāte salīdzinājumā ar Omicron tika saglabāta, testējot ar dažādiem MOI (paplašinātie dati 3.b att.). Mēs arī apstiprinājām Omi-S fitnesa priekšrocības salīdzinājumā ar Omicron ar tiešas konkurences testu. Šim nolūkam mēs vispirms ģenerējām rekombinanto Omicron (mikronu), kas mūsu šūnu kultūras pārbaudēs atdarināja dabiskā Omicron replikācijas kinētiku (paplašinātie dati 4. att.). Pēc tam mēs izveidojām mCherry saturošus Omi-S un mNeonGreen saturošus Omicron un inokulējām ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnas ar šiem vīrusiem, kas sajaukti attiecībā 1:1. Inficēto šūnu plūsmas citometriskā analīze dažādos infekcijas laikos parādīja, ka Omi-S/mCherry replikācijas ziņā bija nepārprotami pārāks par Omicron/mNeonGreen (1. fig.). Visbeidzot, Omi-S augstāka infekcijas efektivitāte atspoguļojās arī plāksnes izmērā; lai gan WT vīruss radīja lielākās plāksnes (apmēram 4,1 mm), Omi-S plāksnīšu izmērs (apmēram 2,2 mm) bija divas reizes lielāks (P <0,0001) nekā Omicron plāksnīšu izmērs (apmēram 1,1 mm) (1.g attēls). Šie rezultāti liecina, ka, lai gan mutācijas S proteīnā ietekmē Omicron infekcijas efektivitāti, tās pilnībā neizskaidro Omicron fenotipu.

Vairākas pierādījumu līnijas norādīja, ka S proteīns, kas iekļauts Omi-S, izturējās tāpat kā dabiskajā Omicron. Piemēram, kā aprakstīts iepriekš20,25, Omicron S bija vāji sadalīts salīdzinājumā ar WT S; tā kā 71% S WT virionos bija šķeltā formā, tikai 45% un 47% tika sadalīti attiecīgi Omi-S un Omicron (paplašinātie dati 5.a att.). Tāds pats S šķelšanās modelis bija redzams ar vīrusu inficētām šūnām (WT, šķelti 63%; Omi-S, šķelti 33%; Omicron, 42% šķelti) (paplašinātie dati 5.b att.). Šie eksperimenti arī atklāja, ka Omicron S tika neefektīvi iekļauts vīrusa daļiņās, salīdzinot ar WT S (S un nukleokapsīda (N) attiecība: 3,40 WT vīrusam, 1,91 Omi-S un 2,04 Omicron) (paplašinātie dati 5.a att.). Līdzīgi gan Omi-S, gan Omicron radīja mazāku sincitiju, salīdzinot ar WT vīrusu, par kuru iepriekš ziņots attiecībā uz Omicron20,26 (paplašinātie dati 5.c att.). Visbeidzot, saskaņā ar publicēto literatūru25, Omi-S un Omicron deva priekšroku katepsīna izraisītai ievadīšanai, par ko liecina to augstāka jutība pret katepsīna inhibitoru E64d (paplašinātie dati 6. att.). Pēc tam mēs salīdzinājām WT, Omi-S un Omicron replikācijas kinētiku plaušu epitēlija šūnās, kas veido galveno vīrusa replikācijas vietu pacientiem ar COVID-19 (atsauce 27, 28). Attiecīgi mēs izmantojām cilvēka izraisītas pluripotentas cilmes (iPS) šūnas, kas iegūtas no plaušu alveolārā tipa 2 epitēlija (iAT2). AT2 šūnas ir būtiska šūnu populācija distālajā plaušās un ir viens no SARS-CoV-2 infekcijas primārajiem mērķiem28,29. Mēs inficējām iAT2 šūnas, kas audzētas kā gaisa un šķidruma saskarnes (ALI) kultūra, ar MOI 2, 5 un novērojām vīrusu pēcnācēju sekrēciju šūnu apikālajā pusē pie 48 hpi un 96 ZS. Atbilstoši rezultātiem, kas iegūti no šūnu līnijām, WT vīruss radīja visaugstāko infekciozo vīrusu daļiņu līmeni (1.h att.). Starp Omi-S un Omicron pirmais deva apmēram piecas reizes (P=0.0008) augstāku infekciozā vīrusa titru pie 48 ZS. Vīrusu titri WT un Omi-S samazinājās par 96 dpi salīdzinājumā ar 48 ZS infekcijas citopātiskā efekta (CPE) dēļ. Tomēr Omicron CPE netika novērota, kas izraisīja ilgstošu infekciozu virionu veidošanos. Kopumā šie rezultāti apstiprina secinājumu, ka S mutācijas pilnībā neatspoguļo Omicron novājināto replikācijas spēju šūnu kultūrā.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Minimālā S loma Omicron patogenitātē pelēm

