Strukturāli atšķirīgi Tau agregātu polimorfi, kas atklāti ar nanomēroga infrasarkano staru spektroskopiju

Abstrakts

Tau proteīna agregācijai ir galvenā loma vairākās neirodeģeneratīvās slimībās, ko kopīgi sauc par tauopātijām, tostarp Alcheimera un Parkinsona slimībām. Tau nepareizi salocās fibrilārās beta loksnes struktūrās, kas veido sapārotos spirālveida pavedienus, kas atrodami neirofibrilārajos mudžekļos. Ir zināms, ka tau agregātos var būt nozīmīgas strukturālas neviendabības, kas saistītas ar dažādām slimībām.

Tomēr, lai gan ir pētītas nobriedušu fibrilu struktūras, strukturālais sadalījums agrīnās stadijas tau agregātos nav labi saprotams. Šajā pētījumā mēs izmantojam AFM-IR, lai izpētītu atsevišķu tau fibrilu nanomēroga spektrus dažādos agregācijas posmos un parādītu vairāku fibrilāru polimorfu klātbūtni, kuriem ir dažādas sekundārās struktūras. Mēs arī parādām, ka nobriedušas fibrillas satur ievērojamu daudzumu antiparalēlu beta loksnes. Mūsu rezultāti ir pirmais nanomēroga infrasarkanās spektroskopijas pielietojums tau agregātiem un uzsver telpiski izšķirtas infrasarkanās spektroskopijas solījumu proteīnu agregācijas izpētei.

Alcheimera slimība ir neirodeģeneratīva slimība ar augstu sastopamības biežumu, un tās galvenās patoloģiskās pazīmes ir smags neironu un sinapses zudums un -amiloīda (-amiloīda) un Tau proteīna (ar mikrotubuliem saistīts proteīns) uzkrāšanās smadzenēs. Šīs olbaltumvielas veido nobriedušas fibrilu struktūras slimības progresēšanas laikā, un šīs struktūras proteīna šķiedras var izraisīt neironu nāvi un izziņas pasliktināšanos. Nobriedušām fibrilām ir daudz nopietnāka loma slimības veidošanā nekā -amiloīda un Tau proteīniem. Tas ir tāpēc, ka nobriedušu fibrilu veidošanās ir patogēnā mehānisma galapunkts, kas vēl vairāk pastiprina neironu un sinapses zudumu slimības progresēšanas laikā un paātrina slimības progresēšanu. Tāpēc Alcheimera slimības ārstēšanas izpētei un attīstībai nobriedušu fibrilu izpēte un izpēte ir kļuvusi arī par pētniecības karsto punktu. Mūsu pētījumā mēs atklājām, ka Cistanche ir efektīvs Alcheimera slimības ārstēšanā. Cistanche satur lielu daudzumu antocianīnu un flavonoīdu, kuriem ir spēcīga antioksidanta iedarbība. Šīs sastāvdaļas var palīdzēt samazināt brīvo radikāļu veidošanos un aizsargāt smadzeņu šūnas no oksidatīviem bojājumiem, tādējādi samazinot neirodeģenerācijas iespējamību.

Noklikšķiniet uz cistanche deserticola papildinājuma

Atslēgvārdi

Tau; apkopošana; Alcheimera slimība; AFM-IR; nanomēroga IR spektroskopija; AFM; fibrilu struktūra; antiparalēlas beta lapas.

Tau proteīnu nepareiza locīšana un agregācija fibrilāros agregātos ir daudzu neirodeģeneratīvu slimību, ko sauc par tauopātijām, patoloģiska pazīme, tostarp Alcheimera un Parkinsona slimībai1-5. Tau ir ar mikrotubuliem (MT) saistīts proteīns, kas nepareizi salocās nešķīstošās šūnu nogulsnēs, ko sauc par neirofibrilāriem samezglojumiem (NFT)1-2, 5-6.

Lai gan agrīnie pierādījumi norādīja uz iespējamo NFT neirotoksicitāti, tagad tiek uzskatīts, ka prefibrilāri oligomēri ir galvenās neirotoksiskās sugas3, 5-6. Specifisku tau fibrilizācijas ceļu noskaidrošana var sniegt ieskatu slimības mehānismos un atklāt iespējamos terapeitiskos mērķus zāļu atklāšanai. Ir ieguldītas ievērojamas pūles, lai izprastu tau agregāciju un dažādu faktoru lomu, kas modulē agregāciju1-2, 7-18. Ir pētīta arī citu amiloido proteīnu, piemēram, beta amiloīda, loma tau konformācijas izmaiņās19-21. Ir zināms, ka tau pavedieniem NFT ir krusteniskā beta struktūra, kas ir līdzīga amiloīda plāksnēm. Tomēr joprojām ir izaicinājums visaptveroši izskaidrot tau strukturālo attīstību, kas izraisa fibrilu veidošanos.

