Pētījums par Acteoside (aktīvās sastāvdaļas Cistanche Deserticola) ietekmi uz NAFLD, izraisot autofagiju

2 rezultāti

2.1 LC 3- ⅱ olbaltumvielu ekspresijas līmeņa salīdzinājums HepG2 šūnās, kas apstrādātas arRīkoties un atkārtojas LC 3- ⅱ olbaltumvielu relatīvā izpausmeHepg2 šūnās, kas apstrādātas ar BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) bija ievērojami augstāka nekā tukšajā vadības grupā (0. 41 ± 0. 0 2). LC {{1 {{2 0}}}} ⅱ Olbaltumvielu relatīvā ekspresija hepg2 šūnās rapamycin+bafa1 grupā (1,24 ± {{3 {0}}}. (0. 28 ± {{4 0}}. 02). LC 3- ⅱ olbaltumvielu ekspresija HEPG2 šūnās ECH+BAFA1 grupā un ACT+BAFA1 grupā [attiecīgi 0,43 ± 0,02 un 1,36 ± 0,11] bija ievērojami augstāka nekā ECH grupā un ACT grupā [(0,18 ± 0,01 un 0,28 ± 0,02, attiecīgi] un] un], un attiecīgi] un] un], un attiecīgi] un] un attiecīgi] un], un attiecīgi] un] un attiecīgi P. (P.<0.05).

TCM Herb Cistanche aknu aizsardzībai

2.2 LC 3- ⅱ olbaltumvielu ekspresijas līmeņa salīdzinājums HepG2 šūnās, kas apstrādātas ar dažādām ACT koncentrācijām

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ HepG2 šūnu olbaltumvielu ekspresijas līmeņi BAFA1 apvienojumā ar 25, 5 0 un 1 0} 0 μmol/L ACT Grupas (1.17 ± 0. 3 0}. 1.83±0.53, and 0.97±0.25, respectively) were significantly higher than those in the 25, 50, and 100 μmol/L ACT groups (0.38±0.09, 0.35±0.18, and 0.30±0.15, respectively), with significant differences (P<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Piezīme: A. olbaltumvielu imūnblotēšana; B. daļēji kvantitatīvas analīzes rezultāti; Salīdzinot ar ACT grupu bez BAFA1, AP<0.05.
1. attēls.

2.3 HEPG2 šūnu dzīvotspējas salīdzinājums, kas apstrādātas ar dažādām ACT koncentrācijām 24 un 48 stundas

HEPG2 šūnu OD vērtības pēc iejaukšanās ar 0, 2 0, 4 {{1 0}}, 6 0, 8 0} un 1 0} 0} μmol/L ACT 24 h bija 24 h. 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 {0}}. 15, 0. 99 ± 0. 19, 1. 0. 94 ± 0. 15, un 0. 94 ± 0. 20; un HEPG2 šūnu OD vērtības pēc iejaukšanās 48 stundas bija 3,06 ± 0,27, .96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, attiecīgi 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 un 0,09 ± 0,22. Pēc 24 un 48 stundu intervences OD vērtībām nebija būtiskas atšķirības ar dažādām ACT koncentrācijām (F =0. 213, 0,213, P =0. 96, 0,36). Skatīt 2. attēlu.

Piezīme: A. HepG2 šūnas 24 stundas apstrādāja ar dažādām ACT koncentrācijām; B. HepG2 šūnas 48 stundas apstrādāja ar dažādām ACT koncentrācijām.

2. attēls

2.4. TG līmeņa un eļļas sarkanās O krāsošanas salīdzinājums NAFLD in vitro šūnu modelī pēc ACT iejaukšanās

HEPG2 šūnu TG līmenis modeļa grupā (34,15 ± 1,90) bija ievērojami augstāks nekā tukšajā kontroles grupā (14,17 ± 2,74) un ACT intervences grupā (19,11 ± 1,68), un atšķirības bija statistiski nozīmīgas (P PT (P P (P P P (P P. P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Piezīme: A. TG līmenis; B. eļļa sarkana o krāsošana (20 ×); Salīdzinot ar modeļa grupu, AP<0.05.
3. attēls TG līmeņa un eļļas sarkanās O krāsošanas salīdzinājums NAFLD in vitro šūnu modelī pēc ACT apstrādes

2.5. Autofagosomu un lipīdu pilienu salīdzinājums pēc ACT apstrādes, salīdzinot ar tukšo kontroles grupu, HepG2 šūnu lipīdu pilieni rapamicīna ārstēšanas grupā un ACT intervences grupa ievērojami palielinājās, un LC3 autofagosomas hepG2 šūnas ACT intervences grupā ievērojami palielinājās un kopējās ar lipīdu pilieniem telpā. Skatīt 4. attēlu.