Lai noskaidrotu, vai Omi-S ir augstāka in vivo piemērotība salīdzinājumā ar Omicron, mēs pētījām Omi-S infekcijas iznākumu attiecībā pret WT SARS-CoV-2 un Omicron K18-hACE2 pelēm. Saskaņā ar publicēto literatūru4,5 intranazālā inokulācija pelēm (vecumā no 12 līdz 20 nedēļām) ar Omicron (104 PFU uz peli) neizraisīja būtisku svara zudumu, turpretim inokulācija ar WT vīrusu izraisīja strauju ķermeņa masas samazināšanos visām pelēm. zaudējot vairāk nekā 20% no sākotnējā ķermeņa svara 8 dienas pēc inficēšanās (dpi) (2.a attēls). Jāatzīmē, ka 80% peļu, kas inficētas ar Omi-S, arī zaudēja vairāk nekā 20% no sava ķermeņa svara par 9 dpi (2.a attēls un paplašinātie dati, 7.a attēls). Klīnisko punktu novērtējums (svara zuduma kumulatīvs rādītājs, patoloģiska elpošana, neparasts izskats, samazināta reakcija un mainīta uzvedība) arī atklāja līdzīgu modeli; tā kā pelēm, kas inficētas ar Omikronu, klīniskas slimības pazīmes bija maz vai vispār nebija, ar WT un Omi-S inficēto cilvēku veselība strauji pasliktinājās, un WT vīruss izraisīja smagāku slimību (P=0.0102) (att. 2.b un paplašinātie dati 7.b att.). Tā kā SARS-CoV-2 izraisa letālu infekciju K18-hACE2 pelēm4, mēs salīdzinājām peļu dzīvildzi pēc vīrusu infekcijas. Piekrītot ķermeņa svara zuduma un klīniskā rezultāta rezultātiem, WT un Omi-S izraisīja attiecīgi 100% (6/6) un 80% (8/10) mirstības līmeni. Turpretim visas ar Omicron inficētās peles izdzīvoja (2.c att.). Šie atklājumi, kas atbilst nesenai publikācijai30, liecina, ka S proteīns nav vienīgais Omicron patogenitātes noteicējs K18-hACE2 pelēm.

Pēc tam mēs salīdzinājām Omi-S izplatīšanos ar Omicron un WT SARS-CoV-2 K18-hACE2 peļu plaušās un deguna turbinātos. Peles (12–20 nedēļas vecas) intranazāli tika pakļautas 104 PFU (septiņas peles uz vienu vīrusu), un vīrusu titri peļu plaušās tika mērīti ar 2 un 4 dpi. Saskaņā ar in vitro konstatējumiem infekciozā vīrusa titrs ar WT inficētu peļu plaušās bija augstāks nekā konstatētais pelēm, kas inficētas ar pārējiem diviem vīrusiem (2.d attēls). Tomēr jāatzīmē, ka Omi-S inficētās peles radīja 30- reizes (P=0.0286) vairāk infekciozu vīrusu daļiņu, salīdzinot ar Omicron inficētām pelēm ar 2 dpi. Titrs samazinājās par 4 dpi ar WT un Omi-S inficētām pelēm, bet tas liecināja par pieaugošu tendenci ar Omicron inficētām pelēm, norādot uz vieglas, bet pastāvīgas Omicron infekcijas iespējamību K18-hACE2 pelēm. Visi trīs varianti, kas atgūti no peļu plaušām, saglabāja tādu pašu aplikuma lieluma fenotipu kā sākotnējais inokulāts, norādot, ka replikācijai pelēm nebija nosakāmas ietekmes uz šo vīrusu genotipiem (dati nav parādīti).

Lai novērtētu vīrusu patogenitāti K18-hACE2 peļu plaušās un deguna dobumos, mēs veicām šo audu histopatoloģisko analīzi ar 2 dpi. Kā ziņots iepriekš4,31, ar WT vīrusu inficētu peļu plaušu alveolās tika konstatēta plaša gandrīz izkliedēta SARS-CoV-2 N proteīna imūnreaktivitāte (2.e attēls). Turpretī Omi-S un Omicron infekcija radīja lokālus alveolāras iekrāsošanās perēkļus ar mazāku Omicron perēkļu skaitu, salīdzinot ar Omi-S. Visizteiktākais fenotips tika novērots bronhu epitēlijā, kurā Omi-S izraisīja izteiktu, regulāri apkārtmēru infekciju, un aptuveni 10–15% bronhiolu bija pozitīvi attiecībā uz vīrusa N proteīnu pie 2 dpi, turpretim tikai 3–5% bronhiolu bija N. -pozitīvs Omicron (att. 2f). WT vīruss inficēja aptuveni 1% bronhiolu un visos gadījumos ietvēra tikai vienu izolētu epitēlija šūnu katrā bronhiolā. Turklāt bronhiolārā infekcija bija saistīta ar epitēlija nekrozi ar Omi-S inficētām pelēm, kā noteikts, veicot hematoksilīna un eozīna (H&E) sekcijas sērijveida analīzi, turpretim ar Omicron vai WT inficētām pelēm netika novēroti histoloģiski pierādījumi par elpceļu ievainojumiem (paplašināti dati). 8.a,b att.). Ar WT un Omi-S vīrusiem inokulēto peļu deguna turbinātos bija daudz SARS-CoV-2-pozitīvu šūnu, kas bija saistītas ar atklātu citopātisku iedarbību, savukārt Omicron ražoja retas, sporādiski pozitīvas šūnas bez acīmredzamām epitēlija pazīmēm. traumas (paplašināti dati 8.c att.). Kopumā šie atklājumi liecina, ka Omicron replikācija peles elpošanas traktā ir ievērojami novājināta salīdzinājumā ar Omi-S, apstiprinot mūsu secinājumu, ka S mutācijas ir tikai daļēji atbildīgas par Omicron novājinātu patogenitāti.

