Cistanche aktīvā sastāvdaļa: ehinakozīds uz pretiekaisuma inhibīcijas un neiroprotektīvas iedarbības

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com

ehinakozīds, an Aktīvs Sastāvdaļas no Cistanche Herba, Izdara a Neiroprotektīvs Efekts iekšā a Kainic Skābe Žurka Modelis autors InhibējošsIekaisīgs Procesi un Aktivizēšana uz Akt/GSK3 Ceļš

Cheng Wei Lu, a, b Hsi Lung Hsieh, c, d Tzu Yu Lin, a, b Ting Yang Hsieh, e Shu Kuei Huang, a un Su Jane Wang^*,f,g

Ehinakozīdsir galvenais Cistanche Herb savienojums, un tam ir glutamāta izdalīšanos kavējoša aktivitāte smadzenēs. Ņemot vērā eksitotoksicitātes iesaistīšanos epilepsijas patofizioloģijā, ko izraisa masīvs glutamāts, mēs pētījām ehinakozīda pretepilepsijas iedarbību uz kaiīnskābes izraisītiem krampjiem žurkām. Žurkas ir ievadītas intraperitoneāliehinakozīds30 minūtes pirms intraperitoneālās injekcijas ar kaīnskābi. Rezultāti parādīja, ka kaīnskābes izraisīti krampjiem līdzīgi uzvedības modeļi, palielināja glutamāta koncentrāciju, izraisīja neironu zudumu un mikroglia aktivāciju, kā arī stimulēja proinflammatorisko citokīnu gēnu ekspresiju hipokampā. Tika konstatēts, ka šīs kaīnskābes izraisītās izmaiņas mazinaehinakozīdspirmapstrāde. Turklāt ehinakozīda pirmapstrāde tika novērsta samazinātā Akt un glikogēna sintāzes kināzes 3 (GSK3) fosforilēšanās, kā arī Bcl-2 ekspresija hipokampā. Šie rezultāti parāda, ka ehinakozīds iedarbojas pret epilepsiju un neiroprotektīvu kaiīnskābes žurku modelī, nomācot iekaisuma reakciju un aktivizējot Akt / GSK3 signālu pārraidi. Tāpēc šis pētījums liecina, ka ehinakozīds ir potenciāli noderīgs epilepsijas profilaksē.

Atslēgvārdi:ehinakozīds; kaīnskābe; epilepsija; neiroprotektīva iedarbība; hipokamps

Ehinakozīds cistancē

Epilepsija ir izplatīts smadzeņu darbības traucējums visā pasaulē. Tas skar vairāk nekā 65 miljonus cilvēku, gandrīz 1 procentu no pasaules iedzīvotājiem.1) Sintētiskās pretepilepsijas zāles ir plaši pieejamas farmācijas tirgū; tomēr šīs zāles ir efektīvas tikai 60–70 procentiem pacientu un tām ir nevēlamas blakusparādības.2–4) Tādējādi ir neapmierināta nepieciešamība meklēt efektīvākas un drošākas zāles. Ārstniecības augi ir potenciāls šādu savienojumu avots.^5,6)

Tradicionālajā ķīniešu augu izcelsmes medicīnā Cistanche Herba jau sen ir izmantota epilepsijas ārstēšanai.7,8)Ehinakozīdsir galvenā Cistanche Herba9 sastāvdaļa, un tai ir daudzas farmakoloģiskas īpašības, piemēram, antioksidanta, pretiekaisuma, pretaudzēju, hepatoprotektīva un imūnmodulējoša iedarbība.10,11) Turklāt ir ziņots, kaehinakozīdsvar iekļūt smadzenēs un izraisīt neiroprotekciju.12–16) Iepriekš mēs pierādījām, ka ehinakozīds samazina glutamāta izdalīšanos žurku smadzeņu garozas nervu galos.17) Tā kā glutamāts ir galvenais ierosinošais neirotransmiters zīdītāju smadzenēs un tam ir izšķiroša nozīme epilepsijas patofizioloģijā, 18, 19), mēs ierosinājām, ka ehinakozīdam ir pretepilepsijas aktivitāte. Lai noskaidrotu šo hipotēzi, šajā pētījumā tika izmantots kaīnskābes žurku modelis.