3 diskusija

NAFLD ir visizplatītākā hroniskā aknu slimība pasaulē, kas veido apmēram 1/4 no pasaules kopējā iedzīvotāju skaita un ir kļuvusi par globālu sabiedrības veselības problēmu. Pārmērīgs uzturs ir galvenais faktors, kas virza NAFLD. Pārmērīga barības vielu uzņemšana ar aknu šūnām izraisa pārmērīgu tauku nogulsnēšanos šūnās, izraisot lipotoksiskas reakcijas, piemēram, šūnu stresu (oksidatīvais stress un endoplazmatiskā retikuluma stress), iekaisuma aktivizēšana un šūnu apoptoze, un pēc tam aknu audu fenotipi, piemēram, iekaisuma stimulācijas stimulācijas, kas ir iekaisušas stimulācijas, un pēc tam, kad ir iekaisuma stimulācija, un šūnu apoptoze. Pēdējos gados pētījumi parādīja, ka autofagijai ir liela nozīme cilvēka NAFLD attīstības novēršanā. Ar autofagiju saistītas indeksa noteikšanas rezultāti pacientu ar NAFLD un bezalkoholisko tauku aknu slimību aknām un aptaukošanās un diētas pelēm ar augstu tauku saturu parādīja, ka hepatocītu autofagijas process tika bloķēts, kas izraisīja masīvu intracelulārā TG un citu lipīdu pilienu uzkrāšanos [16]. Citi pētījumi parādīja, ka pēc tam, kad hepatocītu autofagijas galvenais gēns 7 tika īpaši izsists pelēm, kurām tika barota diēta ar augstu tauku saturu, TG līmenis peles hepatocītos ievērojami palielinājās [17]. Tomēr pēc ATG7 gēna pārmērīgas ekspresijas vai iejaukšanās ar autofagijas induktoriem, piemēram, rapamicīnu un karbamazepīnu, tauku deģenerācija peles aknās tika ievērojami samazināta [18-20].
Tas liek domāt, ka aknu tauku deģenerāciju var ievērojami samazināt, uzlabojot aknu autofagijas aktivitāti, nodrošinot efektīvu stratēģiju NAFLD ārstēšanai. Dabiskos produktus kā galveno jaunu zāļu izstrādes avotu plaši izmanto dažādu aknu slimību profilaksē un ārstēšanā. Cistanche Deserticola kā izcils produkts, ko parasti izmanto tradicionālajā ķīniešu medicīnā, ir piesaistījusi plašu uzmanību tā farmakoloģiskajai iedarbībai, piemēram, neiroprotekciju, imūnmodulāciju, antioksidantu, pretvēža un aknu aizsardzību. Līdz šim no Cistanche Deserticola ir izolēti vairāk nekā 120 savienojumi, ieskaitot feniletanoīdu glikozīdus, terpenoīdus un to glikozīdus, lignānus un to glikozīdus, oligosaharīdus, poliolus un polisaharīdus [21]. Starp tiem feniletanoīdu glikozīdi ir visvairāk pētītā savienojumu klase Cistanche Deserticola aktīvajās sastāvdaļās. ECH un ACT ir reprezentatīvi Cistanche Deserticola feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, kuriem ir pozitīva ietekme uz antioksidantiem, aizsargājot aknas, miokardu, nervu šūnas un uzlabojot atmiņu [22-23]. Tomēr nav attiecīga literatūras ziņojuma par to, vai Cistanche Deserticola feniletanoīdu glikozīdi ir iesaistīti autofagijas procesā aknu aizsardzībā.

Autofagija ir pašnoteikšanās process, kas ķermenī ir visuresošs. Tas ir katabolisma process, kurā autofagosomas noārda šūnu metabolisma atkritumus. Autofagijas procesā parasti ietilpst trīs procesi: autofagijas ierosināšana, autofagiskā membrānas pagarinājums un autofagiska lizosomu veidošanās, ko galvenokārt regulē rapamicīna mērķa proteīns un fosfatidilinozitols -3} kināzes signālu ceļi. Autofagosomas ir šūnu autofagijas marķieri. Autofagosomu veidošanās procesā svarīga loma ir virknei ar autofagiju saistītu olbaltumvielu, ieskaitot Atg5 ~ 12 un LC3. Tāpēc šis pētījums izveidoja autofagijas novērtēšanas sistēmu, atklāja autofagijas marķiera olbaltumvielu LC3 ekspresijas līmeni molekulārā līmenī un novērtēja divu feniletanoīdu glikozīdu autofagijas indukcijas spēju HepG2 šūnās. Rezultāti parādīja, ka pēc BAFA1 apstrādes pievienošanas, pamatojoties uz autofagijas induktora rapamicīna iejaukšanos, intracelulārā LC 3-} HepG2 šūnu ⅱ ievērojami palielinājās, norādot, ka autofagijas novērtēšanas sistēma var precīzi novērtēt narkotiku autofagijas indukcijas aktivitāti; Pēc tam, kad ECH un ACT tika apstrādāti ar BAFA1, LC 3- ⅱ olbaltumvielu ekspresija HepG2 šūnās ECH+BAFA1 grupā un ACT+BAFA1 grupa bija ievērojami augstāka nekā ECH grupā un ACT grupā, un atšķirības bija statistiski nozīmīgas (P P.<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and aknu aizsardzības nodrošināšanaun citas bioloģiskās funkcijas. Otrkārt, drošība ir galvenais apsvērums narkotiku izstrādē. Lai novērtētu ACT drošību, šis pētījums vēl vairāk pārbaudīja ACT ietekmi uz HEPG2 šūnu dzīvotspēju. Rezultāti parādīja, ka HEPG2 šūnu dzīvotspēja gandrīz neietekmēja intervence ar dažādām ACT koncentrācijām, norādot, ka ACT var izmantot kā kandidātu narkotiku, lai turpinātu izpētīt tā farmakoloģisko iedarbību un molekulāros mehānismus.

