Abstrakts:Šī pētījuma galvenais mērķis ir, izmantojot diferenciālo analīzi, novērtēt dažādas kopējā fenola satura bioloģiskās aktivitātes trīs dateļpalmu šķirņu spirta ekstraktos, kas ir jutīgas vai rezistentas pret Fusarium oxysporum. sp Albidinis. Šeit stilbēna produkti ar antioksidantu un bioaktīvu spēju tika pierādīti rezistentajā šķirnē Taabdount (TAAR). Turklāt TAAR izturīgas dateļpalmu šķirnes metanola frakcija satur nozīmīgu produktu, kas noteikts ar LCMS/MS un 1H,13C NMR, kas pieder hidroksistilbēnu saimei, kam piemīt antioksidanta spējas, kavē sēņu tirozināzes aktivitāti un aktivizē. un iedarbojas uz hipohlorīta izraisītiem bojājumiem cilvēka dermas fibroblastu veco šūnu 20S proteasomās. Kopumā šie rezultāti liecina, ka hidroksitoluols, kas atrodas rezistentā Phoenix dactylifera L., ir jāizpēta, lai saprastu, kā stilbēns var iedarboties pret novecošanos.

Cistanche glikozīds var arī palielināt SOD aktivitāti sirds un aknu audos un būtiski samazināt lipofuscīna un MDA saturu katrā audā, efektīvi attīrot dažādus reaktīvos skābekļa radikāļus (OH-, H2O₂ utt.) un aizsargājot no izraisītiem DNS bojājumiem. ar OH-radikāļiem. Cistanche feniletanoīda glikozīdiem ir spēcīga brīvo radikāļu attīrīšanas spēja, augstāka reducējošā spēja nekā C vitamīnam, tie uzlabo SOD aktivitāti spermas suspensijā, samazina MDA saturu un zināmā mērā aizsargā spermas membrānas darbību. Cistanche polisaharīdi var uzlabot SOD un GSH-Px aktivitāti eksperimentāli novecojošu D-galaktozes izraisītu peļu eritrocītos un plaušu audos, kā arī samazināt MDA un kolagēna saturu plaušās un plazmā, kā arī palielināt elastīna saturu. laba attīrošā iedarbība uz DPPH, pagarina hipoksijas laiku novecojošām pelēm, uzlabo SOD aktivitāti serumā un aizkavē plaušu fizioloģisko deģenerāciju eksperimentāli novecojošām pelēm Ar šūnu morfoloģisko deģenerāciju eksperimenti ir parādījuši, ka Cistanche ir labas antioksidanta spējas un tas var būt zāles ādas novecošanās slimību profilaksei un ārstēšanai. Tajā pašā laikā ehinakozīdam Cistančā ir ievērojama spēja attīrīt DPPH brīvos radikāļus un novērst reaktīvās skābekļa sugas un novērst brīvo radikāļu izraisītu kolagēna noārdīšanos, kā arī tam ir laba iedarbība uz timīna brīvo radikāļu anjonu bojājumiem.

Noklikšķiniet uz rou cong rong priekšrocības

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Atslēgvārdi:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); antioksidantu aktivitātes; antitirozināzes aktivitāte; proteasomu aktivācija; LC-MS/MS analīze; stilbēna atvasinājumi

1. Ievads

Datuma palma (Phoenix dactylifera L.) ir daudzgadīga viendīgļlapa no Arecaceae dzimtas. Šim kokam ir ārkārtīgi liela nozīme Sahāras Marokas dienvidu un dienvidaustrumu iedzīvotāju dzīvē gan ekonomiski, gan sociāli. Bayoud slimība, ko izraisa augsnes sēne Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], pēdējos gados ir ievērojami samazinājis Marokas dateļpalmu ražu [2]. Tiek lēsts, ka FoA pazuda no divām trešdaļām Marokas fenicikolu mantojuma, bet turpina iznīcināt 4,5–12 procentus augstākās kvalitātes komerciālo dateļpalmu šķirņu [2]. Ir pieliktas daudzas pūles, lai apkarotu šo slimību un izskaidrotu dažus datuma palmu aizsardzības mehānismus [3]. Pirmie pētījumi par datuma palmas iespējamajiem aizsardzības mehānismiem ir uzsvēruši fenola savienojumu lomu un antioksidantu spēju tolerancē pret FoA [4,5]. Rezistentu un jutīgu sakņu fenola savienojumu šķirņu bioķīmiskā analīze bija pirmais bioķīmiskais pētījums, kas noskaidroja datuma palmas aizsardzības mehānismu priekšrocības. Patiešām, literatūrā ir norādīts, ka rezistentu sakņu šķirnes ir bagātākas ar 5-kofeoilšikimskābi un tās pozīcijas izomēriem nekā šķirnes ar jutīgām saknēm [5]. Šie savienojumi ir efektīvi parādījuši potenciālu pretsēnīšu aktivitāti in vitro pret FoA [6].