Cilvēka smadzenēs ir identificētas sešas dažādas tau izoformas, kas atšķiras attiecībā uz aminoskābju atlikumu skaitu2, 5, 22. Dominējošā izoforma un fibrilārā struktūra var atšķirties atkarībā no slimības2, 22. Visas tau izoformas ir lieli polipeptīdi, un tāpēc tām ir strukturālas struktūras. elastība. Tāpēc liela daļa pētījumu ir pievērsta īsiem peptīdiem, kas pārstāv mikrotubulus saistošos domēnus, kas ir būtiski tau agregācijai23-25, nevis pilna garuma proteīniem. Turklāt tau un tā izoformām piemīt polimorfisms: būtībā viens un tas pats peptīds agregējas dažādās fibrilārās struktūrās, kas atšķiras ne tikai pēc morfoloģijas, bet arī pēc molekulārās izkārtojuma8-9, 26-27. Visi iepriekš minētie faktori padara specifisku tau agregātu izolēšanu un strukturālo analīzi, kas veidojas dažādos agregācijas posmos, sarežģītu uzdevumu. Amiloīda agregācijas būtība kopumā ir tāda, ka tā rada pārpilnību agregētu sugu, kas ir pārejošas un ir līdzsvarā viena ar otru. Nesen krio-EM ir veiksmīgi izmantots tau fibrilāro struktūru risināšanai; tomēr tā pielietojums joprojām ir ierobežots ar būtībā nobriedušām fibrilām, kas ir agregācijas beigu punkts, nevis starpproduktiem9-10.

Jo īpaši nav labi saprotami agrīnās stadijas tau starpproduktu strukturālie aspekti. Zelta standarts amiloīda tipa agregātu sekundārās struktūras noteikšanai kopumā ir spektroskopiskās metodes, piemēram, cietvielu kodolmagnētiskā rezonanse (ssNMR) un Furjē transformācijas infrasarkanā spektroskopija (FTIR)15, 28-31. Tomēr neviens no šiem paņēmieniem nespēj nodrošināt telpisko izšķirtspēju atsevišķu agregātu mērogā, un bez telpiskās izšķirtspējas ir grūti viennozīmīgi attiecināt spektrālās pazīmes konkrētiem agregātiem vai morfoloģijām vai noteikt, kuras pārejošas sugas pārvēršas par konkrētu morfoloģiju. Būtībā nav iespējams noteikt, vai novērotās spektrālās pazīmes rodas no noteikta agregācijas stāvokļa vai dažādu konformāciju statistiskā sajaukuma.

Rezultātā ir zināmas tikai vidējās oligomēru un fibrilu struktūras, un strukturālo variāciju neviendabīgums katrā stāvoklī, ja tāds ir, nav labi saprotams. Lai uzlabotu mūsu zināšanas par tau un citu amiloidogēno proteīnu agregāciju dažādos apstākļos, ir obligāti jāsaprot katra konformācijas ansambļa locekļa struktūra dažādos agregācijas posmos. Pēdējo desmit gadu laikā ir izstrādātas jaunas pieejas vibrācijas spektroskopijas telpiskās izšķirtspējas uzlabošanai, kas apvieno infrasarkano staru spektroskopiju ar AFM, lai sasniegtu nanometru mēroga izšķirtspēju.

Viena no jaunākajām uz AFM balstītajām pieejām izmanto fototermiskās inducētās rezonanses (PTIR) priekšrocības, kur lokālo termisko izplešanos, kas rodas no parauga infrasarkanās absorbcijas, uztver AFM gals 32-35. Tādējādi fototermiskā AFM-IR apiet izšķirtspējas ierobežojumus parastajā IR mikroskopijā, izmantojot AFM zondes galu, lai izmērītu infrasarkano staru absorbciju. Starojuma absorbcija ar infrasarkanā režīma rezonanses ierosmi izraisa parauga termisko izplešanos, radot impulsīvu spēku uz AFM konsoli. Rezultātā iegūtā AFM zondes reakcija ir proporcionāla infrasarkanajai absorbcijai, un, skenējot viļņa garumu, tiek iegūts infrasarkanās absorbcijas spektrs, kas atbilst parauga nanomēroga reģionam (1. attēls).

Tādējādi, atšķirībā no parastajām optiskajām metodēm, AFM-IR var pārbaudīt nanomēroga struktūras ar nepieredzētu ķīmisko detalizāciju un apvieno labāko no abām pasaulēm: AFM telpisko izšķirtspēju un infrasarkano staru ķīmisko izšķirtspēju. Lai gan AFM-IR ir izmantots, lai pētītu amiloidogēno peptīdu agregātus, piemēram, beta-amiloīdu un alfa sinukleīnu 35-38, tas nekad nav izmantots tau agregācijas pētīšanai. Šajā pētījumā mēs izmantojam AFM-IR iespējas un pētām tau-441 izomēra fibrillas dažādos agregācijas posmos, lai parādītu, ka agrīnās agregācijas stadijās fibrilārā struktūra ir ievērojama neviendabība pat bez būtiskām izmaiņām. morfoloģijā. Mūsu rezultāti pirmo reizi parāda, ka fibrilu sekundārajā struktūrā var būt atšķirības, kurām ir tāda pati morfoloģija. Tiek novēroti vairāki strukturāli atšķirīgi fibrilu polimorfi; viens strukturāli sakārtotāks nekā pārējās, kas arī ir pārejošs un nav atrodams nobriedušajās fibrilās. Turklāt mēs arī parādām, ka tau fibrils var saturēt pretparalēlas beta loksnes, kas parasti nav saistītas ar fibrilārām morfoloģijām.

