Teraherca augstas izšķirtspējas spektroskopija Termiskā sadalīšanās gāzes produkti Diabētiskās un nediabētiskās asins plazmas un nieru audu granulas
Mar 28, 2022
Kontaktpersonu:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstrakts
Nozīmīgums:Viena no mūsdienu tendencēm medicīniskajā diagnostikā ir balstīta uz metabolomiku - pieeju, kas ļauj noteikt metabolītus, kas var būt slimības īpatnības. Augstas izšķirtspējas gāzu spektroskopija ļauj izpētīt gāzes metabolītu saturu bioloģiskas izcelsmes paraugos. Mēs piedāvājam diabēta un ne-diabēta bioloģisko paraugu izpētes metodes izstrādi, kas sagatavoti kā granulas, ar terahercu (THz) augstas izšķirtspējas spektroskopiju.
Mērķis:Darba galvenā ideja ir izpētīt diabēta un nediabētiskā žāvētu gāzu termiskās sadalīšanās gāzes produktu saturuasins plazmaunnieru audilai atklātu gāzes marķieru komplektu, kas raksturoja diabētu ar THz augstas izšķirtspējas spektroskopijas metodi.
Pieeja:Mēs piedāvājam pieeju, lai pētītu diabēta slimnieku un nediabētabuasins plazma(cilvēki un žurkas) unnieru audi(žurkām), izmantojot augstas izšķirtspējas spektroskopiju, kuras pamatā ir THz frekvenču diapazona nestacionārā ietekme. Tika izstrādātas metodes asins un nieru audu paraugu sagatavošanai granulu veidā un paraugu iztvaicēšanai.
Rezultātus:Tvaika rotācijas absorbcijas spektru mērījumi, sildot no asinīm pagatavotas granulas unnieru auditika veikti 118 līdz 178 GHz frekvenču diapazonā. Tika konstatētas un identificētas absorbcijas līnijas, kas parādās parauga tvaiku spektros. Termiskās sadalīšanās produktu molekulārais saturs atšķīrās paraugiem, kas nav diabēta slimnieki un diabētiskās vielas; piemēram, galvenais marķieris ir acetons, kas parādās diabētiskā asinīs (cilvēku un žurku) un diabēta slimniekiemnieru audi.
Secinājumi: Mūsu raksts ilustrē iespējamo spēju noteikt metabolītu saturu bioloģiskajos paraugos diagnostikai un slimību prognozi klīniskajai medicīnai. © Autori. Publicējis SPIE saskaņā ar Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Lai pilnībā vai daļēji izplatītu vai reproducētu šo darbu, ir pilnībā jāattiecina oriģinālā publikācija, tostarp tās DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Atslēgvārdi: augstas izšķirtspējas terahercu spektroskopija; termiskā sadalīšanās; audi;asins plazma; diabēts; liofilizācija.
Atslēgvārdus:augstas izšķirtspējas teraherca spektroskopija; termiskā sadalīšanās; asins plazma; diabēts; liofilizācija, nieru audi.
1 Ievads
Mūsdienās sociāli svarīgu slimību (diabēta, vēža slimību u.c.) diagnostikas problēma, ieskaitot agrīno stadiju, piesaista lielu zinātnisko grupu uzmanību pasaulē.Viena no jaunajām pieejām, kas paver jaunas iespējas dažādu slimību diagnostikā un ārstēšanā, ir metabolomika. Metabolomika ir zinātnes joma, kas pēta bioloģiskās sistēmas (šūnu, orgānu vai visa organisma) galīgos un starpposma vielmaiņas produktus. Metabolomika var atklāt metabolītus, kas var būt slimības specifiskās iezīmes, un tiem var būt liela nozīme slimības diagnostikā un prognozē. Barotnes, kas satur cilvēka organismā esošos gala un starpproduktus metaboliskos produktus un ir noderīgas metabolītu, kas saistīti ar slimībām un patoloģijām, atklāšanā, ir izelpota elpa, asinis, urīns, siekalas utt.