Dabisko antioksidantu lielā spēja attīrīt brīvos radikāļus ir tas, kas veicina to pieaugošo popularitāti pārtikas un medicīnas pētījumos [7–10].

Piemēram, reaktīvās skābekļa sugas ir pastiprinoši faktori šūnu bojājumu un novecošanās procesos [11] un tādējādi ir saistītas ar daudzām slimībām. Rezultātā antioksidantu molekulas var palīdzēt cilvēku veselībai, novēršot deģeneratīvas slimības un palēninot novecošanās sekas [12]. Šajā pētījumā mēs esam ieinteresēti antioksidantu spējas veicināt 20S-proteasomas aktivāciju un aizsargāt pret tās oksidatīviem bojājumiem. Proteasoma patiešām veicina šūnu homeostāzes uzturēšanu, ļaujot šūnai atbrīvoties no bojātiem proteīniem un kontrolēt īslaicīgu proteīnu iznīcināšanu [13]. Tāpēc proteasomas aktivizēšana ar antioksidantiem var izrādīties jauna pretnovecošanās stratēģija [14]. Turklāt šī darba mērķis ir izpētīt FoA rezistentu sakņu fenola satura potenciālu kā aktīvus bioloģiskus savienojumus.

2. Materiāli un metodes

2.1. Augu paraugs

Pētījums tika veikts katram paraugam, izmantojot materiālu no 1 0 pieaugušām dateļpalmu šķirnēm (Phoenix dactylifera L.), kas audzētas no piesārņotiem vai nepiesārņotiem zemes gabaliem, kas atrodas Palmaria Figuig, Dienvidaustrumu Marokā. Galvenās saknes (tostarp to gaisu elpojošās saknes) ir 0,5–2 cm diametrā uzņēmīgām šķirnēm, piemēram, Charas Bouffegous inficētajām (BI) vai neinficētajām (BNI). Turklāt tika savākta pret FoA rezistentā Taabdount (TAAR) šķirne, un divu ārstniecības augu lapas tika lokāli izmantotas kā profilaktiska ārstēšana pret FoA. Turklāt rozmarīns (R, Rosmarinus officinalis) un granātābols (G, Punica granatum L.) [15] tika savākti arī tajā pašā nepiesārņotajā zemes gabalā, kurā tie tika analizēti un izmantoti kā kontrole. Paraugi tika ņemti divos gada periodos – septembrī un janvāra beigās (no 2013. līdz 2015. gadam) un hermētiski uzglabāti istabas temperatūrā. Tā kā paraugi tika iegūti no palmera, tos pienācīgi sertificējis (identifikācija un klasifikācija) Marokas lauksaimniecības ministrs [16].

2.2. Ekstraktu sagatavošana

Pēc plašas mazgāšanas ar ūdeni saknes vai lapas tika žāvētas ēnā, pēc tam samaltas blenderī. Katram paraugam (BI, BNI, TAAR, R un G) 1 g sausa materiāla pievienoja 10 ml metanola un pēc tam atstāja maisīt 4 stundas istabas temperatūrā. Pēc tam tie tika filtrēti un iztvaicēti 37 ◦ C temperatūrā ar rotācijas tvaiku. Sausais ekstrakts tika ievietots metanola šķīdumā ar galīgo koncentrāciju 10 mg / ml vai 50 mg / ml (vēlāk izmantoja, lai pārbaudītu bioloģiskās aktivitātes in vitro). Bioloģiskās aktivitātes testiem tika veiktas trīs neatkarīgas ekstrakcijas katram paraugam.