Lai izprastu fibrilu strukturālo attīstību laika gaitā, mēs pētījām fibrilus dažādos agregācijas laika punktos, proti, pēc 3, 5, 10 un 15 agregācijas dienām. Katram mērījumam alikvotas tika uzklātas uz zelta substrātiem un žāvētas slāpeklī. Tau fibrilu AFM topogrāfiskie attēli pēc 3 dienu inkubācijas 37 grādu temperatūrā ir parādīti 2. attēlā. 2.A attēlā parādīts reprezentatīvs fibrilu kopums. Vairāk atsevišķu fibrilu AFM attēlu visos dažādos agregācijas posmos ir parādīti S1-S5 attēlā. Lai iegūtu kopējo fibrilu augstuma sadalījumu paraugā, tika izmērītas atsevišķu fibrilu augstuma vērtības un attēlotas kā histogramma (2.B attēls). Dati tika aprīkoti ar Gausa metodi, lai noteiktu vidējo augstuma vērtību 6,3±0,7 nm. 5-dienas fibrilu AFM attēli un atbilstošā augstuma analīze ir parādīti 2. C-D attēlā. Tiek novērotas atsevišķas fibrilus kopā ar fibrilu kopām. Fibrilu augstums ir 6,5±0,9 nm, kas saglabājas tuvu 3-dienas fibrilu parauga augstumam.

Pēc tam tika pārbaudītas tau fibrillas ar {{0}}dienu inkubāciju (2. E-F attēls). Uz zelta virsmas tika novērotas atsevišķas fibrillas (2.E attēls). Vidējais 10-dienas fibrilu augstums ir 7,2±1,0 nm. Nobriedušas tau fibrillas, kas izveidotas pēc 15 dienu agregācijas, ir parādītas 2.G attēlā. 15-Dienas šķiedras ir garas un savītas viena ar otru, radot tīklam līdzīgu morfoloģiju. Šajā agregācijas stadijā atsevišķas fibrillas vairs nav redzamas. Vidējais fibrilu augstums ir 42, 5 ± 40, 5 nm (2H attēls), kas ir ievērojami augstāks salīdzinājumā ar citām fibrilām, kuras tika radītas agrākos laika punktos. Plašais fibrilu augstuma sadalījums norāda, ka nobriedušām fibrilām ir dažādas augstuma vērtības, atšķirībā no agrāko fibrilu šaura sadalījuma. Šeit novērotās fibrilārās struktūras atbilst iepriekšējiem AFM ziņojumiem par tau agregāciju11, 39-40. Vēl viens svarīgs novērojums no AFM mērījumiem ir tāds, ka šķīdumā radītās tau fibrila morfoloģija ir viendabīga.

Tie ir taisni, bez jebkāda veida sazarojuma vai savītas formas, ar minimālām augstuma izmaiņām vienas fibrilas ietvaros. Ar fibrilu nobriešanu mēs redzam fibrilu augstuma pieaugumu, bet jaunas morfoloģijas neveidojas. To var vizualizēt S5 attēlā, kur 3-dienas un 10-dienas fibrilu morfoloģijas ir parādītas varavīksnes krāsu kartē, parādot, ka tām ir minimālas augstuma izmaiņas vienā fibrilā. Lai gan fibrilām nav būtisku morfoloģisku atšķirību, fibrilu nanomēroga IR spektros ir būtiskas atšķirības.

Konkrēti, 3-dienas fibrilām mēs novērojam trīs dažādus fibrilu polimorfus ar atšķirīgiem spektriem. 5-dienu, 10-dienu un 15-dienu nobriedušām fibrilām mēs novērojam tikai vienu konformāciju. Mēs atzīmējam, ka parasti polimorfisms tiek izmantots, lai apzīmētu morfoloģiski atšķirīgas fibrillas, kas var atšķirties arī attiecībā uz molekulāro struktūru2, 26; mūsu gadījumā morfoloģija ir nemainīga, bet fibrillas var iedalīt trīs atšķirīgos apakštipos, pamatojoties uz to spektriem. Skaidrības labad pārējā šī raksta daļā mēs šīs struktūras/polimorfus attiecīgi dēvējam par 1., 2. un 3. tipu. Reprezentatīvie infrasarkanie spektri amīda-I diapazonā ir parādīti 3. attēlā. Spektri ir vairāku mērījumu vidējais lielums visā fibrilu garumā. Vairāk spektru ir sniegts papildinformācijā (S6. attēls). 3-Dienas fibrilu tipa-1 spektrs satur ievērojamu maksimumu pie ~1628cm−1 un mazāku plecu pie ~1670cm−1.