Viena no sociāli svarīgām slimībām, kas apdraud cilvēku dzīves kvalitāti, ir diabēts. 2. tipa cukura diabēts iepriekš bija pusmūža slimība, bet tagad tā tiek diagnosticēta pieaugušajiem, jauniešiem un bērniem. Metabolomicisko pētījumu rezultāti, kas iegūti, veicot asins un urīna paraugus diabēta pacientiem no 18 gadu vecuma, kā arī bērniem vecumā no 1 līdz 13 gadiem, ir parādīti Cilvēka metaboloma datu bāzē (HMDB).1 Galvenokārt tika pētītas asinis (21 ķīmiska viela, ieskaitot izomērus), urīns (30 ķīmiskas vielas, ieskaitot izomērus) un cerebrospinālais šķidrums (1 ķīmiska viela). Piemēram, (R)-3-hidroksisviestskābe tika konstatēta visos trīs veidu šķidrumos. Dažas vielas (acetoetiķskābe, D-fruktoze un D-glikoze) tika konstatētas abos šķidrumos (asinīs un urīnā). Raksturīgākā diabēta iezīme (acetons, CH3COCH3) bija tikai urīnam. Šķidrumu paraugi, HMDB iesniegto pētījumu rezultāti, ir pētīti ar dažādām metodēm — gāzu hromatogrāfiju;2 gāzu hromatogrāfiju ar masspektrometriju;3,4 gāzes-šķidruma hromatogrāfiju ar masas spektrometriju;5 kodolprotonu magnētiskās rezonanses augstas izšķirtspējas spektroskopiju;6 un metodēm, kurās izmanto īpašas diabēta pacienta stāvokļa uzraudzības ierīces, nepārtrauktas glikozes uzraudzības sistēmu.7
Hroniskas nieru slimības attīstība ir liela cukura diabēta komplikācija. Lai gan glikozēta albumīna noteikšana ir izplatīta pieeja skrīningam, nieru bojājums var sākties ilgi pirms klīniski nozīmīgu izmaiņu parādīšanās urīna albumīnā. Ņemot vērā hroniskas nieru slimības daudzfaktoru patoģenēzi, tās skrīningam ir apsvērti dažādi marķieri.8,9 Tomēr to diagnostiskā vērtība bez nieru biopsijas šķita apšaubāma.
Spektroskopiskā pieeja var sniegt informāciju par bioloģisko paraugu saturu, ko var izmantot medicīniskajai diagnostikai. Terahercu (THz) frekvenču diapazons ir ļoti svarīgs dzīvo organismu gāzu, šķidrumu un audu izpētei. Ir daži pārskati, kas veltīti THz frekvenču diapazona metožu lietojumiem, tostarp THz laika domēna spektroskopijai, THz reflektorometrijai un THz attēlveidošanai bioloģijai un medicīnai.10
THz laika domēna spektroskopija ļauj noteikt spektrus, kur absorbcijas koeficientam vai refrakcijas indeksam ir dažas spektrālas iezīmes, kas atbilst dažu biomolekulu (olbaltumvielu, cukuru uc) klātbūtnei paraugos vai to dažādajām koncentrācijām.11
Molekulārās absorbcijas spektroskopija un jo īpaši THz gāzu spektroskopija ir ļoti daudzsološa pieeja dažādu izcelsmes daudzkomponentu gāzu maisījumu izpētei.12 Paraugus šķidrā un cietā stāvoklī var izpētīt, iztvaicējot vai termiski sadaloties. Sociāli nozīmīgu slimību (diabēta, vēža u.c.) metabolītus-marķierus var atklāt ar tā spektrālajām līnijām absorbcijas spektros, kas veikti, pārnesot starojumu caur gāzes paraugiem.
Acetona līmenis izelpotās elpas un urīna paraugos, kas ņemti no diabēta pacientiem (12 cilvēki), tika mērīts, izmantojot terahercu diapazona spektrometru ar darbības starojuma fāzes nobīdes taustiņu. Eksperimenti tika veikti sadarbībā ar Almazovas Nacionālo medicīnas pētījumu centru. Mērījumi tika veikti acetona absorbcijas līnijās ar centrālajām frekvencēm 150,537 un 151,647 GHz. Mērījumi tika veikti bez sildīšanas. Vienlaicīga diabēta pacientu izelpotās elpas un urīna paraugu analīze atklāja, ka acetona līmenis urīnā bija daudz augstāks nekā izelpotajā elpā, dažos gadījumos par vienu pakāpi augstāks.13,14
THz augstas izšķirtspējas gāzes spektroskopijas pētījumu rezultātiasins plazmapacientu un žurku (nosacīti veseli un ar cukura diabētu), kā arī žurkunieru audi(veselīgi un ar cukura diabētu) tiek žāvēti un piespiesti pie granulām. Audi vaiasins plazmano dzīviem organismiem bez jebkādiem preparātiem jāizpēta tūlīt pēc paraugu ņemšanas. Sagatavošana granulu veidā ļauj veikt izmeklēšanu pēc pietiekami ilga laika pēc asins paraugu ņemšanas vai nieru biopsijas.