S un nsp6 mutācijas nosaka Omikrona vājināšanos

Papildus S proteīnam Omicron ir aminoskābju izmaiņas nestrukturālajos proteīnos 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, apvalkā (E), membrānā (M) un N proteīnos, salīdzinot ar WT vīrusu. (Paplašinātie dati 9.a att.). Lai identificētu proteīnus, kas nav saistīti ar Omicron vājināšanos, mēs izveidojām lielu fluorescējoši marķētu himērisko vīrusu paneli, katrs satur Omicron S kombinācijā ar vienu Omicron proteīnu bez smaile, bet atlikušie proteīni nāk no WT vīrusa (paplašinātie dati). 9.b att.). Kad mēs apvienojām Omicron S ar Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), mēs novērojām spēcīgu vīrusu replikācijas samazināšanos, infekcijas kinētikai atdarinot Omicron šūnu kultūru (3.a–d att.); citiem himēriskajiem vīrusiem šāds samazinājums netika novērots. Slikto Omi-S/nsp6 replikācijas efektivitāti apstiprināja arī mūsu konstatējums, ka gan Omi-S/nsp6, gan Omicron bija nepieciešamas gandrīz piecas līdz sešas dienas, lai atgūtu ar CPER, bet visi pārējie varianti tika atgūti divās dienās (dati nav parādīti). Visbeidzot, tāpat kā Omicron, Omi-S/nsp6 nepārprotami pārspēja Omi-S tiešās konkurences testā (3.e attēls).

2. att.|S loma Omikrona patogenitātē. a–c, K18-hACE2 peļu tēviņi un mātītes (vecumā no 12 līdz 20 nedēļām) tika intranazāli inokulētas ar 1 × 104 PFU WT (n=6 peles), Omi-S (n=10 peles) vai Omicron (n {{1{{40}}}} peles) vīruss. Šajā eksperimentā tika izmantoti divi neatkarīgi ģenerēti vīrusu krājumi. Ķermeņa svars (a), klīniskais rādītājs (b) un dzīvildze (c) tika kontrolēts katru dienu 14 dienas. Peles, kuras zaudēja 20% no sākotnējā ķermeņa svara, tika eitanāzētas. d,e, K18-hACE2 pelēm intranazāli inokulēja 1 × 104 PFU WT (n=14 peles), Omi-S (n=14 peles) un Omicron (n {{). 20}} peles). Inficēto peļu plaušu paraugi tika savākti ar 2 vai 4 dpi, lai noteiktu vīrusa titru (n=4 peles) (d) vai imūnhistoķīmijas (IHC) noteikšanai N proteīnam (n=3 peles). (e). E attēlā ir parādīti reprezentatīvi IHC attēli, kuros redzami SARS-CoV-2 N (brūna krāsa) alveolās (bultiņas) un bronhioli (bultu uzgaļi) peļu plaušās ar 2 dpi. Mēroga stieņi, 100 µm. f, N-pozitīvo bronhiolu procentuālais daudzums inficēto peļu plaušās (n=3 peles) pie 2 dpi. Katrs punkts apzīmē inficētu peli. Statistisko nozīmīgumu noteica, izmantojot divpusēju, nesapārotu t-testu ar Velča korekciju (a, b, d, f) un log-rank (Mantel-Cox) testu (c). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 un ****P < 0,0001; NS, nav būtiski.

K18-hACE2 peļu plaušās, lai gan Omi-S izraisīja plašu bronhiolu infekciju un ievainojumus, gan Omicron, gan Omi-S/nsp6 uzrādīja samazinātu infekciju bez epitēlija bojājuma pazīmēm (3. f attēls). Saskaņā ar šiem atklājumiem Omi-S/nsp6-inficēto peļu plaušas radīja vīrusu titrus, kas ir līdzvērtīgi rOmicron un Omicron izolātam (3.g attēls). Visbeidzot, 71% peļu, kas inficētas ar Omi-S/nsp6, izdzīvoja (3.h att.), atšķirībā no izdzīvošanas rādītājiem tikai 20%, kas tika novēroti ar Omi-S inficētām pelēm (2.c att.). Kopumā šie rezultāti liecina, ka mutācijas S un nsp6 ir pietiekamas, lai noteiktu Omicron novājinātu virulenci. Šie novērojumi apstiprina un vēl vairāk paplašina iepriekšējā pētījuma secinājumus, kas parāda, ka mutācijas 5'-UTR–nsp12 reģionā, kurā atrodas nsp6, veicina Omicron vājināšanos K18-hACE2 pelēm30.