Kaiīnskābe ir glutamāta atvasinājums, un tās vienreizēja sistēmiska injekcija grauzējiem izraisa krampjus, neironu iekaisumu un neironu deģenerāciju vai nāvi selektīvās neironu populācijās smadzenēs.20–22) Šīs patoloģiskās izmaiņas ir līdzīgas cilvēka temporālās daivas epilepsijai.23 ,24) Parasti tiek uzskatīts, ka kaīnskābes ievadīšana grauzējiem izraisa atbilstošu epilepsijas modeli. Līdz šim neviens pētījums nav pētījis pretepilepsijas un neiroprotektīvās īpašībasehinakozīdskaīnskābes injicētā dzīvnieku modelī. Tāpēc mūsu pētījuma mērķis ir novērtēt ietekmi un tā iespējamo mehānismuehinakozīdsiepriekšēja ievadīšana ar kaīnskābi ārstētām žurkām.

MATERIĀLI UN METODES

Dzīvnieki un krampju darbība

Visā pētījumā tika izmantoti Sprague-Dawley žurku tēviņi (BioLASCO, Taipeja, Taivāna), kas sver 150–200 g. Žurkas nejauši tika iedalītas četrās grupās šādi: i) 1. grupa: grupa, kas apstrādāta ar dimetilsulfoksīdu (kontrole); ii) 2. grupa: ar kaīnskābi apstrādāta grupa; iii) 3. grupa:ehinakozīds10 mg/kg plus kaīnskābes grupa; iv) 4. grupa:ehinakozīds50 mg/kg plus kaīnskābes grupa. Ehinakozīds (ChemFaces, Uhaņa, ĶTR) tika injicēts (intraperitoneāla ievadīšana) 30 minūtes pirms kaīnskābes (15 mg/kg) intraperitoneālās injekcijas. Krampju aktivitāte tika novērtēta 4 stundu laikā pēc kaīnskābes injekcijas saskaņā ar Racine skalu.25) Deva un ievadīšanas shēma tika izvēlēta, pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem.22,26,27) Eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja institūcija. Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja Fu Jen Katoļu universitātē un tika veikta saskaņā ar izdotajiem protokoliem, kas sekoja Nacionālo veselības institūtu laboratorijas aprūpes un lietošanas rokasgrāmatai (NAC 2011).

Glutamāta līmeņa noteikšana

Četras stundas pēc kaīnskābes apstrādes žurkas tika nogalinātas, nogriežot galvas. Visas smadzenes tika sadalītas, un katras žurkas hipokamps tika savākts analīzei. Glutamāta koncentrācija smadzeņu hipokampa audos tika noteikta pēc iepriekšējos pētījumos aprakstītajām metodēm.28,29)

Neitrāls sarkans un fluoro-Jade B krāsojums

Trīs dienas pēc kaīnskābes injekcijas žurkas tika anestēzētas, izmantojot hlorhidrātu (65{2}} mg/kg) un transkardiāli perfūzētas ar fiksējošu šķīdumu, kas satur 4 procentus paraformaldehīda 0,1 M fosfāta buferšķīdumā (PBS, pH 7,4). Smadzenes tika izņemtas tūlīt pēc perfūzijas un uzglabātas 4% paraformaldehīdā nakti 4 grādu temperatūrā. Pēc pēcfiksācijas smadzenes 24 stundas iegremdēja ar 30% saharozes 4 grādu temperatūrā. Paraugi tika ātri sasaldēti, un, izmantojot saldētu mikrotomu, tika izgrieztas 30-µm biezas sekcijas. Brīvi peldošās sekcijas tika iekrāsotas ar neitrālu sarkanu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) un Fluoro-Jade B (Millipore, CA, ASV). Fluor-Jade B pozitīvās šūnas hipokampa CA3 reģionā tika noteiktas, kā aprakstīts iepriekš.^30,31)

Imūnhistoķīmija

Sekcijas tika mazgātas ar {{0}},1 M PBS un bloķētas ar 0,5 procentiem normālu kazas serumu {{20}},1 M PBS. istabas temperatūrā. Primārās antivielas (peles monoklonālā anti-OX-42 antiviela, 1:1000; AbD Serotec, Oksforda, Apvienotā Karaliste) inkubācija tika veikta divas nakti 4 grādu temperatūrā. Pēc atkārtotas mazgāšanas ar PBS, sekcijas inkubēja ar biotinilētu anti-peļu imūnglobulīnu G (IgG) (1: 200) 90 minūtes, apstrādāja ar avidīna-biotīna kompleksa (ABC) šķīdumu (1: 1000) 1 stundu telpā. temperatūrā un reaģēja ar 0,025 procentiem 3,3′-diaminobenzidīna un 0,0025 procentiem H2O2, līdz tika sasniegta vēlamā traipu intensitāte. Sekcijas tika uzstādītas uz priekšmetstikliņiem, izmantojot standarta protokolus. Iekrāsotie priekšmetstikliņi tika pārbaudīti un attēloti mikroskopā (Olympus, Tokija, Japāna).31) Mikroglia šūnas ķermeņa un procesa ilguma analīze tika veikta ar ImageJ.³²)