2.3. Bioloģiskās aktivitātes

2.3.1. Fenola saturs un antioksidantu aktivitātes

Procedūra, ko izklāstīja Nacoulma et al. tika izmantots, lai novērtētu kopējo fenolu saturu un kopējo flavonoīdu saturu katrā ekstraktā [17], galīgi pielāgojot tilpumus pie 200 µL, lai tos izmantotu mikroplašu lasītājā. Absorbcija pie attiecīgi 760 nm un 510 nm tika noteikta, salīdzinot ar metanola tukšo paraugu. Gallskābes (0–300 mg/L) (y=0.0083x plus 0.9106, r2=0.978) un kvercetīna (0–100 mg/L) (y {{14) standarta kalibrēšanas līknes Tika izmantoti attiecīgi }}.0008x plus 0,0597, r2=0.994).

Izmantojot 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilbrīvo radikāļu, tika pētīta antioksidantu attīrīšanas aktivitāte (DPPH). Izmantojot galīgo tilpumu pielāgošanu attiecīgi 300 µL un 275 µL, lai izmantotu mikroplašu lasītāju, tika novērtēta ekstraktu spēja samazināt dzelzi (III), kā aprakstījis Nacoulma et al. [17]. Salīdzinot ar metanola tukšo paraugu, absorbcija tika mērīta attiecīgi pie 517 nm un 700 nm. Pēc tam, izmantojot šādu vienādojumu, katra šķīduma brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika novērtēta kā inhibīcijas procents:

Standarta kalibrēšanas līkne tika iegūta, izmantojot askorbīnskābi ({{0}}–100 mg/L) kā antioksidanta standartu (y=0.0014x plus 0.0875, r2=0.998).

2.3.2. FoAMyc hēlija augšanas inhibējošais tests

Ar nelielu modifikāciju Neri et al. [18] tika izmantots, lai noteiktu pakāpi, kādā tīras ķīmiskās vielas kavē FoA micēliju augšanu. Dienu vecai FoA kultūrai piecu milimetru micēlija diski tika novietoti uz Petri trauciņiem ar PDA barotni, kas papildināta ar iepriekš uzskaitītajām tīrajām ķīmiskajām vielām 50, 75 un 100 µg/ml. Plāksnes inkubēja 5 dienas 28 ◦C temperatūrā. Lai novērtētu FoA micēlija augšanas kavēšanu, tika izmantots kolonijas vidējais diametrs, kas izmērīts divos taisnos leņķos. Katra apstrāde sastāvēja no trim testiem, izmantojot trīs dažādus FoA celmus: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Beļģija) un FoA Local (Palemeraie of Figuig, Maroka), kā arī negatīvu kontroli, izmantojot barotni, kas nebija pievienota.

2.3.3. Šūnu dzīvotspēja un 20S proteasomu aktivitāte

Tika izmantoti normāli cilvēka dermas fibroblasti no {{0}}gadīga vīrieša (NHDF) (Promocell, Heidelberga, Vācija), un šūnas tika ievietotas blīvumā 100,{{3 }} šūnas/ml RPMI 10% papildināts ar 10% (w/v) FBS, 1% (w/v) L-glutamīna, 100 vienības/ml penicilīna un 100 µg/ml streptomicīna. Tie tika turēti baltās vai caurspīdīgās 96-mikrodobumu plāksnēs 24 stundas 37 ◦C temperatūrā inkubatorā ar mitrinātu vidi ar 5 procentiem CO2. Lai veiktu proteasomu aktivitātes testu, kā arī novērtētu aizsargājošo iedarbību uz hipohlorīta izraisītiem bojājumiem, šūnas pēc tam tika apstrādātas ar testa materiāliem (tīrs savienojums no 5 līdz 50 µg/ml, pozitīva kontrole pie 0,5 un/vai 1 µM, un metanola augu ekstraktus no 15 līdz 50 µg/mL) 24 stundas ar maksimāli 0,3 procentiem DMSO gala koncentrācijā, vienlaikus bez izmaiņām attiecībā uz negatīvo kontroli. TAAR ekstrakta vai tīru savienojumu aizsargājošās ietekmes uz proteasomu aktivitāti izpēte nozīmēja, ka fibroblastu šūnas vēlāk tika pakļautas 50 µM OCl− 35 minūtes (izvēlēts kā optimāls, bez šūnu toksicitātes, 20S proteasomas stāvokļa oksidētājs-inhibitors) [19]. Ar piegādātāja metodoloģiju tika pabeigti šādi eksperimentālie posmi (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, ASV): Pirmkārt, vienlaicīgs šūnu dzīvotspējas eksperiments, izmantojot kristālvioletas kolorimetriskos vai MTT testus, kas tika veikti absolūti līdzīgos apstākļos. tika izmantots, lai normalizētu šo šūnu bioluminiscences testu. Tiek parādītas standarta novirzes un vidējā fluorescence trīs paraugos no diviem atsevišķiem testiem (n=6). Visi mērījumi un neatkarīgie eksperimenti (n=2) tika veikti divas reizes.