3. att.|S un nsp6 mutācijas veicina Omicron patogenitāti.a–d, norādīto mNeonGreen reportiervīrusu replikācijas kinētika ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnās (MOI=0.01), ko nosaka plūsma. citometrija (n=3 atkārtojumi) (a, c) un aplikuma tests (n=3 atkārtojumi) (b, d). Eksperimenti tika atkārtoti divreiz. e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnas tika inficētas ar vīrusu maisījumiem attiecībā 1:1, lai iegūtu galīgo MOI 0.005 katram vīrusam . Šūnas tika fiksētas norādītajos laikos un analizētas ar plūsmas citometriju. Tiek parādīts neinficēto, atsevišķi inficēto un divreiz inficēto šūnu procentuālais daudzums. Kompensācijai tika izmantotas atsevišķi inficētas šūnas. Atsevišķi datu punkti tiek attēloti kopā ar vidējo ± sd (n=3 atkārtojumi). Eksperiments tika atkārtots divas reizes. f–h, K18-hACE2 pelēm intranazāli inokulēja 1 × 104 PFU vīrusu. Inficēto peļu plaušu paraugi tika savākti ar 2 dpi, lai IHC noteiktu N proteīnu (n=3 peles) (f) vai vīrusu titru noteikšanai (n=4 peles) (g). F attēlā N-pozitīvo bronhiolu H&E krāsošanas reprezentatīvie attēli ir parādīti ielaidumos. Bronhiola epitēlija nekroze ir norādīta ar bultiņām. Ar Omicron vai Omi-S/nsp6 inficētu peļu bronhiālos nekrozes pazīmes netika novērotas. Mēroga josla, 100 µm. Labajā grafikā f parāda N-pozitīvo bronhiolu procentuālo daudzumu inficēto peļu plaušās. Katrs punkts apzīmē inficētu peli. h, Inficēto peļu izdzīvošana, ko uzrauga katru dienu 14 dienas. Peles, kuras zaudēja 20% no sākotnējā ķermeņa svara, tika eitanāzētas. Statistisko nozīmīgumu noteica, izmantojot divpusēju, nesapārotu t-testu ar Velča korekciju (a–g) un log-rank (Mantel-Cox) testu (h). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 un ****P < 0,0001; NS, nav būtiski.

S proteīna RBM veicina Omicron vakcīnas aizbēgšanu

Liels literatūras klāsts ir sniedzis pierādījumus par plašo Omicron izbēgšanu no vakcīnas izraisītas humorālās imunitātes14,19. Lai definētu S reģionus, kas saistīti ar Omicron imūnescape fenotipu, mēs vispirms salīdzinājām vakcinētu indivīdu serumu in vitro neitralizācijas aktivitāti pret WT SARS-CoV-2 (ASV-WA1/20). 20), Omi-S un Omicron. Tika iekļauti serumi, kas savākti divu mēnešu laikā pēc otrās mRNS-1273 (Moderna mRNS vakcīna; n=12) vai BNT162b2 (Pfizer-BioNTech mRNS vakcīna; n=12) vakcīnas devas (paplašināti dati). 1. tabula). Mēs veicām daudzciklu neitralizācijas testu, izmantojot iestatījumu, kurā vīruss un neitralizējošie serumi vienmēr bija klāt, atdarinot situāciju seropozitīvā indivīdā. Visi serumi vāji neitralizēti Omicron ar 11.{18}}reizi (diapazons: 4.{20}}līdz 81.2-reizei; P < 0,0001) zemāks pusmaksimālais neitralizējošais atšķaidījums (ND50) Omicron, salīdzinot ar WA1 (4.a, b att.). Faktiski aptuveni 80% paraugu pilnībā neitralizēja Omicron augstākajā pārbaudītajā koncentrācijā (paplašinātie dati 10. att.). Proti, Omi-S uzrādīja identiskas ND50 vērtības Omicron (11{34}}reizes zemākas nekā WA1; P < 0,0001) (4.a un b attēls), kas liecina, ka Omicron S proteīns, kad tas tika iekļauts WT. vīruss, darbojas tāpat kā Omicron.

4. att.|S loma Omicron imūnrezistencē. ND50 vērtības WA1, Omi-S un Omicron serumos no personām, kuras saņēmušas divus Moderna (1.–12. donori) vai Pfizer (13.–24. donori) vakcīnas injekcijas (sīkāka informācija par serumiem ir sniegta paplašinātajā sadaļā Datu 1. tabula; atsevišķas līknes ir parādītas paplašinātajos datos 1. attēlā 0). b, ND50 vērtību trajektorijas pret WA1, Omi-S un Omicron (dati no a ir attēloti diagrammā). Ir norādītas ND50 vērtību izmaiņas reizes (n=24 seruma paraugi). c–f, himērisko (pa kreisi; c, d) un mutantu (pa kreisi; e, f) vīrusu shēma. Aminoskābju numerācija WA1 mutantiem e ir balstīta uz WA1 S secību, savukārt Omicron mutantu numerācija f ir balstīta uz Omicron S secību. Tika pārbaudīti seši no 24 serumiem (3 no Moderna un 3 no Pfizer). Katrs seruma paraugs ir attēlots ar noteiktas krāsas punktu. Dati tiek attēloti kā vecāku vīrusa izmaiņas. Statistisko nozīmīgumu noteica, izmantojot divpusēju, nesapārotu t-testu ar Velča korekciju. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 un ****P < 0,0001; NS, nav būtiski.

