Mērķtiecīga nākamās paaudzes sekvencēšana identificē diabētiskās nieru slimības patogēnos variantus

Rezultāti

Pētījumu kohortas

Divsimt seši pacienti arCKD, ieskaitot 97NDKDpacienti un 109DKDpacienti no Jūtas nieru pētījuma tika veiksmīgi sekvencēti, izmantojot pielāgotu gēnu paneli. Šajā pētījumā iekļauto NDKD un DKD pacientu vidējais vecums bija attiecīgi 47,9 un 62.0. Lielākajai daļai pacientu mūsu NDKD grupā (56,7 procenti) bija klīniska glomerulopātijas diagnoze, 20,6 procentiem bija cistiskā nieru slimība, 5,2 procentiem bija iedzimta nieru slimība un 4,1 procentiem bija tubulointersticiāla slimība. Aptuveni 13 procentiem no šiem pacientiem bija citas NDKD formas. Visiem šajā pētījumā iekļautajiem diabēta pacientiem bija cukura diabēta diagnoze pirms HNS diagnozes, un diabēts bija norādīts kā galvenais HNS cēlonis viņu EMR. No šiem pacientiem 80,7 procentiem bija T2D diagnoze un 76,1 procenti tika ārstēti ar insulīnu brīdī, kad viņi tika uzņemti Jūtas nieru pētījumā. Trīsdesmit astoņi procenti NDKD pacientu un gandrīz 34 procenti DKD pacientu ziņoja, ka viņiem ir pirmās pakāpes radinieks ar nieru slimību.

Mērķtiecīga ar nieru slimību saistītā gēna NGS

Izmantojot mūsu mērķtiecīgo sekvencēšanas paneli, mēs identificējām 1259 retus funkcionālus variantus (ti, nesinonīmus, pārtraukšanas pastiprinājumu/zaudējumus, splicēšanu, kadra nobīdes ievietošanas/dzēšanas un kadrā ievietošanas/dzēšanas variantus) 345 ar nieru slimību saistītajos gēnos starp 2{ {8}}Šajā pētījumā iekļauti 6 pacienti. No šiem variantiem 63 (5,0 procenti) tika klasificēti kā patogēni vai iespējami patogēni, izmantojot ACMG-AMP vadlīnijas; pārējie varianti tika klasificēti kā “nezināmas nozīmes varianti” (VUS) (n=1,024; 81,3 procenti) vai labdabīgi/iespējami labdabīgi varianti (n=172; 13,7 procenti).

Diagnostikas varianti ar nieru slimībām saistīto gēnu NDKD pacientiem

Kopumā patogēni vai iespējami patogēni varianti tika identificēti 35 no 97 mūsu pētījumā iekļautajiem NDKD pacientiem (36 procenti). Mēs identificējām 17 diagnostikas variantus (ti, patogēnus vai iespējami patogēnus variantus, kas atbilst mantojuma modelim, kas saistīts ar pacienta klīnisko diagnozi), tostarp 13 jaunus variantus (76,5 procenti), kas nav iekļauti gnomAD datu bāzē, 18 NDKD pacientiem (18,6 procenti). mūsu pētījumā. Šie patogēnie vai iespējamie patogēnie viena nukleotīda un ievietošanas/dzēšanas varianti tika atklāti 7 gēnos (CFH, COL4A3, COL4A5, GLA, PAX2, PDK1 un PDK2). PKD1 un PKD2 bija gēni ar vislielāko kandidātu diagnostikas variantu slodzi.