2.3.4. Inhibējoša iedarbība uz bezšūnu sēņu tirozināzi

Lai izpētītu ietekmi uz fermentu aktivitāti, testa materiāli (tīri antioksidanti vai metanola augu ekstrakti) tika iepriekš inkubēti ar fermentiem fosfāta buferšķīdumā istabas temperatūrā. Īsumā, 300 ml 5 mM L-DOPA šķīduma ar 50 mM fosfāta buferšķīdumu (pH 6,5) ar vai bez testa materiāliem dažādās koncentrācijās 96-iedobes mikroplāksne kopā ar 100 ml sēņu tirozināzes ūdens šķīduma (20 vienības). 40 minūtes testa maisījumu inkubēja 25 ◦C temperatūrā. Pēc inkubācijas reakcijas maisījuma dopahroma ražošanas līmenis tika mērīts spektrofotometriski pie 492 nm [20]. Standarta kalibrēšanas līkne tika uzzīmēta, izmantojot gallskābi (0–1000 µg/ml) (y=–0,087 × plus 0,45; r2=0,97). Katrs neatkarīgais mērījums un eksperiments (n=2) tika veikts divas reizes.

2.4. Analīzes, izolācijas un struktūras noskaidrošanas procedūras

Sasmalcināto sakni (20 g) ekstrahēja ar 200 ml metanola, 24 stundas maisīja apkārtējās vides temperatūrā, filtrēja, centrifugēja pie 10,000 × g 15 minūtes un pēc tam iztvaicēja 35 ◦C temperatūrā, izmantojot rotācijas ierīci. vakuuma iztvaicēšanas aparāts. Neapstrādātu ekstraktu atšķaidīja ar 20 ml destilēta ūdens, atkārtoti ekstrahēja ar 2 × 20 ml etilacetāta un pēc tam koncentrēja, izmantojot rotācijas vakuuma iztvaicēšanas sistēmu 35 °C temperatūrā. Galvenais produkts tika attīrīts ar preparatīvo HPLC, izmantojot Waters C18 kolonnu (SymmetryPrep 150 × 19 mm, daļiņu izmērs 7 µm) ar tādiem pašiem LC gradienta apstākļiem, kas izmantoti iepriekš, un plūsmas ātrumu 5 ml/min. Maksimālais RT bija no 38,8 līdz 40,8 minūtēm, savākts no 39,2 līdz 40,2 minūtēm; kopējā tilpuma kolekcija tika liofilizēta, lai iegūtu 27 mg savienojuma. Pēc tam MS un NMR 1H un 13C to identificēja.

Analīzes tika veiktas ar ātrās izšķirtspējas LC 1200 sērijas sistēmu, izmantojot diodes matricas detektoru (DAD), ko izmantoja UV spektru uzraudzībai pie 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV). Savienojumu atdalīšana tika veikta Beckman C18 kolonnā (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, daļiņu izmērs 5 µm), izmantojot 47 minūšu gradientu 10 mM amonija acetāts/0,2 procenti skudrskābes ūdenī (v/v), pH 2,9 ({{) 13}}šķīdinātājs A) un 30/70 acetonitrila/metanola maisījums (=šķīdinātājs B). Plūsmas ātrums bija 0, 8 ml / min, un šķīdinātājs B tika paaugstināts no 5 līdz 35 procentiem 45 minūtēs un atkārtoti līdzsvarots 2 minūtes. Sērijā ar DAD augstas izšķirtspējas MS un mērķtiecīgas tandēma MS (MS/MS) analīzēm tika izmantota ESI-QTOF 6520 sērija (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV). Spektri tika iegūti negatīvā un augstas izšķirtspējas (4 GHz) iegūšanas režīmos.

1H KMR un 13C KMR spektri tika reģistrēti ar Bruker Avance 300 spektrometru, kas darbojās ar 300 MHz. Brīvās indukcijas samazināšanās tika apstrādāta ar MestreNova 5.3.2 NMR komplektu no MestreLab Research SL.