Autofagija ir ļoti konservēts bioloģiskais process šūnās, un nelielas zāļu koncentrācijas izmaiņas ietekmēs šūnu autofagosomu līmeni. Lai vēl vairāk noteiktu optimālo ACT koncentrāciju, lai izraisītu autofagosomu veidošanos HepG2 šūnās, šajā pētījumā tika izmantotas dažādas ACT koncentrācijas, kas apvienotas ar BAFA1, lai ārstētu HepG2 šūnas un atklāja LC 3- ⅱ olbaltumvielu ekspresijas līmeni šūnās. Rezultāti parādīja, ka 50 μmol/L ACT var ievērojami palielināt autofagosomu līmeni HepG2 šūnās. Tāpēc šajā pētījumā tika izmantots 50 μmol/L ACT, lai iejauktos NAFLD šūnu modelī, kas izveidots in vitro, un sākotnēji izpētīja saistību starp tāaknu aizsardzībafunkcija un autofagija.
Saistītie pētījumi par NAFLD šūnu modeļiem ir parādījuši, ka pēc in vitro iejaukšanās ar brīvajām taukskābēm HepG2 šūnu TG līmenis ievērojami palielinājās, un šūnās varēja skaidri novērot eļļainu lipīdu pilienu agregāciju [{24-25]. Šajā pētījumā HEPG2 šūnās 24 stundas tika izmantots 100 μmol/L PA. HEPG2 šūnu TG līmenis modeļa grupā bija ievērojami augstāks nekā tukšajā kontroles grupā. Tajā pašā laikā šūnās varēja skaidri novērot lipīdu pilienu agregāciju, norādot, ka NAFLD šūnu modelis ir veiksmīgi izveidots. Lai vēl vairāk novērotu ACT ietekmi uz NAFLD šūnu modeli, NAFLD in vitro šūnu modelī tika izmantots 50 μmol/L ACT, un ACT uz NAFLD ietekme tika novērtēta ar TG līmeņa noteikšanu un eļļas sarkanu O krāsošanu. Rezultāti parādīja, ka pēc ACT iejaukšanās TG līmenis un taukaino lipīdu pilienu skaits HepG2 šūnās bija ievērojami zemāks nekā modeļa grupā, norādot, ka ACT ir aktivitāte, samazinot TG PA izraisītajā NAFLD šūnu modelī. Lai turpinātu izpētīt saistību starp ACT lipīdu pazeminošo aktivitāti un šūnu autofagiju, šajā pētījumā tika izmantotas LC 3- ⅱ specifiskas olbaltumvielu antivielas un bodipy fluorescējošās zondes, lai apkopotu autofagosomas un lipīdu pilienus. Tika novērots, ka Autofagosomu skaits HepG2 šūnās pēc ACT iejaukšanās tika ievērojami palielināts, salīdzinot ar kontroles grupu, kas šajā pētījumā saskanēja ar olbaltumvielu imūnblotēšanas rezultātiem, vēl vairāk apstiprinot, ka ACT ir autofagiju izraisoša aktivitāte HepG2 šūnās. Turklāt pēc narkotiku iejaukšanās, intracelulāras autofagosomas un lipīdu pilieni, kas ir lokalizēti, norādot, ka ACT ietekme uz PA izraisītas NAFLD taukaino deģenerācijas uzlabošanu var ietvert šūnu autofagijas iesaistīšanos. Tomēr NAFLD šūnu modelī, vai ACT veic savu farmakoloģisko aktivitāti, samazinot intracelulāro TG līmeni caur lipofagisko ceļu, joprojām ir jāpaskaidro, bloķējot intracelulāro autofagijas procesu.
Rezumējot, starp diviem Cistanche Deserticola feniletanola glikozīdu savienojumiem ACT ir ievērojama spēja izraisīt autofagiju HepG2 šūnās. Tajā pašā laikā PA izraisītajā aknu steatozes šūnu modelī CT ievērojami samazināja TG līmeni HepG2 šūnās. Pēc ACT iejaukšanās autofagosomām un lipīdu pilieniem HepG2 šūnās bija noteiktas ko lokalizācijas attiecības, norādot, ka autofagija var būt jauns ceļš, kas iesaistīts ACT farmakoloģiskajā procesā aknu aizsardzības ziņā. Skatīt 5. attēlu. Turpmākajos pētījumos likuma darbības mehānisms lipīdu pazemināšanā tiks sīki pētīts, izmantojot autofagijas blokatorus, lai izveidotu pamatu nākotnes jaunu zāļu izstrādei.