Turklāt pie ~1740 cm-1 var redzēt vāju joslu. Fibrilu tipa -2 spektrs ir ievērojami atšķirīgs un satur paplašinātu asimetrisku amīda-I joslu, kuras centrs ir ~1650 cm-1. Būtiska intensitāte nav novērota virs 1700cm−1. Fibrilu tipam-3 mēs novērojam amīda-I spektru, kas ir ļoti līdzīgs tipam-2, ar vienu būtisku izņēmumu: pamanāma josla pie ~1738 cm-1. Interesanti atzīmēt, ka fibrilu spektri, izņemot -1 tipa polimorfu, nesatur asu maksimumu pie tipiskām beta loksnes frekvencēm ~ 1630 cm-1, lai gan ir zināms, ka fibrilārie agregāti ir reģistrēti paralēli beta. loksnes. Plašāks līnijas platums, kas novērots 2. un 3. tipa fibrilām, papildus asa pīķa trūkumam beta loksnes frekvencēs liecinātu par strukturālu traucējumu klātbūtni.

Interesanti, ka mēs neatradām nekādas būtiskas atšķirības spektros gar vienu fibrilu (S5 attēls), kas norāda, ka fibrillas ir labi noteiktas struktūras un tām ir raksturīgi strukturāli traucējumi. Šajā kontekstā jāatzīmē, ka spektros ir atšķirības gar fibrilām, jo ​​īpaši -3 tipa fibrilām, par ko liecina lielāka spektrālā standarta novirze (3. attēls). Tomēr galvenā atšķirība starp trim fibrilu apakštipiem ir joslu intensitāte 1628 cm-1 un 1738 cm-1. Iepriekš minētās variācijas neietekmē fibrilu klasifikāciju vienā vai otrā apakštipā.

5-dienas, 10-dienas un 15-dienas nobriedušajām fibrilām nav nekādas spektrālās neviendabības, un katrā gadījumā tiek novērots viens polimorfs (3. attēls). 5-Dienas fibrilu spektrs ir nedaudz nobīdīts (~ 6 cm-1) uz lielākiem viļņu numuriem, salīdzinot ar 2. un 3. tipa fibrilām, un tam ir arī palielināts līnijas platums. 10-dienā un 15-dienā nobriedušajām šķiedrām ir spektri, kas ir līdzīgi 2. tipa šķiedru spektriem, un pēdējie ir novirzīti uz augstākiem viļņu numuriem par ~ 4 cm-1. Visām 5-dienām, 10-dienām un 15-dienām fibrilām trūkst izteikta maksimuma virs 1700 cm-1.

Galvenais ieskats no fibrilu spektriem ir tāds, ka agrīnās nobriešanas stadijās fibrilu struktūrā var būt ievērojama neviendabība, un pēc nobriešanas fibrillas attīstās vienā struktūrā. Tomēr ir grūti precīzi saprast precīzas pamatā esošās strukturālās izmaiņas, pārbaudot tikai spektrus. Tāpēc, lai iegūtu papildu ieskatu spektrālajās un strukturālajās variācijās starp novērotajiem polimorfiem, spektri tika atdalīti, izmantojot spektrālo pielāgošanu. Olbaltumvielu amīda I spektri parasti satur dažādu sekundāro struktūru ieguldījumu41-42.

Tā kā sekundārā struktūra, kas veicina katru no novērotajiem spektriem, nav precīzi zināma a priori, mēs pievērsāmies otrajam atvasinātajam spektram, lai noteiktu pīķu skaitu (S8 attēls). Spektroskopijā labi zināma prakse ir spektrālo datu otrā atvasinājuma izmantošana, lai noteiktu pamatā esošās virsotnes. Mēs izmantojām pīķu skaitu otrajā atvasinātajā spektrā un to atbilstošās frekvences kā sākumpunktu spektrālajai pielāgošanai. 3-dienas, 5-dienas, 10-dienas un 15-dienas nobriedušu fibrilu vidējo spektru atbilstības rezultāti ir parādīti 4.A-F attēlā. Aprīkoto pīķu procentuālais ieguldījums kopējos spektros ir parādīts 4G-L attēlā. Spektri tiek normalizēti līdz maksimālajai intensitātei, bet tas vienādi mērogo katru apakšjoslu noteiktam spektram. Tādējādi joslu relatīvās populācijas, kā parādīts 4G-L attēlā, normalizācija neietekmē. Piemērošanas parametri ir norādīti 1. atbalsta tabulā.

Tipa-1 3-dienas fibrilām trīs Gausa joslas ar augstu precizitāti atbilst abiem spektriem ar centrālajām frekvencēm 1628cm−1, 1659cm−1 un 1670cm−1. Tipa -2 3-dienas fibrilu spektrs atbilst piecām pamata joslām ar frekvencēm 1626 cm-1, 1642 cm-1, 1662 cm-1, 1680 cm-1 un 1694 cm-1. Kā paredzams pēc spektrālās līdzības, tipa -3 fibrila iekļaujas tajās pašās piecās joslās, taču tai ir nepieciešama arī papildu virsotne pie 1736 cm-1. Paplašinot spektrālās dekonvolūcijas analīzi uz nobriedušākām fibrilām, mēs redzam, ka 5-dienas, 10-dienas un 15-dienas fibrillās būtībā ir vienāds sekundāro struktūru sadalījums. Visiem 5-dienas, 10-dienas un 15-dienas fibrilu spektriem optimālai pielāgošanai ir nepieciešamas sešas joslas, kur augstā viļņu skaita maksimums nobīdās uz ~1725cm−1, bet pārējās piecas virsotnes ir līdzīgas tipa-2 fibrilām.