2.5. Statistiskā analīze

Visi neatkarīgie eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Visi dati tika uzrādīti kā vidējās vērtības ± SD. Izmantojot programmas GraphPad Prism 6. versiju, rezultāti tika analizēti, izmantojot neparametrisko Kruskal-Wallis testu kopā ar Danna daudzkārtējo salīdzināšanas testu. p-vērtības 0,05 un zemākas tiek uzskatītas par nozīmīgām.

3. Rezultāti un diskusijas

3.1. Kopējais fenola un flavonoīdu saturs metanola ekstraktos

Ir konstatēts, ka augu fenola savienojumiem to redoksīpašību dēļ ir dažāda bioloģiska ietekme, tostarp antioksidanta aktivitāte [21]. 1. tabulā ir attēlots kopējais fenola saturs metanola sakņu ekstraktos (500 µg/mL) jutīgās ghagras Bouffegous šķirnēs, kas ir inficētas (BI) un neinficētas (BNI) ar FoA vai izturīgas kā Taabdount (TAAR). To koncentrācija svārstījās no 171 ± 14 līdz 253 ± 47 mg gallskābes ekv./g. Vislielākais šo savienojumu daudzums konstatēts BNI šķirnē, savukārt vismazākā koncentrācija iegūta no BI metanola sakņu ekstrakta. Flavonoīdu skaits šajos pašos ekstraktos (1. tabula)) svārstījās no 240 ± 25 līdz 406 ± 66 mg kvercetīna ekv./g, un atkal lielākais daudzums tika attiecināts uz BNI šķirni. Starp neinficētām (BNI) šķirnēm un inficētām (BI) vai rezistentām (TAAR) šķirnēm pret FoA tiek zaudēta aptuveni 1/3 no kopējā polifenolu un flavonoīdu daudzuma. Tāpēc ir vērts pārbaudīt, kā savienojumu zudums, kas aprakstīts kā būtisks auga antioksidanta spējai, var ietekmēt mūs interesējošo bioloģisko darbību.

3.2. Metanola ekstraktu antioksidanta potenciāls

DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāte ir metode, ko plaši izmanto, lai pārbaudītu augu ekstraktu antioksidantu aktivitāti [22]. Šis tests nosaka, vai ekstraktos atrodamās antioksidantu ķimikālijas spēj attīrīt stabilo radikāļu sugu DPPH. Eksperimentālie dati (1. attēls) atklāj, ka visi metanola ekstrakti (pie 100 vai 500 µg/mL), visticamāk, iedarbosies uz brīvo radikāļu attīrīšanas efektu ar visaugstāko DPPH attīrīšanas aktivitāti, kas novērota TAAR saknēs (87,0). procenti no DPPH inhibīcijas). Šķiet, ka antioksidantu aktivitāte nav atkarīga no kopējā polifenolu vai flavonoīdu savienojumu klātbūtnes. Tomēr TAAR sakņu metanola ekstraktu labāka aktivitāte varētu būt saistīta ar vairāk ūdeņradi nododošu komponentu ekstraktā.

Reducējošo jaudu novērtē pēc metanola ekstrakta spējas pārveidot Fe (III) par Fe (II). Šo spēju reducēt Fe (III) var saistīt ar fenola savienojumos esošo hidroksilgrupu skaitu un stāvokli un to spēju ziedot ūdeņradi [23]. 2. tabulā parādītas mūsu augu paraugu metanola ekstraktu reducējošās aktivitātes salīdzinājumā ar askorbīnskābi kā standartu. TAAR sakņu metanola ekstrakti satur lielus samazinājumus (95 ± 1 mg askorbīnskābes ekv./g), savukārt vismazākais saturs iegūts no BNI sakņu ekstraktiem (27 ± 2 mg askorbīnskābes ekv./g).