SARS-CoV-2 S proteīns satur divus domēnus: S1 domēnu, kas mijiedarbojas ar ACE2 receptoru, un S2 domēnu, kas ir atbildīgs par membrānas saplūšanu32. S1 domēnā atrodas N-terminālais domēns (NTD) un receptoru saistošais domēns (RBD), kas satur receptoru saistošo motīvu (RBM), kas veido tiešu kontaktu ar ACE2 receptoru33. Omicron S NTD ir 11 aminoskābju izmaiņas, tostarp 6 delēcijas un viena 3-aminoskābes gara ievietošana, turpretim URB ir 15 mutācijas, no kurām 10 ir koncentrēta RBM (paplašinātā). Dati 1. att.). Gan NTD, gan RBD saimnieko neitralizējošie epitopi34–37, bet URB ir imūndominants un ir SARS-CoV-2 imūnserumos esošās neitralizējošās aktivitātes primārais mērķis37,38. Lai noteiktu, vai Omicron neitralizācijas rezistences fenotipu izraisa mutācijas noteiktā S proteīna domēnā, mēs izveidojām divas himēru vīrusu grupas. Pirmajā grupā bija WA1 vīruss, kas pārnēsāja Omicron NTD, RBD vai RBM (4.c att.), bet otro grupu veidoja Omi-S vīruss ar WA1 NTD, RBD vai RBM (4.d attēls). Neitralizācijas tests parādīja, ka mutācijas RBM bija galvenais Omicron rezistences pret vakcīnas izraisīto humorālo imunitāti cēlonis: WA1 RBM aizstāšana ar Omicron RBM samazināja ND50 par 54-kārtīgi (P < 0,0001), un otrādi, aizstājot Omi-S RBM ar WA1, ND50 palielinājās par 56- (P=0.0003) (4.c, d attēls). Fakts, ka neviens no RBM mijmaiņas vīrusiem nesasniedza aptuveni 11-kārtīgu atšķirību starp WA1 un Omi-S, liecina, ka mutācijas citās S daļās arī veicina vakcīnas rezistenci.

Lai noskaidrotu, vai specifiskas mutācijas Omicron RBM piedziņas vakcīnā izplūst, mēs izveidojām divus papildu rekombinanto vīrusu paneļus, vienu ar WA1S, kas satur Omicron RBM mutācijas, atsevišķi vai kombinācijā (4.e att.), bet otru ar Omicron S, kam trūkst to pašu. mutāciju kopums (4.f att.). Divi WA1 mutanti — 3. mutants (ar E484A aizstāšanu) un 4. mutants (ar piecu aizvietojumu kopu Q493R, G496S, Q498R, N501Y un Y505H) uzrādīja mērenu, bet statistiski nozīmīgu samazinājumu par 1.{15}}}( P=0.0002) un 1.8-reizes (P=0.0003) attiecīgi ND50 vērtībās, salīdzinot ar WA1 (4.e att.). Pretējais tika novērots, kad šīs mutācijas tika izņemtas no Omicron S; Omicron mutantam 3 (trūkst E484A aizstāšanas) un mutantam 4 (trūkst Q493R, G496S, Q498R, N501Y un Y505H) bija 19-reizes (P=0.0082) un 3.{38 }} reizes (P=0,0025) augstākas ND50 vērtības, salīdzinot ar Omicron (4. fig. att.). Tā kā neviens no mutantiem neuztvēra kopējo Omicron fenotipu, mēs pieņemam, ka vakcīnas aizbēgšana ir mutāciju kumulatīva ietekme, kas sadalīta visā S proteīna garumā. Iespējams, ka mutācijas maina Omicron S konformāciju tādā veidā, ka lielākā daļa imūndominējošo neitralizējo epitopu tiek izjaukti un kļūst nepieejami neitralizācijai.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Diskusija

Šis pētījums sniedz galveno ieskatu par vīrusu proteīniem, kas veicina SARS-CoV-2 patogenitāti. Mēs parādām, ka S, visvairāk mutētajam proteīnam Omicron, ir nepilnīga loma Omicron vājināšanā. Šūnu infekcijas testos Omi-S vīrusam ir vidēja replikācijas efektivitāte starp senču vīrusu un Omicron. Līdzīgi K18-hACE2 pelēm Omi-S kontrastē ar nenāvējošu Omicron un izraisa 80% mirstību; senču vīruss izraisa 100% mirstību šīm pelēm. Jo īpaši, kad mēs apvienojām S mutācijas ar mutācijām nsp6, vīrusam bija novājināts fenotips, kas lielā mērā atgādināja Omicron fenotipu, norādot, ka šie divi proteīni ir galvenie Omicron patogenitātes noteicēji. Turpmākajos pētījumos tiks atšifrēts mehānisms (-i), ar kuru nsp6 mutācijas ietekmē vīrusa replikāciju.

Viens no iespējamiem mūsu pētījuma ierobežojumiem ir K18-hACE2 peles izmantošana patoģenēzes pētījumos, nevis primātu modeļi, kuriem ir vairāk līdzību ar cilvēkiem39. Tomēr jāatzīmē, ka K18-hACE2 peles ir labi izveidots modelis SARS-CoV-24 letālā fenotipa izpētei,31. Lai gan šīm pelēm pēc SARS-CoV{10}} infekcijas attīstās plaušu patoloģija, mirstība ir saistīta ar centrālās nervu sistēmas iesaistīšanos vīrusu neiroinvāzijas un izplatīšanās dēļ31,40. Fakts, ka K18-hACE2 peļu inficēšanās ar Omi-S, bet ne ar Omicron, izraisa neiroloģiskas pazīmes (piemēram, izliektu stāju un reaģētspējas trūkumu), liecina, ka Omi-S saglabājas neiroinvāzijas īpašība, iespējams, pateicoties tā augstākajai replikācijas efektivitātei un ka šīs īpašības noteicošie faktori atrodas ārpus S proteīna. Šie atklājumi saskan ar iepriekšējo pētījumu, kas liecina, ka kāmji, kas inficēti ar Omi-S, izdala ievērojami vairāk vīrusa un zaudēja vairāk svara nekā tie, kas inficēti ar Omicron, kas liecina, ka mutācijas ārpus S veicina Omicron novājinātu patogenitāti41.