2 Eksperimenti un metodika
2.1Asins plazmas granulu un nieru granulu sagatavošanas metode
Venozās asinis no pacientiem ar 2. tipa cukura diabētu un nosacīti veseliem dalībniekiem tika savāktas Almazovas Nacionālā medicīnas pētījumu centra Endokrinoloģijas nodaļā; centrs nodrošina medicīnisko aprūpi diabēta pacientiem. Trīs pacienti un divi dalībnieki bija vīrieši, kas atbilda vecumam (vecumā no 39 līdz 43 gadiem). Visus šajā pētījumā izmantotos eksperimentālos protokolus pārskatīja un apstiprināja pacienti un dalībnieki, kā arī Medicīnas centra lietošanas komisija. Venozās asinis tika savāktas no rīta pēc 8 līdz 12 stundu badošanās mēģenē ar antikoagulantu K3EDTA (Vacutest Kima, Itālija). Plazma tika iegūta bioķīmisko parametru analīzei, centrifugējot nesadalītas asinis pie 3000 apgr./min 15 minūtes laboratorijas centrifūgā (Eppendorf 5702R, Vācija) þ4°C temperatūrā. Bioķīmisko parametru vērtībasasins plazmaparaugi un atsauces intervāli ir parādīti 1. tabulā (glikozētā hemoglobīna līmenis tika iegūts uz veselām asinīm). 1. tabulā redzams, ka glikozes, triglicerīdu un glikozētā hemoglobīna koncentrācija diabēta pacienta paraugos palielinās attiecīgi 1,5, 2 un 2,3 reizes.
Pētījums tika veikts arī ar Wistar žurku tēviņiem 8 nedēļu vecumā un ķermeņa masu no 180 līdz 200 g, saskaņā ar eksperimentālo pētījumu protokolu, ko apstiprinājusi Eksperimentālās medicīnas institūta Almazovas Nacionālā medicīnas pētījumu centra Dzīvnieku aprūpes un lietošanas komisija. Glikozes līmenis eksperimentālās grupas dzīvniekiem bija 21 mmol ∕ l pēc 120 minūtēm pēc glikozes slodzes. Neskartas žurkas tika izmantotas kā kontroles grupa. Venozās asinis tika savāktas no zemākas vena cava, pirms dzīvnieki tika eitanizēti. Arī nieres tika novāktas. Asins paraugi tika savākti mēģenēs, kas satur antikoagulantu.
Testa paraugi tika sasaldēti temperatūrā−80 °C (zemas temperatūras ledusskapis DW-86L388A, Haier, Ķīna). Tad tas tika liofilizēts, sasaldējot žāvējot Vaco 2 (ZirBus, Vācija) temperatūrā−50 ° C un 3 Pa spiediens. Pirms liofilizācijas tiek veikta sasalšana, jo liofilizācijas laikā augsta iekšējā spiediena ietekmē bioloģiskos komponentus var iznīcināt. Žāvēti paraugi bija sūklis, kas sastāvēja no bioloģiskiem kristāliem. Sūkli iznīcināja metāla lāpstiņa un sasmalcināja līdz kristāliem, kuru izmērs bija vairāki desmiti mikrometru. Javas un piestas izmantošana nebija iespējama, jo olbaltumvielu slīpēšana paraugu sastāvā novestu pie to nevēlamas saķeres un apaļu granulu veidošanās.
Liofilizēto paraugu pulveri nosvēra (analītiskais līdzsvars OHAUS Discovery, Šveice) un pēc tam ievietoja tērauda presēšanas veidnē. Izmantojot laboratorijas preses (Angkor, Krievija un Specac, UK) pie noteikta formēšanas spiediena,asins plazmatika iegūtas granulas un nieru granulas. Katrs granulu kristāls satur noteiktu procentuālo daudzumu tauku (triglicerīdu), olbaltumvielu (albumīna) un fibrinogēna - tie visi ir normāli vai glikēti (diabēta gadījumā). Paraugu granulas no kontroles grupas še turpmāk sauktas par "nediabētiskām granulām" un paraugu granulas nodiabētiskā grupa turpmāk saukta par "diabētiskām granulām".