Transmisijas elektronu mikroskopija Transmisijas elektronu mikroskopija

tika veikta, kā aprakstīts iepriekš.33) Īsumā, hipokampa CA3 reģions tika noņemts un fiksēts buferšķīdumā, kas satur 4 procentus paraformaldehīda un 2,5 procentus glutaraldehīda 4 grādu temperatūrā 24–36 stundas. Pēc mazgāšanas ar PBS, CA3 reģioni tika fiksēti 1% osmija tetroksīdā 2 stundas, dehidrēti ar etanolu un iestrādāti epoksīda sveķos. Īpaši plānas sekcijas (70 nm) tika sagatavotas, izmantojot ultramikrotomu (EM UC7, Leica Microsystems, Wetzlar, Vācija). Sekcijas tika iekrāsotas ar uranilacetātu un svina citrātu un novērotas, izmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju (modelis JEM-1400, JEOL Ltd., Tokija, Japāna).

Kvantitatīvā reāllaika PCR

RNS ekstrakcija un reāllaika kvantitatīvā PCR tika veikta, kā aprakstīts iepriekš.34,35) Kopējā RNS tika ekstrahēta no hipokampa, izmantojot mirVana™ miRNA izolācijas komplektu (Life Technologies, Grand Island, NY, ASV), ievērojot ražotāja protokolu. Genomiskā DNS tika noņemta, inkubējot ar dezoksiribonukleāzi (DNāzi) I. cDNS tika sintezēta ar (NoScript reversās transkripcijas sistēmas komplektu; Promega, Madison, WI, ASV) un izmantota SYBR Green (Roche Diagnostics, Manheima, Vācija) kvantitatīvās reālās- laika PCR amplifikācija ar specifiskiem primeriem, izmantojot LightCycler 480 sistēmu (Roche Diagnostics). Protokols sastāvēja no sākotnējās denaturēšanas soļa 95 grādos 3 minūtes, kam sekoja 45 denaturēšanas cikli 95 grādos 10 sekundes, atkvēlināšanu 56 grādos 30 sekundes. Katra mērķa gēna mRNS līmenis tika normalizēts līdz gliceraldehīda-3-fosfātdehidrogenāzes (GAPDH) mRNS līmenim. Salocīšanas indukcija tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCT metodi, kā aprakstīts iepriekšējā pētījumā.³⁴)

Imūnblotēšana

Divdesmit mikrogramus proteīna ekstraktu no hipokampiem atdalīja ar 10% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE), kam sekoja elektroforēzes pārnešana uz polivinilidēna difluorīda (PVDF) membrānu. Membrāna tika bloķēta, izmantojot 5% vājpienu 1 stundu istabas temperatūrā, un inkubēja ar atbilstošām antivielām 1% vājpienā nakti 4 ° C temperatūrā, kam sekoja inkubācija ar sekundāro antivielu 1 stundu. Primārās antivielas bija trušu monoklonālās antivielas, kas vērstas pret Akt (1: 2000), pAktSer473 (1: 2000), glikogēna sintāzes kināzi 3 (GSK3 ) (1: 2000), pGSK3 Ser9 (1: 500), Bcl (-2). 1: 1000), un -aktīns (1: 2000), kas iegūts no Cell Signaling Technology (MA, ASV). Sekundārā ar peroksidāzi konjugētā kazas anti-truša antiviela (1: 5000) tika iegūta no Santakrusas (CA, ASV). Joslas tika vizualizētas ar uzlabotu ķīmisko luminiscenci (Amersham, Bekingemšīra, Apvienotā Karaliste), izmantojot gēla attēlveidošanas analīzes sistēmu. Katras joslas intensitāte tika mērīta, izmantojot Syngene programmatūru (Synoptics, Kembridža, Apvienotā Karaliste).