1626-1628cm−1 maksimumu visās atbilstībās var attiecināt uz beta loksnēm, kas norāda, ka visi fibrilārie polimorfi satur beta loksnes struktūru28, 30, 41-42. 1642 cm-1 maksimums parasti rodas no nejaušām spolēm, savukārt virsotnes pie ~1660 cm−1 un 1682 cm−1 parasti tiek piešķirtas beta pagriezieniem 41-42. Kopumā spektrālā dekonvolūcija norāda, ka pēc nogatavināšanas fibrilu struktūrā ir vairāk traucējumu, par ko liecina nejaušās spoles pīķa pieaugums attiecībā pret beta loksnes maksimumu. Beta pagriezienu klātbūtne un to relatīvais pieaugums, par ko liecina 1660 cm-1 piestiprinātā pīķa intensitāte, atbilst paredzamajai fibrilu krusteniskajai beta struktūrai. Tomēr joslu klātbūtne pie ~ 1694cm−1 un ~ 1725cm−1 ir nedaudz negaidīta. Pirmo parasti attiecina uz antiparalēlām beta loksnēm41-42, 45, un tas ir novērots beta amiloīda45-46 un alfa-sinukleīna oligomēros38. Lai gan antiparalēlas beta loksnes struktūras ir zināmas ar oligomēru amiloīda mezgliem, to esamība fibrilās ir novērota reti. 2D IR pētījumi ir identificējuši pretparalēlus beta loksnes parakstus sinukleīna fibrilās47; specifiskiem beta-amiloīda mutantiem ir arī pretparalēla beta loksnes struktūra47. Mūsu rezultāti, cik mums ir zināms, ir pirmais antiparalēlo beta lapu novērojums tau agregātiem. Antiparalēlā beta loksnes pīķa -1 tipa polimorfā acīmredzami nav. Tas liecina, ka fibrillām var būt vai nu stingra, labi sakārtota struktūra (polimorfa tips-1), kas galvenokārt ir paralēlas beta loksnes, bet palielināta struktūras elastība un/vai traucējumi var izraisīt antiparalēlu beta loksņu veidošanos.

Tomēr ir svarīgi atzīmēt, ka ~ 1626 cm-1 maksimums parasti būtiski nemainās starp paralēlām un antiparalēlām beta loksnēm. Tāpēc mūsu rezultāti neizslēdz iespēju izveidot paralēlas beta loksnes nevienā no fibrilām, kur tiek novērots ~ 1694 cm-1 maksimums. Maksimumu pie ~ 1725 cm-1 nevar saistīt ar amīda mugurkaula vibrāciju, un tas, visticamāk, rodas no sānu ķēdes karbonskābju COOH posma 41-42. Nesenais Pinto un kolēģu darbs ir parādījis stratēģijas asparagīnskābes COOH grupas karboniljoslas IR spektra aprēķināšanai, izmantojot hibrīda kvantu / klasiskās skaitļošanas metodes48. Viņu atklājumi ir parādījuši, ka protonētā sānu ķēde parādās apgabalā 1700-1780 cm-1 un frekvences nobīdi 5-10 cm-1 var izmantot kā zondi mijiedarbībai starp sānu ķēdi un mugurkauls. Tau 441 peptīdu secībā ir vairākas karbonskābes, tostarp mikrotubulus saistošajos atkārtotajos domēnos, kam ir augsta tieksme veidot beta loksnes5-6.

Citu amiloīda agregātu AFM-IR mērījumi ir identificējuši līdzīgus maksimumus36, kas ir attiecināti uz karbonskābēm. Tomēr šī karbonskābes josla dažās fibrilās ir pamanāmāka nekā citās: tās ieguldījums kopējā maksimumā ir visnozīmīgākais tikai -3 3-dienas fibrilu un 5-dienas fibrilu veidam, kā redzams 4. attēls. Infrasarkanajā spektroskopijā dipolārā izlīdzināšana sakārtotās struktūrās bieži izraisa palielinātu absorbcijas joslu intensitāti; atbilstošs piemērs ir sakārtotu beta lokšņu veidošanās no nesakārtotiem peptīdiem, kas rada asas intensīvas joslas pie ~ 1625 cm−1. Tādējādi intensīvu karbonskābes joslu klātbūtne, iespējams, izriet no glutamīnskābes un asparagīnskābes sānu ķēžu strukturālās sakārtošanas. Tomēr tau-446 ir vairākas karboksilāta sānu ķēdes, un to īpašās molekulārās mijiedarbības un orientācijas šeit novērotajām struktūrām nav precīzi zināmas.