2,2 THz augstas izšķirtspējas spektroskopijas eksperimentālā iestatīšana
Augstas izšķirtspējas THz spektroskopija, kas balstīta uz nestacionāriem efektiem, ļauj analizēt gāzes un tvaiku daudzkomponentu gāzu maisījumu komponentu sastāvu. Spektrometri nodrošina jutību tuvu teorētiskajai robežai ar izšķirtspēju, ko ierobežo tikai Doplera efekts, un var ierakstīt ātrus procesus. Jutīgums tiek saglabāts pat ar ievērojamu gāzes spiediena samazināšanos un ir aptuveni 0,2 ppb dažu gāzu skenēšanas režīmā (piemēram, amonjaks absorbcijas līnijas mērījumos tuvu 572 GHz frekvencei). Turklāt tas ļauj noteikt gāzes maisījuma komponentu sastāvu ar augstu uzticamību.12 Tika veikts granulu termiskās sadalīšanās produktu pētījums, izmantojot THz nestacionārās gāzes spektroskopijas metodi no 118 līdz 178 GHz diapazona THz. Spektrometrs izmanto fāzes bloķētu cilpu, lai automātiski kontrolētu atpakaļgaitas viļņu lampas frekvenci un fāzes nobīdi, reģistrāciju laika domēnā, vidējo vērtību un spektroskopiskā pārejas signāla apstrādi. Ierīce reģistrē signālu laika domēnā. Paraugu tvaiki tika analizēti, izmantojot šādu procedūru. Granulas tika ievietotas mēģenē, izmantojot vakuuma sūknēšanu, pakāpeniski uzkarsēja mēģeni (līdz 240 °C) un iegūtais parauga termiskās sadalīšanās produktu maisījums tika ievietots mērīšanas kamerā. Datu failā parasti ir iekļauti ieraksti par izvēlēto vai no spektrometra kopējā darbības diapazona. Tāpēc vielas var identificēt pēc absorbcijas līnijām, kas parādās parauga kopējā spektrā, un koncentrāciju dinamiku maisījumā var izsekot, salīdzinot vairākus datu failus. Vielas tika identificētas, meklējot tās atvērtā pirmkoda MW, mmw un THz datu bāzēs.15,16
3 Asins plazmas tvaiku un nieru tvaiku analīze, izmantojot augstas izšķirtspējas teraherca spektrometru
Ar mūsu THz-TDS sistēmām mēs mērījām granulu pārraidi spektrālajā diapazonā no 0,2 līdz 1,4 THz,17, bet mēs zinām, ka biomolekulām un jo īpaši to sadalīšanās produktiem gāzes stāvoklī ir informatīva reakcija (rotācijas absorbcijas spektri) šajās frekvencēs un arī zemāk, tāpēc mēs veicām papildu pētījumu par THz augstas izšķirtspējas gāzes spektrometru. Konstatētās vielu absorbcijas līnijas diabēta slimniekamasins plazmasakrīt ar nondiabētiska cilvēka vielāmasins plazma, izņemot acetonu. Spektrometra darba frekvenču diapazonā (no 118 līdz 178 GHz) atrodas daudzas acetona absorbcijas līnijas. Parasti tas ir vairāk nekā pietiekami, lai noteiktu kādu vienas vielas absorbcijas līniju, lai nepārprotami noteiktu vielas klātbūtni daudzkomponentu gāzu maisījumā. Absorbcijas spektru daļu reģistrēšanas piemērs ar acetona absorbcijas līniju ir parādīts 1. attēlā. Acetons var parādīties asinīs, ja rodas ogļhidrātu vielmaiņas traucējumi. Kā norādīts literatūrā, diabēta pacientu asinīs bija β-OH-butirāta un acetoacetāta, bet vēlāk šīs vielas sadalījās acetonā un oglekļa dioksīdā.18 Oglekļa dioksīdam nav dipola momenta; tāpēc tam nav rotācijas pāreju. Tā palielināto saturu var noteikt, tikai pētot parauga vibrācijas spektru IR diapazonā.