Statistiskā analīze

Dati tiek parādīti kā vidējā ± standarta kļūda (SEM). Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot divpusējo Stjudenta t-testu, salīdzinot divas grupas, un vienvirziena ANOVA ar Tukey vairāku salīdzinājumu post hoc testiem, salīdzinot vairāk nekā divas grupas. Analīze tika pabeigta, izmantojot SPSS programmatūru (versija 17.0; SPSS Inc., Čikāga, IL, ASV). lpp<0.05 was="" considered="" statistically="">

REZULTĀTI

Ehinakozīda ietekme uz kaiīnskābes izraisītiem krampjiem un hipokampu glutamāta līmeņa paaugstināšanos

Lai novērtētu neiroprotektīvo iedarbībuehinakozīdspret kaīnskābes izraisītu eksitotoksicitāti, žurkas tika iepriekš apstrādātas arehinakozīds(5, 10 un 50 mg/kg, intraperitoneāla ievadīšana) 30 minūtes pirms kaīnskābes (15 mg/kg) intraperitoneālās injekcijas. Kaiīnskābes (15 mg/kg) intraperitoneāla injekcija izraisīja krampjus ar latentumu un rādītājiem attiecīgi 92,5±5,3 min un 4,9±0,1 (1.A un B att.). Ievērojams lēkmju latentuma pieaugums[F(2, 43)=40.2, lpp.<0.01; fig.="" 1a]="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" seizure="" score="" [f(2,="" 40)="21.5,"><0.001; fig.="" 1b]="" were="" observed="" in="" echinacoside="" (10="" or="" 50="" mg/kg)-pretreated="" rats.="" however,="" echinacoside="" at="" 5="" mg/kg="" had="" no="" significant="" effect="" on="" seizure="" latency="" and="" score="" (p="">0.05; zīm. 1A, B). Ņemot vērā krampju aktivitātes spēcīgo pavājināšanos, kas tika novērota ar 10 vai 50 mg/kg ehinakozīda, šīs divas ehinakozīda devas tika izmantotas turpmākajos eksperimentos, lai novērtētu mehānismus, kas ir pamatā ehinakozīda spējai inhibēt kaīnskābes izraisītus krampjus. 1C attēlā parādīts, ka hipokampu glutamāta līmeņa paaugstināšanās tika novērota žurkām, kas ārstētas ar kaīnskābi 4 stundu laikā, salīdzinot ar grupu, kas apstrādāta ar dimetilsulfoksīdu (kontrole; p<0.001). however,="" decreased="" hippocampal="" glutamate="" levels="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" (10="" or="" 50="" mg/kg)="" [f(3,="" 16)="6.1,"><0.01; fig.="">

Ehinakozīda ietekme uz kaiīnskābes izraisītiem neironu bojājumiem Hipokampa CA3 reģionā

Neironu bojājuma pakāpe tika novērtēta 3 dienas pēc kaīnskābes injekcijas, izmantojot neitrālu sarkanu krāsojumu vai Fluoro-Jade B, lai noteiktu attiecīgi izdzīvojušos neironus un deģenerējošos neironus. Neitrāla sarkanā krāsošana atklāja acīmredzamu neironu zudumu CA3 žurkām, kurām tika injicēta kainskābe, salīdzinot ar žurkām, kas apstrādātas ar dimetilsulfoksīdu (kontrole; p<0.001; figs.="" 2a,="" c).="" however,="">ehinakozīdspirmapstrāde (10 vai 50 mg/kg) efektīvi samazināja kaīnskābes izraisīto neironu zudumu CA3 [F(2, 13)=11.6, p.<0.001; figs.="" 2a,="" c].="" similarly,="">ehinakozīds-ārstētajiem dzīvniekiem pēc kaīnskābes injekcijas bija samazināta Fluoro-Jade B FL fluorescence hipokampa CA3 reģionos (p<0.001), compared="" with="" the="" strong="" damage="" observed="" in="" kainic="" acid-injected="" rats="" [f(2,="" 24)="6.9,"><0.001; figs.="" 2b,="" d].="" in="" addition,="" transmission="" electron="" microscopy="" shows="" that="" neuronal="" injury="" in="" ca3="" was="" not="" obvious="" in="" the="" dimethylsulfoxide-treated="" (control)="" group.="" however,="" in="" the="" kainic="" acid-treated="" group,="" nerve="" cells="" had="" ultrastructural="" changes.="" nerve="" cells="" exhibited="" autophagosome="" formations,="" deformed="" nuclei="" with="" the="" condensed,="" and="" disruptive="" cell="" plasma="" membrane.="" in="" contrast,="" the="" neuronal="" injury="" in="" the="" echinacoside-pretreated="" group="" was="" apparently="" attenuated="" compared="" with="" the="" kainic="" acid-injected="" rats="" (fig.="">