Diagnostikas rezultāti bija visaugstākie (9 no 20; 45,0 procenti) pacientiem, kuriem diagnosticēta cistiskā nieru slimība. Kopumā 9 pacientiem bija PKD1 vai PKD2 diagnostikas varianti, gēni, par kuriem zināms, ka tie ir autosomāli dominējošās policistiskās nieru slimības (ADPKD) cēloņi; 8 no identificētajiem PKD1/PKD2 variantiem populācijas datos nebija. Pieciem papildu pacientiem ar cistisko nieru slimību bija jauni VUS PKD1 vai PKD2, kas tiek uzskatīti par kaitīgiem, izmantojot skaitļošanas prognozēšanas rīkus. Lai gan šie varianti neatbilst stingriem ACMG-AMP kritērijiem, lai tos klasificētu kā klīniski nozīmīgus, tiem ir apstiprinoši pierādījumi par patogenitāti. Turpmāka šo variantu pārbaude, tostarp segregācijas analīze un funkcionālie testi, kopā ar šo skaitļošanas atbalstu, varētu vēl vairāk palielināt ģenētiskās skrīninga diagnostisko ražu šajā pētījumā iekļautajiem pacientiem ar cistisko nieru slimību.

Turklāt mēs identificējām APOL1 riska alēles (G1: p.Ser342Gly un p.Ile384Met un/vai G2: p.Asn388_Try389del) 2 afroamerikāņu NDKD pacientiem ar klīniskām glomerulonefrīta diagnozēm (G1/G1 genotips) un hipertensīvā nefropātija (G1/G2 genotips), attiecīgi.

Nieru slimību diagnožu pārklasificēšana NDKD pacientiem, pamatojoties uz ģenētiskajām diagnozēm-Ar nieru slimību saistīto gēnu sekvencēšana 4 NDKD pacientiem

(4,1 procenti) ļāva mums identificēt variantus, kas atbilst ģenētiskajām diagnozēm, kas atšķiras no to dokumentētajām klīniskajām diagnozēm. Šo pacientu vidū mēs konstatējām lielu homozigotu NPHP1 dzēšanu pacientam, kuram pēc nieru biopsijas diagnosticēts ar antineitrofilu citoplazmas antivielām (ANCA) saistīts vaskulīts, kas veido aptuveni 80 procentus pacientu ar šo slimību, kas liecina, ka šai personai var būt divas vienlaicīgi. nieru darbības traucējumi (ti, ģimenes juvenīlais nefronoftīze un ANCA vaskulīts). Tāpat 1 pacientam, kuram diagnosticēta PKD, tika konstatēts COL4A3 (p.R1661C) diagnostikas variants. Šis pats variants, kaut arī reti sastopams populācijā (MAF=3,6 × 10–4), mūsu pētījumā tika novērots 2 papildu pacientiem (pacientam ar iedzimtu nefrotisko sindromu un pacientam, kuram diagnosticēta DKD), un tas ir bijis iepriekš. novērots pacientiem ar FSGS un autosomāli recesīvo Alport sindromu (MIM 104200). Katram no šiem pacientiem viņu ģenētiskā diagnoze vairāk atbilst glomerulārām slimībām, tostarp plānai bazālās membrānas nefropātijai (TBMN), FSGS vai Alporta sindromam.

Līdzīgi mēs identificējām retu GLA variantu (p.A143T) pacientam, kuram diagnosticēta klīniski

ar iedzimtu nieru slimību; Iepriekš ziņots, ka šis variants ir patogēns pacientiem ar Fābri slimību (MIM 301500). Visbeidzot, vienam pacientam, kuram diagnosticēta IgA nefropātija, tika konstatēti reti sastopami salikti heterozigoti IFT122 varianti (p.R166W un p.R779X), kas, kā zināms, veicina ciliāru disfunkciju un cistisko nieru slimību.

Reti ar nieru slimībām saistīto gēnu varianti pacientiem ar DKD—Izmantojot ACMG-AMP vadlīnijas, lai klasificētu variantus šajos pašos ar nieru slimību saistītos gēnos, patogēni vai iespējami patogēni varianti tika identificēti 22.0 procentiem (24 no 109) DKD pacientu. iekļauti šajā pētījumā (2.B tabula). Variantu īpatsvars bija līdzīgs gan T1D, gan T2D pacientiem (attiecīgi 19 procenti pret 23 procentiem; p-vērtība > 0,05). Lai gan tas nav statistiski nozīmīgs, gandrīz vienai trešdaļai DKD pacientu (27,0 procenti), kuriem tika konstatēts patogēns vai iespējams patogēns variants, ziņoja par nieru slimību ģimenes anamnēzē, salīdzinot ar tikai 19,4 procentiem DKD pacientu bez zināmas nieru slimības ģimenes anamnēzes. Kopumā šiem pacientiem 23 gēnos tika identificēti 29 patogēni vai iespējami patogēni varianti. C5orf42 (saukts arī par CPLANE1 un JBTS17) starp šiem pacientiem bija vislielākais patogēno vai iespējamo patogēno variantu slogs.3