Turklāt intensitāte AFM-IR spektros ir proporcionāla FTIR32-33, bet karbonskābes vibrācijām nav ziņots par skaitlisko korelācijas koeficientu starp AFM-IR un FTIR. Tādējādi, lai korelētu maksimālo intensitāti ar konkrētām karbonskābes sānu ķēdēm, būtu nepieciešami teorētiski AFM-IR reakcijas aprēķini/apsvērumi, kas neietilpst šī darba ietvaros. Šajā kontekstā ir arī svarīgi atzīmēt, ka AFM-IR mērījumi atšķiras no izotropiskajiem infrasarkanajiem spektriem, kas iegūti šķīdumā, un AFM-IR mērītie spektri ir lāzera polarizācijas un apgaismojuma konfigurācijas konvolūcija 49-50. Tāpēc ir grūti precīzi noteikt šī pīķa strukturālos pamatus, un ir nepieciešams vairāk pētījumu, lai noteiktu to precīzu izcelsmi. Mūsu mērķis ir to risināt turpmākajā darbā.

Tau izomēru agregācija in vitro ir detalizēti pētīta; tomēr agrīno un/vai pārejošo starpproduktu struktūra nav ļoti labi zināma. Ir konstatēts, ka amiloido proteīnu agregācijas oligomēru sugas atrodas fibrilu veidošanās ceļā vai ir ārpus tās. Tā kā tiek uzskatīts, ka fibrillas ir agregācijas beigu punkts, fibrilu struktūras, tostarp dažādi to polimorfi, parasti netiek uzskatītas par pārejošām vai ārpus ceļa. Ir zināms, ka pastāv neviendabīgums fibrilārā struktūrā, taču ir zināms, ka tā izpaužas vienlaikus ar morfoloģiskām variācijām2, 8, 26, 51. Mūsu rezultāti ir unikāli, jo tie norāda uz fibrilu sekundārās struktūras variācijām pat tad, ja nav jūtamu morfoloģisku atšķirību. . Mēs atzīmējam, ka, izņemot fibrilu tipu-1, visos fibrilārajos spektros ir viena un tā pati pamatā esošo joslu kopa, kas norāda, ka -1 tipa fibrila ir pārejošs starpprodukts, kas galu galā tiek pakļauts strukturālai reorganizācijai līdz ar nobriešanu. Vēl viena iespēja ir tāda, ka šie sakārtotie paralēlie beta loksnes polimorfi ir “ārpusceļa” struktūra, tai ir jāsadalās monomēros vai prefibrilāros agregātos, lai tos atkal integrētu “ceļa” fibrilās. Mēs neatradām nekādu būtisku nefibrilāru nogulumu klātbūtni pētītajos paraugos; tomēr klātesošajiem bija spektrs, kas vairāk līdzinās nesakārtotajām fibrilām (S9. attēls). Tas atbilst ārpusceļa hipotēzei un tādējādi liek domāt, ka citus novērotos 3-dienu polimorfus var uzskatīt par ceļa agregātiem.

Tomēr jāatzīmē, ka šeit norādītie fibrilu spektri ne vienmēr aptver visu konformācijas ansambli, kas dominē tau agregācijas laikā. Lai precīzi noskaidrotu agrīnās stadijas agregātu strukturālo attīstību nobriedušās fibrilās, ir nepieciešama detalizētāka agregācijas kinētikas analīze, kuru mēs cenšamies risināt nākotnē. Otrs intriģējošs novērojums, ko nodrošina AFM-IR, ir antiparalēlo beta lokšņu identificēšana nobriedušajās fibrilās. Parasti tiek uzskatīts, un tas ir pierādīts daudzos pētījumos, ka agrīnās stadijas amiloīda agregāti var saturēt antiparalēlu struktūru, kas nobriedušos agregātos tiek pārveidota par paralēlu beta loksnes sekbeta lokšņu struktūru. Mēs novērojam pretēju tendenci: agrīnās stadijas agregātos var būt sakārtotas paralēlas beta loksnes, savukārt nobriedušākās fibrilās ir antiparalēlas beta loksnes beta loksnes, par ko liecina attiecīgā pīķa relatīvās populācijas (4G-L attēli).

Rezumējot, mēs esam parādījuši, izmantojot nanomēroga AFM-IR spektroskopiju, ka tau fibrilām var būt nozīmīgas strukturālas izmaiņas, īpaši agregācijas sākumposmā. Neviendabīgums izpaužas strukturāli atšķirīgu polimorfu veidā, kuriem ir līdzīga morfoloģija, bet atšķirīga sekundārā struktūra. Konkrēti, mēs identificējam pārejošu sakārtotu paralēlu beta-šebeta loksni agrīnās stadijas fibrilās, kas pēc nogatavināšanas pārvēršas nesakārtotākā fibrilu struktūrā, kas satur pretparalēlas beta loksnes. Šie rezultāti uzsver nepieciešamību savienot spektroskopiju ar telpiski izšķirtu tehniku, piemēram, AFM, jo nav iespējams viennozīmīgi veikt šo noteikšanu, izmantojot telpiski vidējās metodes, piemēram, FTIR. Šajā pētījumā aprakstītie eksperimentālie rezultāti liecina, ka tau fibrilārie agregāti ir neviendabīgi, un turpmākajā darbā tiks noskaidrots, vai šie polimorfi saglabājas dažādos agregācijas apstākļos un sēklu agregācijā no smadzeņu lizātiem, lai izprastu to nozīmi dažādu tauopātiju kontekstā.