Ehinakozīda ietekme uz kaiīnskābes izraisītu mikrogliju aktivāciju un proinflammatorisku gēnu ekspresiju

Citokīni hipokampā Kaiīnskābes izraisītu krampju un hipokampu neironu nāves modelī hipokampā ir palielināta mikroglia aktivācija un proinflammatoriskā citokīnu ražošana.36,37) Lai izpētītu, vaiehinakozīdsietekmēja iekaisuma reakciju ar kaīnskābi injicētu žurku hipokampā, mikroglia aktivācija tika analizēta, izmantojot anti-OX42 antivielu. Ar dimetilsulfoksīdu apstrādātām žurkām (kontroles grupa) mikroglia šūnu ķermeņi CA3 reģionos bija nelieli, un to procesi bija gari un plāni (4.A att.). Tomēr KA injicētajām žurkām aktivēto mikroglia šūnu skaits CA3 zonā ievērojami palielinājās, mikroglia šūnu ķermeņi tika palielināti (p<0.01; figs.="" 4a,="" b),="" and="" their="" cellular="" processes="" became="" shorter="" and="" thicker=""><0.001; figs.="" 4a,="" c).="" in="" the="" animals="" pretreated="" with="">ehinakozīds(10 vai 50 mg/kg) iepriekš apstrādātām žurkām aktivēto mikroglia šūnu skaits bija ievērojami samazināts, un mikroglia šūnu ķermeņi bija plāni [F(2, 13)=6.2, p.<0.01; fig.="" 4b]="" and="" their="" cytoplasmic="" processes="" were="" ramified="" [f(2,="" 28)="47.5,"><0.001; fig.="" 4c].="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" interleukin-1β,="" interleukin-6,="" and="" tumor="" necrosis="" factor-α="" mrna="" in="" the="" hippocampus="" were="" apparently="" elevated="" at="" 1="" d="" after="" kainic="" acid="" injection,="" compared="" to="" dimethylsulfoxideinjected="" animals="" (control)=""><0.001). however,="" decreased="" mrna="" levels="" for="" these="" pro-inflammatory="" cytokines="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" [interleukin-1β,="" f(3,="" 18)="154.7,"><0.001; interleukin-6,="" f(3,="" 17)="17.9,"><0.001; tumor="" necrosis="" factor-α,="" f(3,="" 16)="31.1,"><0.001; figs.="">

Ehinakozīda ietekme uz kaiīnskābes izraisītu hipokampu fosfo-akt, fosfo-glikogēna sintāzes kināzes 3 un Bcl līmeņa pazemināšanos-2

Fosforilētā Akt (pAkt) (Ser473), fosforilētā GSK3 (pGSK3 ) (Ser9) un Bcl-2 līmenis tika pārbaudīts hipokampā (6. attēls). Būtiska pAkt, pGSK-3 un Bcl-2 ekspresijas samazināšanās hipokampā tika novērota žurkām, kas ārstētas ar kaīnskābi pēc 4 stundām, salīdzinot ar žurkām, kas ārstētas ar dimetilsulfoksīdu (kontrole) (p<0.001). however,="" pretreatment="" with="">ehinakozīds(10 vai 50 mg/kg) ievērojami paaugstināja pAkt, pGSK3 un Bcl-2 līmeni, salīdzinot ar ārstēšanu tikai ar kaīnskābi [pAkt, F(3, 19)=69.5, p.<0.001; pgsk3β,="" f(3,="" 17)="60.3,"><0.001; bcl-2,="" f(3,="" 18)="26.1,"><0.001; figs.="">