Iegūto rezultātu korelācijai tika veikta regresijas analīze (korelācijas koeficients (R)). Tika konstatētas nozīmīgas lineāras korelācijas starp kopējo fenola un flavonoīdu saturu (R {0}}.849, p < 0.05) un starp DPPH un reducējošās jaudas testu (R=0). 816, p < 0,05), bet starp fenola vai flavonoīdu saturu metanola ekstraktos un to antioksidantu aktivitāti nebija. Visbeidzot, visiem metanola ekstraktiem bija ievērojamas antioksidantu aktivitātes pret DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāti un samazināšanas jaudas testu, taču šīs antioksidanta aktivitātes, šķiet, nav saistītas ar kopējo fenola vai flavonoīdu saturu. Tāpēc šie atklājumi liecina, ka konkrētais ķīmiskās vielas veids, nevis fenola vai flavonoīdu savienojumu daudzums, kas atrodams mūsu dažādajos ekstraktos, visticamāk, ir atbildīgs par apskatāmo augu ekstraktu antioksidantu aktivitāti. Daži iepriekš aprakstītie fenola komponenti, kas ir ļoti aktīvi indivīdi, var ietekmēt arī augu ekstraktu antioksidantu aktivitāti: Neatkarīgi no to koncentrācijas izturētā sarkanvīnā atrodamajiem fenola savienojumiem var būt dažādas pretradikālas īpašības, kas saistītas ar to strukturālajiem aspektiem [ 24].

TAAR FoA izturīgajai šķirnei ir visaugstākā antioksidanta aktivitāte starp dažādām dateļpalmu šķirnēm. Atsaucoties uz literatūru, rezistences attīstība šajās konkrētajās dateļpalmās var būt saistīta ar kofeoilšikimskābes dažādu pozicionālo izomēru daudzuma palielināšanos [5].

3.3. Sēņu tirozināzes aktivitāte

Sēņu tirozināzes difenolāzes aktivitāte katalizē divu dopahinona atvasinājumu oksidāciju, izraisot melanīna sintēzi. Rezultāti, kas sniegti 3. tabulā, parāda TAAR, BI un BNI metanola ekstraktos esošo savienojumu spēju traucēt l-DOPA hidroksilāciju, inhibējot sēņu tirozināzes aktivitāti. Turklāt šie rezultāti liecina, ka TAAR metanola ekstrakts ir statistiski aktīvāks nekā BI (p < 0.05) un BNI (p < 0,05) ekstrakts attiecībā uz sēņu tirozināzes aktivitāti. Tātad šķiet, ka palmu datuma sakņu ekstraktu spēja inhibēt tirozināzes aktivitāti atbilst tādai pašai tendencei kā antioksidantu spējai.

Tirozināzes galvenokārt ir saistītas ar ādas, acu un matu pigmentāciju. Patiešām, tirozināzes ir melanoģenēzes enzīmi, kas iesaistīti melanīna biosintēzes pirmajos posmos, un melanīns ir saistīts ar aizsardzību pret ultravioleto (UV), saules vai gamma starojumu, samazinātu šūnu jutību un šūnu sieniņu rezistenci pret hidrolītiskajiem enzīmiem [20]. Un otrādi, melanīna pārprodukcija var ietekmēt ādas anomālijas vai nopietnākas slimības, piemēram, vēzi (piemēram, melanomu), un dopahinona pārpalikums var izraisīt neirodeģeneratīvu slimību (piemēram, Parkinsona slimību) [20, 25]. Turklāt ir ziņots, ka melanoģenēze rada ūdeņraža peroksīdu un citus ROS, pakļaujot cilvēka melanocītus augstam oksidatīvā stresa līmenim [26]. Vairāki dabiskie antioksidantu savienojumi (fenoli, flavonoīdi un citi), kas iegūti no augiem, inhibēja tirozināzes fenolāzes aktivitāti [27,28]. Šķiet, ka TAAR ekstrakts satur savienojumu (-us), kas ir jutīgi pret ādas novecošanās un melanoģenēzes kavēšanu.