Interesanti, ka 9 DKD pacientiem tika konstatēti reti patogēni vai iespējami patogēni varianti zināmos ciliopātijas gēnos, tostarp DYNC2H1, INPP5E, XPNPEP3, NEK8 un C5orf42. Seši no šajos gēnos identificētajiem variantiem ir iespējamie funkciju zuduma (pLOF) varianti, kas vai nu ietekmē savienojuma vietas, vai ievieš priekšlaicīgus stopkodonus (ti, bezjēdzīgus variantus vai kadru nobīdes ievietošanu/dzēšanu). No šiem pacientiem 1 C5orf42 bija bialēliskie varianti (p.I165Yfs*17, patogēns variants un p.S123F, variants ar apstiprinošiem patogenitātes pierādījumiem, kas, domājams, kaitēs vismaz 5 no 6 skaitļošanas prognozēšanas metodēm), kas liecina, ka šis pacients, iespējams, ir salikts heterozigots šī gēna kaitīgo variantu nesējs.

Reti diagnostikas NDKD varianti, kas identificēti DKD pacientu apakškopā—Tika konstatēts, ka trīs DKD pacientiem (2,8 procenti) ir reti sastopami varianti, kas liecina, ka viņu nieru slimības pamatcēlonis var nebūt diabēta sekas. Tika konstatēts, ka pacientam ar T2D izraisītu HNS ir reta AQP2 diagnostikas versija (p.N220T); gēns, kas izraisa nefrogēna diabēta insipidus autosomāli dominējošo formu, stāvokli, kam raksturīga smaga poliūrija. Līdzīgi patogēns REN variants (p.R49X) tika identificēts arī otram pacientam ar T2D. Patogēnie varianti REN ir saistīti ar autosomāli dominējošu tubulointersticiālu nieru slimību (ADTKD). Tā kā abiem šiem pacientiem anamnēzē ir arī diabētiskā retinopātija, viņiem var būt vienlaikus DKD un NDKD. Visbeidzot, tika konstatēts, ka vienam T2D pacientam ir COL4A3 (p.R1661C) diagnostikas variants. Kā minēts iepriekš, šis variants ir novērots pacientiem ar FSGS un autosomāli recesīvo Alport sindromu. Atšķirībā no DKD pacientiem ar AQP2 un REN variantiem, neskatoties uz vairāk nekā 35 gadus ilgušo diabētu, šim pacientam nav dokumentētu retinopātijas vai neiropātijas pierādījumu, kas vēl vairāk liecina, ka šim pacientam, iespējams, ir NDKD.

Reto variantu ģenētiskais slogs ar nieru slimībām saistītos gēnos NDKD un DKD pacientiem—We performed gene-based burden association tests to compare the rate of rare variants between NDKD and DKD patients aggregated within each gene. As expected, the most significant enrichment of rare pathogenic or likely pathogenic variants was observed in PKD1 among NDKD patients. Similarly, although not statistically significant (p-value >0.05), retu patogēnu vai iespējamu patogēnu variantu bagātināšanās tika novērota arī PKD2 pacientiem ar NDKD. Un otrādi, DKD pacientiem tika novērots retu C5orf42 variantu pārpalikums.