DISKUSIJA

Pierādījumi liecina, ka glutamātam ir izšķiroša nozīme epilepsijas patofizioloģijā.^17,18) Epilepsijas glutamaterģiskā hipotēze liecina, ka epileptogēnais process ir saistīts ar paaugstinātu glutamāta koncentrāciju smadzenēs un šī neirotransmitera koncentrācijas samazināšanās spēj radīt pretepilepsijas iedarbību.^38–40) Mūsu laboratorijas pētījums to pierādījaehinakozīdsvar samazināt glutamāta izdalīšanos no nervu galiem, un ierosināja, ka ehinakozīdam, iespējams, ir pretepilepsijas efekts.17) Šis ieteikums tika apstiprināts pašreizējā pētījumā, izmantojot žurkas modeli, kurā injicēta kaīnskābe. Kaiīnskābe, glutamāta atvasinājums, tiek plaši izmantota epilepsijas ierosināšanai pētījumos ar dzīvniekiem, jo ​​tās neiropatoloģiskās un bioķīmiskās īpašības ir līdzīgas cilvēkiem.^23,24)

Kainskābes intraperitoneāla injekcija žurkām izraisa krampjus un neironu bojājumus, īpaši hipokampa CA3 reģionos.^41–43) Turklāt šīs kaīnskābes radītās patoloģiskās izmaiņas ir saistītas ar masveida glutamāta izdalīšanos.^41,44,45) Saskaņā ar šiem atklājumiem mēs novērojām, ka kaīnskābes (15 mg/kg) intraperitoneāla ievadīšana izraisīja krampju uzvedību, palielināja glutamāta līmeni hipokampā un izraisīja piramīdas šūnu zudumu hipokampu CA3 reģionā. Šīs kaīnskābes izraisītās patoloģiskās izmaiņas tika vājinātas, veicot intraperitoneālu pirmapstrādi arehinakozīds(10 vai 50 mg/kg). Turklāt hipokampu CA3 nervu šūnu bojājumus, kas novērtēti ar ultrastrukturālu maiņu ar transmisijas elektronu mikroskopiju, mazinājaehinakozīdskaīnskābes žurkās. Turklāt pēc kaīnskābes ievadīšanas CA3 šūnās tika novērots palielināts autofagosomu skaits. Iepriekšēja apstrāde ar ehinakozīdu nomāca pastiprinātu autofagosomu veidošanos. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka autofagijas aktivācija ir saistīta ar kaīnskābes izraisītu neironu nāvi, un šķiet, ka autofagijas procesa kavēšana ir neiroprotektīva.^46,47) Lai gan mehānisms, kas ir pretepilepsijas efekta pamatāehinakozīdsnepieciešama turpmāka izpēte, ehinakozīda neiroprotektīvo iedarbību kaīnskābes dzīvnieku modelī varēja izraisīt pretepilepsijas aktivitāte, inhibējot glutamāta eksitotoksicitāti un autofagijas aktivāciju.

Neiroiekaisums ievērojami veicina aizkavētu smadzeņu bojājumu pēc akūtas traumas un negatīvi ietekmē neiroloģisko iznākumu.²⁷) Iekaisuma reakcijas, piemēram, mikrogliju aktivācija un iekaisuma citokīnu veidošanās, ir aprakstītas cilvēka epilepsijā un eksperimentālajos epilepsijas modeļos.^36,48Turklāt šo iekaisumu veicinošo citokīnu izdalīšanās no aktivētajām mikroglia šūnām veicina kaīnskābes izraisītus neironu bojājumus hipokampā.^36,37) Mēs parādījām, ka, lai gan kaīnskābe palielināja mikrogliju aktivāciju un proinflammatorisko citokīnu (interleikīna-1, interleikīna-6 un audzēja nekrozes faktora) aktivizēšanos hipokampā, šīs sekas tika nomāktasehinakozīdspirmapstrāde. Tāpēc mēs to iesakāmehinakozīdsnomācot iekaisuma procesus, var veicināt tā pretepilepsijas un neiroprotektīvo iedarbību kaīnskābes dzīvnieku modelī. Kā jau tika novērots mūsu iepriekšējos pētījumos, vairākām zālēm un dabīgiem produktiem ir arī pretepilepsijas iedarbība un neiroaizsardzība pret kaīnskābes izraisītiem krampjiem, izmantojot to pretiekaisuma iedarbību.^31,33,35)