3.4. Metanola sakņu palmu ekstraktu proteasomu aktivitāte

Ir ziņots, ka paaugstināts 20S proteasomas līmenis palielina toleranci pret oksidatīvo stresu [13]. Tāpēc tika pētīta proteasomu aktivitātes regulēšana ar BI, BNI un TAAR šķirņu sakņu ekstraktiem. Izmērītā 20S proteasomu aktivitāte ir saistīta ar himotripsīnam līdzīgo (CT-L) aktivitāti NHDF vecās šūnās (skatiet sadaļu Materiāli un metodes). Kā parādīts 2.A attēlā, šūnas, kas 24 stundas apstrādātas ar 50 µg/ml metanola ekstraktiem, uzrādīja ievērojamu CT-L aktivāciju BI un TAAR ekstraktiem un BNI inhibīciju, neradot vairāk nekā 30 procentus no šūnu toksicitātes. TAAR sakņu ekstrakts uzrādīja saistošu proteasomu aktivāciju, salīdzinot ar 1 µM lipoīnskābes (Ct plus ) (attiecīgi 212 procenti un 248 procenti). Proteasoma ir cilindrisks proteināzes komplekss, kas satur četru sakrautu gredzenu kodolu, kas ir atbildīgs par neparasti degradētu (26S) proteasomu un oksidatīvi (20S proteolītiskā kodola kompleksa) bojātu proteīnu noņemšanu (Ciechanover, 1998). Kā parādīts Hvanga darbā [29], proteasomu disfunkcija var veicināt cilvēka ādas novecošanos. Patiešām, ir pierādīts, ka novecojošām un replikatīvajām novecojošām šūnām ir samazināta proteasomu aktivitāte, kā arī proteasomu apakšvienību proteīnu līmenis. Fakts, ka šajās šūnās biežāk uzkrājas gan oksidētie, gan/vai bojātie šūnu proteīni, liecina, ka proteīnu sadalīšanās ubikvitīna-proteasomu ceļš ir saistīts ar iekšējo novecošanās procesu. 2B un C attēli parāda TAAR metanola ekstrakta spēju aizsargāt NHDF vecas šūnas no 20S proteasomas aktivitātes kavēšanas ar OCl-oksidantu. Patiešām, OCl-oksidants par 50 procentiem inhibē kontroles šūnu (Ct) proteasomu aktivitāti, savukārt augstākais 20S-proteasomas aktivators (liposkābe pie 1 µM, Ct plus) ar vairāk nekā 50 procentiem inhibīcijas aktivitātes nespēj mainīt inhibīciju. 20S proteasomu aktivitāti ar OCl−, savukārt visas pārējās pārbaudītās koncentrācijas (15, 50 un 75 µg/ml) TAAR metanola ekstrakta, šķiet, maina šo inhibīciju (no 0 līdz 19 procentiem no inhibīcijas). Šie rezultāti liecina, ka TAAR sakņu ekstrakti var saturēt molekulas, kas var aizkavēt ādas novecošanos ne tikai palielinot proteasomu aktivitāti, bet arī neitralējot oksidētāju inhibējošo iedarbību. Starp šīm molekulām, visticamāk, ir kofeoilšikimskābe, kā arī citi savienojumi. Turklāt ir veiktas LC-DAD-MS (MS) un NMR analīzes, lai identificētu galvenos ekstraktu savienojumus, un ar šo to aplūkosim nākamajā sadaļā.

3.5. Spektrometriskās analīzes

3.5.1. Metanola ekstraktu LC-DAD-MS analīze

Datuma palmu sakņu salīdzinošais pētījums neatklāja kvalitatīvas atšķirības, bet tā vietā zināmā mērā tika konstatētas daļēji kvantitatīvās atšķirības (DAD un MS hromatogrammās) starp šķirnēm (3.A, D attēls). Patiešām, pašreizējie rezultāti nepieļauj saikni starp dateļpalmu rezistenci pret kafeoilšikimskābes dažādu pozicionālo izomēru daudzuma palielināšanos, jo rezistentajai šķirnei (TAAR) ir viszemākais šo savienojumu relatīvais daudzums (3.C attēls). Visi trīs kafeoilšikimīnskābes pozicionālie izomēri (m/z=335.0768 ar kļūdu 1,2 ppm) tika identificēti pēc to MS/MS spektriem (S6. attēls) ar fragmentu pie m/z 179,0340, kas atbilst kofeīnskābes fragmentam A (C9H7O4) un fragmentam pie m/z 135,0443, kas atbilst kofeīnskābes (C8H7O2) dekarboksilēšanai. Neskatoties uz to, cits savienojums, kas neatbilst kofeoilšikimskābēm (3. C attēls) un kura aiztures laiks ir 29 min ar m/z=259.0607 (vai 373.0543 TFA aduktam), šķiet, ir skaidri nošķirts starp dažādām šķirnēm. (3.D attēls). Šī savienojuma uzkrāšanās atšķirība jutīgu un rezistentu šķirņu saknēs (0,135 procenti) ar attiecību aptuveni 1:35 (no m/z=259.06, MS dati) varētu izskaidrot ievērojamo bioloģisko. aktivitātes, kas novērotas šīs saknes metanola ekstraktam.

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】