Tā kā variantus, kas klasificēti kā VUS, izmantojot ACMG-AMP vadlīnijas, nevar izslēgt kā labdabīgus un, iespējams, ietver patogēnus variantus, mēs paplašinājām uz gēnu slodzes analīzi, iekļaujot retus variantus ar apstiprinošiem patogenitātes pierādījumiem, pamatojoties uz skaitļošanas prognozēšanas metodēm. Kā redzams mūsu analīzē tikai par retiem patogēniem vai iespējamiem patogēniem variantiem, mēs novērojām retu variantu pārmērīgu slodzi gan PKD1 (p-vērtība=0.01), gan PKD2 (p-vērtība=0.04). ) NDKD pacientiem. Reti COL4A5 varianti (p vērtība=0,008) arī bija ievērojami bagātināti NDKD, salīdzinot ar DKD pacientiem. Interesanti, ka papildus asociācijas stiprināšanai, kas novērota DKD pacientiem ar retiem C5orf42 variantiem (p-vērtība= 0.04), šī analīze atklāja retu variantu bagātināšanos DKD pacientiem abos AKE (p-vērtība {{21). }}.008) un NEK8 (p-vērtība=0.04).

Diskusija/Secinājums

Šī pētījuma mērķis bija izpētīt NGS lietderību, lai izprastu nieru slimības molekulāro bāzi pacientiem ar un bez cukura diabēta. Lai gan ir pierādīts, ka ģenētiskā testēšana palīdz nodrošināt precīzāku diagnozi pacientiem ar pārmantojamām nieru slimības formām, tostarp ADPKD, Alporta sindromu un Fabri slimību, tās pielietojums pacientiem arDKD, un tā lietderība, lai identificētu neparedzētu nieru slimību pacientiem, kuriem diagnosticēta DKD, ir ierobežota. Lai to sīkāk izpētītu, mēs veiksmīgi veicām mērķtiecīgu NGS kopumā 206 pacientiem ar HNS, tostarp 97 NDKD un 109 DKD pacientiem, izmantojot pielāgotu gēnu paneli, kas sastāv no 345 ar nieru slimībām saistītiem gēniem. Mūsu analīze identificēja diagnostikas variantus, kas atbilst klīniskajai diagnozei aptuveni 19 procentiem šajā pētījumā iekļauto NDKD pacientu. Lai gan tika konstatēts, ka vienai trešdaļai NDKD pacientu ir patogēni vai iespējami patogēni varianti, kā tas klasificēts saskaņā ar ACMG-AMP vadlīnijām, vairāk nekā 20 procentiem šajā pētījumā iekļauto DKD pacientu bija līdzīgi klasificēti varianti (ti, patogēni vai iespējami patogēni varianti). ) šajos pašos ar nieru slimību saistītajos gēnos. Mēs atklājām ģenētiskos variantus, kas liecina par NDKD, aptuveni 3 procentiem šajā pētījumā iekļauto diabēta pacientu.

Vairāki gēni satur patogēnus variantusDKDpacienti, tostarp CUBN, PEX5, VDR un COL4A3, iepriekš ir bijuši saistīti ar diabētisko nefropātiju. Ir zināms, ka CUBN, gēna, kas ekspresēts proksimālo kanāliņu šūnu apikālās sukas malās, kodēšanas varianti ir saistīti ar albuminūriju. Nesen veikts genoma mēroga asociācijas pētījums atklāja retu CUBN kodēšanas variantu, kas bija neatkarīgs no iepriekš identificētiem šī gēna izplatītajiem variantiem un kam bija vairāk nekā 3{5}} lielāka ietekme pacientiem ar cukura diabētu, salīdzinot ar tiem, kuriem nav diabēta. . Līdzīgi, Saito et al. multi-omics sistēmu bioloģijas analīze. atklāja, ka PEX5, peroksisomu bioģenēzes marķieris, ir saistīts ar diabētisko nefropātiju, izmantojot peroksisomu disfunkciju, un tam ir nozīme ar peroksisomu saistīto metabolītu pazemināšanā. Pavisam nesen, kā daļa no līdz šim lielākā genoma mēroga asociācijas pētījuma par DKD, Nepilngadīgo diabēta pētniecības fonda Diabētiskās nefropātijas sadarbības pētījumu iniciatīva identificēja 16 genoma mēroga nozīmīgus lokusus, kas saistīti ar DKD; interesanti, ka 2 no šī pētījuma galvenajiem signāliem ir zināmos ar nieru slimību saistītos gēnos (COL4A3 un BMP7). COL4A3 kodē glomerulārās bazālās membrānas galveno strukturālo komponentu un ir saistīts ar iedzimtām nefropātijām, tostarp Alporta sindromu, FSGS un TBMN. Retais COL4A3 variants tika identificēts 3 mūsu pētījumā iekļautajiem pacientiem (1 DKD un 2 NDKD pacienti) iepriekš tika novēroti ģimenē ar biopsiju pierādītu FSGS, kas liecina, ka šis variants var veicināt nieru slimību neatkarīgi no diabēta stāvokļa.