Ir zināms, ka kainskābe aktivizē daudzas proteīnkināzes signālu kaskādes, kurām ir svarīga loma neiroaizsardzībā. Starp tiem, kuriem, šķiet, ir īpaši nozīmīga līdzdalība, ir Akt.^49,50,) Akt veicina tās neiroprotektīvo iedarbību, aktivizējot dažādus pakārtotos substrātus, tostarp GSK-3 un Bcl-2. Akt fosforilē GSK-3 pie Ser9, izraisot tā inaktivāciju un pastiprinot neironu šūnu izdzīvošanu51), jo aktīvā GSK-3 forma aktivizē mitohondriju nāves ceļu.^52,53) Bcl-2 ir galvenais anti-apoptotiskās Bcl-2 ģimenes loceklis, un tam ir galvenā loma mitohondriju izraisītas apoptotisko šūnu nāves nomākšanā. Piemēram, Bcl-2 var aizsargāt mitohondriju membrānas integritāti un bloķēt citohroma C izdalīšanos no mitohondrijiem, izraisot šūnu izdzīvošanu un apoptozes kavēšanu.⁵⁴) Ir arī ziņots, ka pārmērīga Bcl{0}} ekspresija aizsargā neironus pret eksitotoksiskiem apvainojumiem in vitro un in vivo. 54,55) Šajā pētījumā tika novērota samazināta Akt (Ser473) un GSK3 (Ser9) fosforilācija, kā arī Bcl-2 ekspresija žurku hipokampā pēc kaiīnskābes iedarbības, kas atbilst iepriekšējiem pētījumiem.^56,57) Turklāt ehinakozīda pirmapstrāde izglāba kaīnskābes izraisītu pAkt un pGSK3, kā arī Bcl-2 ekspresijas samazināšanos. Tādējādi neiroprotektīvā iedarbībaehinakozīdskaīnskābes dzīvnieku modelī var būt daļēji mediēts, novēršot Akt/GSK-3 /Bcl{-2 ceļa pazemināšanos, tādējādi palielinot neironu izdzīvošanu.

Ehinakozīdsir potenciāls jauns terapeitiskais kandidāts. Tas ir tāpēc, kaehinakozīdsvar iekļūt smadzenēs un uzrāda daudzas priekšrocības.⁵⁸) To ir pierādījuši daudzi pētījumiehinakozīdsmazina smadzeņu bojājumus un atvieglo motora vai atmiņas traucējumus vairākos eksperimentālos modeļos in vivo.^12,14,15,59) Lai gan mehānismi, kas ir neiroprotektīvās iedarbības pamatāehinakozīdssmadzenēs nepieciešama noskaidrošana, ir iesaistīta inhibēta neiroinflammācija, antioksidācija, skābekļa brīvo radikāļu attīrīšana un palielināta neiroģenēze.^14–16) Papildus šiem iespējamajiem mehānismiem mūsu iepriekšējā¹⁷), un pašreizējie rezultāti liecina, ka glutamāta izraisītas pārmērīgas ierosmes kavēšana var daļēji veicināt neiroprotektīvo un pretepilepsijas iedarbību.ehinakozīdssmadzenēs. To apstiprina fakts, ka kaīnskābes izraisīta krampju aktivitāte, neiroiekaisumi un smadzeņu bojājumi ir saistīti ar pārmērīgu glutamāta izdalīšanos un glutamāta receptoru aktivāciju.^44,45) Turklāt ir pierādīts, ka vairākas klīniski lietotas pretepilepsijas zāles vājina kaīnskābes izraisīto krampju aktivitāti60, 61) un samazina glutamāta izdalīšanos cilvēka un žurkas smadzeņu audos.^62,63) Šie atklājumi norādīja, ka samazināts glutamāta līmenis ir svarīgs pretepilepsijas līdzekļu farmakoterapeitiskajai iedarbībai.

Noslēgumā jāsaka, ka mūsu rezultāti to parādaehinakozīds, nomācot iekaisuma procesus, samazinot glutamāta izraisītu pārmērīgu ierosmi, kā arī palielinot Akt/GSK-3 aktivāciju un Bcl-2 ekspresiju, ir ievērojama pretepilepsijas un neiroprotektīva iedarbība žurkām, kurām injicēta kainskābe. Lai gan lomaehinakozīdspacientiem ar epilepsiju ir nepieciešams turpmāks novērtējums, mūsu atklājumi liecina, ka tā varētu būt vērtīga pieeja epilepsijas terapijā.

Pateicības

Autori vēlas pateikties Yen-Sheng Wu kungam no Tzong Jwo Jang elektronu mikroskopa laboratorijas, Fu Jen Katoļu universitātes Medicīnas koledžas. Šo darbu atbalstīja Zinātnes un tehnoloģiju ministrija (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Interešu konflikts

Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.