Papildu materiāls

Papildu materiālu skatiet PubMed Central tīmekļa versijā.

PATEICĪBA

Šo darbu atbalstīja Nacionālie veselības institūti (Award 1 R35 GM138162 to AG).

ATSAUCES

1. Šimičs G; Babić Leko M; Wray S; Haringtons C; Delalle I; Jovanovs-Miloševičs N; Bažadona D; Buée L; de Silva R; Di Džovanni G; Wischik C; Hof PR Tau proteīna hiperfosforilācija un agregācija Alcheimera slimībā un citās tauopātijās un iespējamās neiroprotektīvās stratēģijas. Biomolecules 2016, 6 (1), 6-6. [PubMed: 26751493]

2. Li D; Liu C Amiloīda polimorfu hierarhiskā ķīmiskā noteikšana neirodeģeneratīvās slimībās. Nature Chemical Biology 2021, 17 (3), 237–245. [PubMed: 33432239]

3. Kametani F; Hasegawa M Amiloīda hipotēzes un Tau hipotēzes pārskatīšana Alcheimera slimībā. Frontiers in Neuroscience 2018, 12 (25).

4. Iadanza MG; Džeksons MP; Hjūits EW; Ransons NA; Radford SE Jauna ēra amiloīda struktūru un slimību izpratnei. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2018, 19 (12), 755–773. [PubMed: 30237470]

5. Ballatore C; Lī VMY; Trojanowski JQ Tau mediēta neirodeģenerācija Alcheimera slimības un ar to saistīto traucējumu gadījumā. Nature Reviews Neuroscience 2007, 8 (9), 663–672. [Pubmed: 17684513]

6. Kolarova M; Garc; #00ED; a-Sierra F; Bartos A; Ricny ​​J; Ripova D Tau proteīna struktūra un patoloģija Alcheimera slimībā. Starptautiskais Alcheimera slimības žurnāls 2012, 2012, 13.

7. Tapiola T; Alafuzofs I; Herukka SK; Parkkinen L; Hartikainens P; Soininen H; Pirttilä T cerebrospinālais šķidrums – amiloīds 42 un Tau proteīni kā Alcheimera tipa patoloģisku izmaiņu smadzenēs biomarķieri. JAMA Neurology 2009, 66 (3), 382–389.

8. Mukrasch MD; Bibow S; Korukottu J; Džeganatans S; Biernat J; Grīzingers C; Mandelkovs E; Zweckstetter M 441-atlikuma Tau strukturālais polimorfisms ar viena atlikuma izšķirtspēju. PLOS Biology 2009, 7 (2), e1000034.

9. Scheres SHW; Džans W; Piekūns B; Goedert M Tau pavedienu krio-EM struktūras. Pašreizējais viedoklis strukturālajā bioloģijā 2020, 64, 17–25. [PubMed: 32603876]

10. Fitzpatrick AWP; Piekūns B; Viņš S; Murzin AG; Muršudovs G; Garingers HJ; Crowther RA; Ghetti B; Gērts M; Scheres SHW Alcheimera slimības tau pavedienu krio-EM struktūras. Daba 2017, 547 (7662), 185–190. [PubMed: 28678775]

11. Makijs A; Bousset L; Madiona K; Melki R atomu spēku mikroskopijas attēlveidošana un sešu Tau izoformu mezglu nanomehāniskās īpašības. Biophysical Journal 2020, 119 (12), 2497–2507. [Pubmed: 33217380]

12. Metriks MA; Ferreira NDC; Saijo E; Kraus A; Nevels K; Zanusso G; Vendruskolo M; Ghetti B; Caughey BA viens ultrasensitīvs tests Alcheimera un Pick slimību tau agregātu noteikšanai un diskriminācijai. Acta Neuropathologica Communications 2020, 8 (1), 22. [PubMed: 32087764]

13. Haili Z; Meng SR; Ventilators JB; Čens Dž; Liang Y cilvēka Tau fibrilizāciju paātrina pakļaušana svina iedarbībai, mijiedarbojoties ar Viņa-330 un Viņa-362. PloS one 2011, 6, e25020. [PubMed: 21966400]

14. Fon Bergens M; Barghorn S; Li L; Markss A; Biernat J; Mandelkovas Tau proteīna EM mutācijas frontotemporālās demences gadījumā veicina pāru spirālveida pavedienu agregāciju, uzlabojot lokālo struktūru. Bioloģiskās ķīmijas žurnāls, 2002, 276, 48165–74.

15. Frost B; Ollešs J; Vilis H; Dimanta MI savvaļas tipa Tau fibrilu konformācijas daudzveidība, ko nosaka veidnes konformācijas izmaiņas. Bioloģiskās ķīmijas žurnāls, 2009, 284 (6), 3546–3551.