Hiperglikēmijas klātbūtnē skropstu struktūras vai funkcijas defekti izraisa strukturālas un funkcionālas izmaiņas nierēs, tostarp podocītu izdalīšanos, intersticiālu iekaisumu un proteīnūriju. Interesanti, ka 25 procenti DKD pacientu bija pozitīvi attiecībā uz patogēniem vai iespējamiem patogēniem variantiem, kas satur retus variantus zināmos ar ciliopātiju saistītos gēnos, tostarp 3 pacientiem, kuriem konstatēti reti pLOF varianti C5orf42, gēnā, kas saistīts ar retām autosomāli recesīvām ciliopātijām. kam raksturīga cistiskā nieru slimība. Līdzīgi mēs identificējām retus, iespējams, patogēnos variantus XPNPEP3 2 DKD pacientiem ar ESRD; XPNPEP3 defekti izraisa nefronoftizei līdzīgu nefropātiju, cistisku nieru slimību, kas izraisa ESRD. Kopumā šie dati liecina, ka ar nieru slimību saistīto gēnu variantiem diabēta patofizioloģijas kontekstā ir nozīme nieru slimības patoģenēzē pacientiem ar cukura diabētu.

Iepriekšējie pētījumi, kuros pētīta ģenētiskās testēšanas diagnostiskā lietderībaCKDkonstatēja, ka kopējais diagnostikas rezultāts ir aptuveni 10 procenti. Tomēr pacientiem ar diabētiskās nefropātijas klīnisko diagnozi tas bija daudz zemāks (1,6 procenti). Turpretim mēs noskaidrojām, ka pat 22 procentiem mūsu pētījumā iekļauto DKD pacientu ir patogēni vai iespējami patogēni gēni, kas saistīti ar nieru slimību, kas iekļauti mūsu gēnu panelī. Lai gan šīs neatbilstības iemesls nav skaidrs, jāatzīmē, ka gandrīz 70 procentiem no tiem, kuriem mūsu pētījumā tika konstatēti varianti, bija ESRD, kas liecina, ka šie varianti var predisponēt diabēta pacientus uz smagāku nieru slimību.

Saskaņā ar iepriekšējo pētījumu datiem, mūsu pētījums izceļ ģenētiskās testēšanas efektivitāti, nosakot slimības molekulāro cēloni pacientiem ar dažādām NDKD formām. Papildus ģenētisko diagnožu piešķiršanai, kas apstiprināja vairāku NDKD pacientu klīniskās diagnozes, pacientu apakšgrupā mēs varējām identificēt retus variantus, kas liecināja, ka viņu diagnozes ir jāpārvērtē. Šiem pacientiem ģenētiskā analīze var būt palīdzējusi atklāt neatpazītus klīniskos simptomus un labāk informēt viņu aprūpes vadību.