Plazmas tvaika vielas, piemēram, karbonilsulfīds (OCS), sēra dioksīds (SO2), skudrskābe (HCOOH), izocianskābe (HNCO) un amonjaks (NH3), tika konstatētas gan cilvēka diabēta, gan cilvēka nediabēta paraugos. Dažos gadījumos parauga spektros ir konstatēta viena eksperimentāla līnija, kas atbilst vairākām rindām nekā viena līnija par vienu vielu (piemēram, izocianskābi) kataloga datos (sk. 2. tabulu).15,16
Tas izskaidrojams ar to, ka katalogos ir dati par tādu vielu hipershīna struktūrām, kuras šajā eksperimentā nav atrisinātas, jo līnijām ir ierobežots platums vairāku simtu kHz secībā. Iegūtās pētāmo vielu absorbcijas līnijas sakrīt ar kapilāru asiņu tvaiku absorbcijas spektriem unasins plazmapacientu ar cukura diabētu un nosacīti veseliem dalībniekiem, kas tika publicēti mūsu iepriekšējā darbā.19 Atklātās gāzveida vielas varēja veidoties paraugu sagatavošanas laikā kā aminoskābju ķīmiskās transformācijas produkti. Jautājums par to, vai šiem savienojumiem ir diagnostiska vērtība, prasa izpēti. Klīniskajā praksē diabetoloģijā šo vielu satura analīze vēl netiek izmantota.
Tvaikiasins plazmaveselām žurkām bija karbonilsulfīds (OCS), metānstiols(CH3SH), butironitrils (C3H7CN), acetaldehīds (CH3CHO) un skudrskābe (HCOOH). Paraugs noasins plazmadiabētiskās žurkas atšķīrās no acetona klātbūtnes. Papildus propionitrila (C2H5CN) absorbcijas līnijām tika noteikts metilformiāts (CH3OCHO).
Veselīgu un diabētisku žurku žāvētu granulu tvaiku parauginieru auditika pētīti. Tvaikinieru audiveselas žurkas satur karbonilsulfīdu (OCS), sēra dioksīdu (SO2), skudrskābi (HCOOH), izocianskābi (HNCO), etilformiātu (C2H5OCHO) un propilēnglikolu (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Tvaika saturs diabēta žurkāmnieru audino veselām žurkām atšķīrās ne tikai ar karbonilsulfīda (OCS), bet arī tā izotologa OCS-34 klātbūtni. Acetaldehīds (CH3CHO), metānstiols (CH3SH), etilēna sulfīds (C2H4S), metanols (CH3OH) un glikonaldehīds (CH2ðOHÞCHO) tika konstatēti arī diabēta žurku granulu tvaikosnieru audi(sk. 2. att. un 3. att.).
Sēra savienojumu, piemēram, metāna, klātbūtni var noteikt sēra aminoskābju (metionīna, cisteīna un cistīna) termiskā sadalīšanās asins olbaltumvielu sastāvā. Metionīns ir būtiska aminoskābe, kas nav sintezēta cilvēka organismos. To iegūst no pārtikas un ir sēra avots cisteīna biosintēzei. Kad sēra aminoskābes tika uzkarsētas līdz aptuveni 240°C temperatūrai, šo vielu masas spektrā tika konstatēts metānstiols un etilēna sulfīds (metionīna sadalīšanās).20
4 Secinājums
Cilvēka un žurku molekulārais satursasins plazmaun žurkasnieru audiparaugu termiskās sadalīšanās laikā tika pētīts, izmantojot THz augstas izšķirtspējas spektrometru. Tika uzrādīta metode bioloģisko paraugu sagatavošanai par granulām. Šī metode dod iespēju uzglabāt un transportēt paraugus. Augstas izšķirtspējas gāzes spektroskopija ļauj noteikt jebkuras izcelsmes daudzkomponentu gāzu maisījumu saturu, ieskaitot bioloģisko ar nelielu gāzes komponentu koncentrāciju. Acetons tika atklāts diabēta slimniekiemasins plazmaParaugus. Informācija par diabēta un veselīga satura atšķirībāmasins plazmavīriešu un žurku, kā arī diabētiskās un veselās žurkasnieru auditika iegūts no tvaiku absorbcijas rotācijas spektriem. THz augstas izšķirtspējas spektroskopijas izmantošana nodrošina asins tvaiku paraugu komponentu satura kvalitatīvu analīzi unnieru audiGranulas. Iespēja veikt svarīgu diabēta gāzes marķieru koncentrācijas kvantitatīvu novērtējumu atkarībā no pacientu stāvokļajāizpēta turpmākajās izmeklēšanās.