Mēs noskaidrojām, ka, lai gan senču vīruss galvenokārt replikējas plaušu alveolās un izraisa tikai retu bronhiolu infekciju K18-hACE2 pelēm, gan Omi-S, gan Omicron ir paaugstināta tieksme replicēties bronhu epitēlijā, norādot, ka S olbaltumvielas ir atbildīgas par izmainīto tropismu. Šī slēdža mehānisms nav zināms, taču iespējams, ka Omicron S ir efektīvāks par WT S, izmantojot katepsīnu B vai katepsīnu L (atsauce 25, 42, 43), kas veido aktīvu vīrusa iekļūšanas ceļu bronhiolos un citos elpceļos. šūnas41. Turpretim SARS-CoV-2 iekļūšanu alveolārajās epitēlija šūnās galvenokārt veicina TMPRSS2 (atsauce 28, 44), ko Omicron S neizmanto25, 45, kas izraisa sliktu šo šūnu inficēšanos4,5. ,25,43. Šie atklājumi var izskaidrot Omicron izraisīto novājināto plaušu patoloģiju.

cistanche ieguvumi - stiprina imūnsistēmu

Omicron nsp6 ir divas izmainītas vietas, salīdzinot ar prototipu SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1 izolātu: trīs aminoskābju dzēšana (LSG, 105.–107. pozīcija) un I189V aizstāšana (paplašināto datu att. . 9). Ir aprakstītas vairākas nsp6 funkcijas koronavīrusa replikācijā; galvenais no tiem ir dubultmembrānas pūslīšu (DMV) bioģenēze, kas ir vīrusa RNS sintēzes vieta46–50. Iepriekšējais pētījums parādīja, ka SARS-CoV-2 DMV galvenokārt rodas trīs vīrusu proteīnu saskaņotas darbības rezultātā: nsp3, nsp4 un nsp6; lai gan nsp3 un nsp4 ir pietiekami DMV veidošanai, nsp6 savieno šos DMV ar endoplazmatisko tīklu un novirza būtisko saziņu starp šīm struktūrām46. Nepieciešama turpmāka izmeklēšana, vai Omicron nsp6 mutāciju konstelācija ietekmē DMV veidošanos vai funkcijas. Nsp6 arī aktivizē NLR3-atkarīgo citokīnu veidošanos un piroptozi plaušās pacientiem ar COVID-19, kas kalpo kā galvenais virulences faktors47. Jāatzīmē, ka nsp6 variantam, kas ir saistīts ar asimptomātisku COVID-19, bija samazināta spēja izraisīt piroptozi47, izraisot pieņēmumus, ka Omicron nsp6 mutācijas var ietekmēt arī piroptozi. Būs nepieciešami detalizēti mehāniski pētījumi, lai izdalītu Omicron mutāciju ietekmi uz nsp6 funkcijām.

Pašlaik nav zināms, vai mutācijas S un nsp6 darbojas saskaņoti viena ar otru, lai veicinātu Omicron vājināšanos. Ņemot vērā, ka Omicron S uzrādīja lielāku noslieci uz bronhioliem, iespējams, ka S ir atbildīgs par izmainīto vīrusu tropismu, turpretim mutācijas bez smailēm, tostarp nsp6-, ir tikai pielāgošanās mainītajai audu videi. Ir vērts pieminēt, ka, lai gan šķiet, ka nsp6 ir galvenais Omicron vājināšanās proteīns, kas nav smaile, nevar pilnībā izslēgt citu vīrusu proteīnu ieguldījumu. In vitro eksperimenti, kuros tika pētīta bezsmailes mutāciju loma, tika veikti ar ACE2/TMPRSS2/Caco-2 šūnām. Izmantojot citus, imūnkompetentākus šūnu veidus, var atklāt arī citu mutāciju, kas nav radušās, ietekmi. Turklāt mūsu himēriskie vīrusi saturēja Omicron S, kas vienlaikus bija savienots ar vienu proteīnu bez smaile, kas ierobežoja liela attāluma epistātisko mijiedarbību starp mutācijām vairākos vīrusu proteīnos.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Mūsu pētījums rāda, ka Omicron S RBM mutācijas ir galvenie faktori, kas nosaka Omicron izkļūšanu no neitralizējošām antivielām, lai gan veicina arī mutācijas citos S reģionos. RBM ietvaros mēs identificējam divus mutāciju karstos punktus, kas nodrošina Omicron S spēju pretoties neitralizācijai: viens satur E484A aizstāšanu, bet otrs satur piecu aizvietojumu kopu - Q493R, G496S, Q498R, N501Y un Y505H. Ir pierādīts, ka E484A aizstāšana izvairās no neitralizācijas ar atveseļojošiem serumiem51. Turklāt strukturālā modelēšana liecina, ka dažas terapeitiskās monoklonālās antivielas izveido ļoti stabilus sāls tiltus ar E484 atlikumu, pilnībā zaudējot saistīšanos, ja šis atlikums tiek mainīts uz A vai pēc Q493K un Y505H izmaiņām52. Līdzīgi, RBM atlikumu kartēšana, kas tieši mijiedarbojas ar 49 zināmām neitralizējošām antivielām, atklāja N440, G446, S477 un T478 kā zemas frekvences mijiedarbības faktorus, N501, Y505 un Q498 kā vidējas frekvences mijiedarbības faktorus un E440 kā interakciju augstas frekvences un Q4933. , saskaņā ar mūsu neitralizācijas testa rezultātiem. Jo īpaši, lai gan Omicron S antivielu saistīšanās potenciāls ir traucēts54, tā receptoru saistīšanās spēja ir neskarta. Faktiski Omicron URB ir lielāka afinitāte pret ACE2, salīdzinot ar Uhaņas-Hū-1 un Delta URB25. Tas norāda, ka Omicron S mutācijas ir attīstījušās tādā veidā, ka tās kavē antivielu saistīšanos, bet saglabā receptoru iesaistīšanos. Tas paver iespēju mērķēt uz konservētiem un strukturāli ierobežotiem S reģioniem, kas ir iesaistīti ACE2 atpazīšanā, lai izstrādātu plaša spektra vakcīnas, lai kontrolētu COVID{36}} pandēmiju.