Mūsu pētījumam ir ierobežojumi, kas būtu jāatzīst. Pirmkārt, mūsu pētījumā bija tikai 206 pacienti. Neskatoties uz pieticīgo izlases lielumu, tas ir pirmais, kas vispusīgi pēta reto variantu slogu ar nieru slimībām saistītos gēnos DKD. Mēs ne tikai atklājām, ka 22 procentiem no šiem DKD pacientiem ir reti sastopami šo gēnu varianti, bet dažiem mēs noteicām ģenētisku diagnozi, kas liecina, ka viņu nieru slimība, visticamāk, nebija diabēta sekas, tādējādi uzsverot ģenētiskās skrīninga vērtību. precīzas molekulārās diagnozes atklāšanā. Otrkārt, lai gan mēs varējām atklāt gan kodēšanas variantus, gan strukturālus pārkārtojumus, izmantojot mērķtiecīgu sekvencēšanu, variantus nekodējošos reģionos, kas potenciāli ietekmē RNS ekspresiju un/vai apstrādi (piemēram, tos, kas ietekmē transkripcijas represijas, eksonu izlaišanu un intronu iekļaušanu). , netika novērtēti. Tā kā mūsu pielāgotais uztveršanas tests aprobežojās ar mūsu panelī iekļauto gēnu kodēšanas apgabalu un ekson-intronu robežām, nekādus variantus ārpus šiem reģioniem, tostarp promotora reģionos un citos nekodējošos vai regulējošos reģionos, nevarēja noteikt, izmantojot šo. tests. Treškārt, lai palielinātu specifiku, mēs ievērojām ACMG-AMP standartus un vadlīnijas variantu interpretācijai, un tāpēc daudzi no mūsu pētījumā identificētajiem variantiem tika marķēti kā VUS un nebija saistīti ar klīniskajiem fenotipiem. Tā kā VUS nevar pilnībā izslēgt kā labdabīgu, tas varēja ietekmēt mūsu pētījuma jutīgumu. Aprēķinu prognozēšanas algoritmi kopā ar funkcionālo pētījumu atbalstu varētu palīdzēt labāk izprast VUS patogenitāti un noteikt to prioritāti turpmākai izpētei.

Mūsu mērķis bija izmantot NGS tehnoloģiju, lai labāk izprastu nieru slimību ģenētiskos pamatus pacientiem ar cukura diabētu. Lai gan lielākajai daļai mūsu pētījumā iekļauto diabēta pacientu ar nieru slimību saistītos gēnos netika konstatēti patogēni/iespējami patogēni varianti, tika konstatēts, ka neliela daļa (vairāk nekā 20 procenti) satur variantus, kas, mūsuprāt, veicina viņu slimību. Mūsu atklājumi liecina, ka reti varianti gēnos, kas iepriekš nav saistīti ar DKD (piemēram, ciliopātijas gēni), var veicināt jutību pret DKD un ka ģenētiskā skrīnings pacientiem ar DKD var palīdzēt nodrošināt molekulāro diagnozi, kas varētu uzlabot precizitātes diagnostiku un palīdzēt prognozēt. un to ilgtermiņa vadībanieru slimība.

Papildu materiāls

Papildu materiālu skatiet PubMed Central tīmekļa versijā.

Pateicības

Autori atzīst atbalstu no Nacionālā nieru fonda (MGP) un Lerija H. un Geila Millera ģimenes fonda Diabēta iniciatīvas (MGP).

Finansējuma avoti

Šo pētījumu daļēji finansēja Jūtas un Aidaho Nacionālais nieru fonds (MGP) un Lerija H. un Geila Milleru ģimenes fonda diabēta iniciatīva (MGP).

Atsauces

17. Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, Cummings BB, Alföldi J, Wang Q u.c. Atšķirības starp 141 456 cilvēka eksomiem un genomiem atklāj funkciju zuduma nepanesības spektru cilvēka proteīnus kodējošajos gēnos. bioRxiv. 2019. gads.

18. Li Q, Wang K. InterVar: ģenētisko variantu klīniskā interpretācija saskaņā ar 2015. gada ACMG-AMP vadlīnijām. Am J Hum Genet. 2017; 100(2): 267–80. [PubMed: 28132688]

37. Zivna M, Hulkova H, Matignon M, Hodanova K, Vylet'al P, Kalbacova M u.c. Dominējošās renīna gēnu mutācijas ir saistītas ar agrīnu hiperurikēmiju, anēmiju un hronisku nieru mazspēju. Am J Hum Genet. 2009;85(2):204–13. [Pubmed: 19664745]

52. Renkema KY, Stokman MF, Giles RH, Knoers NV. Nākamās paaudzes sekvencēšana nieru slimību pētniecībai un diagnostikai. Nat Rev Nephrol. 2014;10(8):433–44. [PubMed: 24914583]

JAUTĀT VAIRĀK:david.deng@wecistanche.com