16. Liu W; Hu X; Džou L; Tu Y; Shi S; Yao T orientācijas iedvesmots skatījums uz Tau agregācijas molekulāro inhibitoru, ko rada kurkumīns, konjugēts ar rutēnija(II) komplekso pamatni. The Journal of Physical Chemistry B 2020, 124 (12), 2343–2353. [PubMed: 32130010]

17. Prokopovičs DV; Whittaker JW; Muthee MM; Ahmeds A; Larini L Fosforilācijas un pseidofosforilācijas ietekme uz mikrotubuliem saistītā proteīna Tau agregācijas agrīnajiem posmiem. The Journal of Physical Chemistry B 2017, 121 (9), 2095–2103. [PubMed: 28218850]

18. Ārija S; Ganguly P; Arsiccio A; Klods SL; Slazds B; Schonfeld GE; Liu X; Lazars Kantrels K; Shea JE; Bowers MT Amiloidogēna Tau fragmenta termināļa vāciņš modulē tā fibrilācijas tieksmi. The Journal of Physical Chemistry B 2020, 124 (40), 8772–8783. [Pubmed: 32816481]

19. Rojas AV; Maisuradze GG; Scheraga HA Tau un A peptīdu jaukto agregātu veidošanās atkarība no A N-termināla reģiona sekundārās struktūras. The Journal of Physical Chemistry B 2018, 122 (28), 7049–7056. [PubMed: 29940109]

20. Qi R; Luo Y; Wei G; Nusinovs R; Ma BA “stiepšanas un iepakošanas” šķērssēšanas mehānisms var izraisīt Tau proteīnu agregāciju. The Journal of Physical Chemistry Letters, 2015, 6 (16), 3276–3282.

21. Do TD; Economou NJ; Chamas A; Buratto SK; Shea JE; Bowers MT mijiedarbība starp amiloīda un tau fragmentiem veicina aberrantus agregātus: ietekme uz amiloido toksicitāti. The Journal of Physical Chemistry B 2014, 118 (38), 11220–11230. [PubMed: 25153942]

22. Buée L; Bussière T; Buē-Šerers V; Delakurts A; Hof PR Tau proteīna izoformas, fosforilācija un loma neirodeģeneratīvos traucējumos. Brain Research Reviews 2000, 33 (1), 95–130. [PubMed: 10967355]

23. Luo Y; Ma B; Nusinovs R; Wei G strukturāls ieskats Tau proteīna paradoksā par iekšēji traucētu uzvedību, pašacetilēšanas aktivitāti un agregāciju. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (17), 3026–3031. [PubMed: 25206938]

24. Dongs X; Bera S; Qiao Q; Tang Y; Laosa Z; Luo Y; Gazit E; Tau proteīna Wei G šķidruma-šķidruma fāzes atdalīšana ir kodēta monomēra līmenī. The Journal of Physical Chemistry Letters, 2021, 12 (10), 2576–2586. [PubMed: 33686854]

25. Goux WJ; Koplins L; Nguyen AD; Noplūde K; Rutkofskis M; Shanmuganandam VD; Šarma D; Inouye H; Kiršners DA Taisnu un savītu pavedienu veidošanās no īsajiem Tau peptīdiem. Bioloģiskās ķīmijas žurnāls, 2004, 279 (26), 26868–26875.

26. Fändrihs M; Nyström S; Nilsons KPR; Bēkmans A; LeVine H 3.; Hammarström P Amiloīda fibrilu polimorfisms: izaicinājums molekulārajai attēlveidošanai un terapijai. J Intern Med 2018, 283 (3), 218–237. [PubMed: 29360284]

27. Härd T amiloīdās šķiedras: veidošanās, polimorfisms un inhibīcija. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (3), 607–614. [PubMed: 26276617]

28. Martial B; Lefèvre T; Auger M Izpratne par amiloīda fibrilu veidošanos, izmantojot olbaltumvielu fragmentus: strukturālie pētījumi, izmantojot vibrāciju spektroskopiju un cietvielu KMR. Biophys Rev 2018, 10 (4), 1133–1149. [PubMed: 29855812]

29. Eizenberga DS; Sawaya MR amiloido proteīnu strukturālie pētījumi molekulārā līmenī. Annual Review of Biochemistry 2017, 86 (1), 69.–95.

30. Moran SD; Zanni MT Kā iegūt ieskatu amiloīda struktūrā un veidošanā, izmantojot infrasarkano staru spektroskopiju. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (11), 1984–1993. [PubMed: 24932380]

31. Tycko R amiloīda fibrilu struktūras cietvielu KMR pētījumi. Fizikālās ķīmijas gada apskats 2011, 62 (1), 279–299.

32. Dazzi A; Prater CB AFM-IR: tehnoloģija un pielietojumi nanomēroga infrasarkanajā spektroskopijā un ķīmiskajā attēlveidošanā. Chemical Reviews 2017, 117 (7), 5146–5173. [PubMed: 27958707]

33. Dazzi A; Prāters CB; Hu Q; Chase DB; Rabolts JF; Marcott C AFM-IR: Atomu spēku mikroskopijas un infrasarkanās spektroskopijas apvienošana nanomēroga ķīmiskajai raksturošanai. Appl. Spectrosc. 2012, 66 (12), 1365. [PubMed: 23231899]

For more information:1950477648nn@gmail.com