atsauces

1. Liu, L. et al. Pārsteidzoša antivielu izvairīšanās no SARS-CoV -2 Omicron varianta. Nature 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. et al. Ievērojama SARS-CoV-2 Omicron izbēgšana pret antivielu neitralizāciju. Nature 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. et al. SARS-CoV-2 Omicron varianta plazmas neitralizācija. N. Engl. J. Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. et al. SARS-CoV-2 novājināta replikācija un patogenitāte B.1.1.529 Omicron. Nature 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ et al. SARS-CoV-2 Omicron vīruss izraisa novājinātu slimību pelēm un kāmjiem. Nature 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA et al. Klīniskie rezultāti, kas saistīti ar SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variantu un BA.1/BA.1.1 vai BA.2 apakšvariantu infekciju Dienvidkalifornijā. Nat. Med. 28, 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. et al. SARS-CoV-2 omikrona varianta agrīns klīniskās smaguma novērtējums Dienvidāfrikā: datu sasaistes pētījums. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA SARS-CoV-2 Omikrona varianta smaguma aplēses Ontario, Kanādā. J. Am. Med. Asoc. 327, 1286–1288 (2022).

9. Uraki, R. et al. SARS-CoV-2 Omicron BA.4 un BA.5 izolātu raksturojums grauzējiem. Nature 612, 540–545 (2022).

10. Uraki, R. et al. SARS-CoV-2 Omicron BA raksturojums un pretvīrusu jutība.2. Nature 607, 119–127 (2022).

11. Dyer, O. Covid-19: Omicron izraisa vairāk infekciju, bet mazāk hospitalizāciju nekā Delta, Dienvidāfrikas dati liecina. Br. Med. J. 375, n3104 (2021).

12. Sigal, A. Vieglāka slimība ar Omicron: vai tas ir vīruss vai jau esoša imunitāte? Nat. Immunol. 22, 69–71 (2022).

13. KAS. SARS-CoV{2}} variantu izsekošana https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022).

14. Cele, S. et al. Omicron plaši, bet nepilnīgi izvairās no Pfizer BNT162b2 neitralizēšanas. Nature 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. et al. Iespējama SARS-CoV-2 omikrona varianta pārnešana karantīnas viesnīcā Honkongā, Ķīnā, 2021. gada novembris. Emerg. Inficējiet. Dis. 28, 460–462 (2022).

16. Iuliano, AD et al. Slimības smaguma pakāpes un veselības aprūpes izmantošanas tendences agrīnā Omikrona varianta periodā, salīdzinot ar iepriekšējiem SARS-CoV-2 augsta pārnešanas periodiem — Amerikas Savienotās Valstis, 2020. gada decembris–2022. gada janvāris. Morb. Mirstīgais. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. COVID datu izsekotājs https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Taylor, L. Covid-19: Omicron katru nedēļu sasniedz rekordaugstu globālo infekciju skaitu. Br. Med. J. 376, o66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 ļauj plaši izkļūt no neitralizējošām antivielu reakcijām. Cell 185, 467–484 (2022).

20. Suzuki, R. et al. SARS-CoV-2 Omikrona varianta novājināta fuzogenitāte un patogenitāte. Nature 603, 700–705 (2022).

21. Smits, DS et al. Ņujorkas notekūdeņos konstatēto noslēpumainu SARS-CoV-2 līniju izsekošana. Nat. Commun. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE et al. Piezīmes no lauka: agrīni pierādījumi par SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) variantu kopienas notekūdeņos — Amerikas Savienotās Valstis, 2021. gada novembris–decembris. Morb. Mirstīgais. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. et al. Bezpasāžas SARS-CoV-2 genoma klonēšana un mutaģenēze, izmantojot sarkano rekombināciju. Int. J. Mol. Sci. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Optimizēta cirkulāras polimerāzes pagarināšanas reakcijas metode SARS-CoV funkcionālai analīzei-2. Iepriekšēja drukāšana vietnē https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. et al. SARS-CoV izmainītais TMPRSS2 lietojums-2 Omikrons ietekmē tropismu un fuzogenitāti. Nature 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ et al. SARS-CoV-2 Omicron ir imūnsistēmas evakuācijas variants ar izmainītu šūnu iekļūšanas ceļu. Nat. Microbiol. 7, 1161–1179 (2022).

27. Martines, RB et al. Ar letālu koronavīrusa slimību saistītā SARS-CoV-2 patoloģija un patoģenēze, Amerikas Savienotās Valstis. Emerg. Inficējiet. Dis. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. et al. No pluripotentām cilmes šūnām iegūto cilvēka plaušu alveolāro 2. tipa šūnu SARS-CoV-2 infekcija izraisa ātru epitēlijam raksturīgu iekaisuma reakciju. Cell Stem Cell 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. et al. SARS-CoV-2 primārā cilvēka plaušu epitēlija infekcija COVID-19 modelēšanai un zāļu atklāšanai. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Spike protein-independent attenuation of SARS-CoV-2 Omicron variant in laboratory moce. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. et al. Letāla neirodiseminācija un SARS-CoV-2 tropisms K18-hACE2 pelēm ir tikai daļēji atkarīgs no hACE2 ekspresijas. Vīrusi 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW SARS CoV{1}} smaile proteīna strukturālās un funkcionālās īpašības: potenciāla pretvīrusu zāļu izstrāde COVID-19 . Acta Pharmacol. Grēks. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. et al. Ar ACE2 receptoru saistītā SARS-CoV-2 smaile receptoru saistošā domēna struktūra. Nature 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. et al. Cilvēka neitralizējošā antiviela saistās ar SARS-CoV-2 Spike proteīna N-gala domēnu. Science 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN et al. Izplatīta, aizsargājoša un konverģenta SARS-CoV-2 epitopu, kas nav RBD smaile, IgG atpazīšana. Science 372, 1108–1112 (2021).

36. Premkumar, L. et al. Vīrusa smailes proteīna receptoru saistošais domēns ir imūndominējošs un ļoti specifisks antivielu mērķis SARS-CoV-2 pacientiem. Sci. Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. et al. Cilvēku neitralizējošās antivielas, ko izraisījusi SARS-CoV-2 infekcija. Nature 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. et al. Neitralizējošo un imūndominējošo vietu kartēšana SARS-CoV-2 smaile receptorus saistošajā domēnā, izmantojot struktūras vadītu augstas izšķirtspējas seroloģiju. Cell 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Primātu modeļi, kas nav cilvēkveidīgie primāti SARS-CoV-2 pētījumiem: apsveriet alternatīvas makakiem. Lab Anim. 50, 113–114 (2021).

40. Kumari, P. et al. Neiroinvāzija un encefalīts pēc SARS CoV{1}} intranazālās inokulācijas K18-hACE2 pelēm. Vīrusi 13, 132 (2021).

41. Peacock, TP et al. SARS-CoV-2 Omikrona varianta izmainītais ievades ceļš un antigēnais attālums kartē, lai atdalītu smailes proteīna domēnus. Iepriekšēja drukāšana vietnē https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Modelēšana, kā SARS-CoV-2 Omicron varianta mainītais šūnu iekļūšanas ceļu lietojums var ietekmēt TMPRSS2 un katepsīna B/L inhibitoru efektivitāti un sinerģiju. Iepriekšēja drukāšana vietnē https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY et al. SARS-CoV-2 Omikrona varianta replikācija cilvēka bronhos un plaušās ex vivo. Nature 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. et al. SARS-CoV-2 iekļūšanas, iekaisuma un jaunu terapeitisko līdzekļu novērtējums cilvēka plaušu audu šūnās. PLoS Patogs. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. et al. SARS-CoV-2 Omicron variantam ir mazāk efektīva replikācijas un saplūšanas aktivitāte, salīdzinot ar Delta variantu TMPRSS2-izpaustās šūnās. Emerg. Mikrobi inficē. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. et al. NSP6 loma SARS-CoV-2 replikācijas organellu bioģenēzē. Nature 606, 761–768 (2022).

47. Sun, X. et al. SARS-CoV-2 nestrukturālais proteīns 6 izraisa NLRP3-atkarīgu piroptozi, mērķējot uz ATP6AP1. Šūnu nāves atšķirība. 29, 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Coronavirus NSP6 ierobežo autofagosomu paplašināšanos. Autofagija, 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. et al. SARS-CoV-2 evolūcijas analīze: kā nestrukturālā proteīna 6 (NSP6) mutācija var ietekmēt vīrusu autofagiju. J. Inficēt. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC Mouse hepatīta vīrusa RNS replikācija notiek dubultās membrānas pūslīšos. J. Virol 76, 3697–3708 (2002).

51. Liu, Z. et al. SARS-CoV-2 smailes mutāciju identificēšana, kas vājina monoklonālo un seruma antivielu neitralizāciju. Cell Host Microbe 29, 477–488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: stipri mutēts SARS-CoV-2 variants uzrāda spēcīgāku saistīšanos ar ACE2 un spēcīgi izvairās no apstiprinātām COVID-19 terapeitiskajām antivielām. Priekšpuse. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. Cryo-EM structure of a SARS-CoV-2 omicron spike protein ectodomen. Nat. Commun. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM et al. Atveseļošanās un vakcīnas seruma aktivitāte pret SARS-CoV-2 Omicron. Nature 602, 682–688 (2022).