Ceļš uz progresu ar vecumu saistītu neirodeģeneratīvo slimību preklīniskajos pētījumos: perspektīva uz grauzējiem un no HiPSC iegūtiem modeļiem 5. daļa

No hiPSC iegūto šūnu sistēmu un slimību modeļu priekšrocības

Uzlabotas slimību modelēšanas un zāļu atklāšanas platformas

HiPSC balstītu in vitro modeļu potenciāls būt ļoti informatīvam NDD ar cilvēka ģenētisko komponentu izmeklēšanu ir augsts.

Attiecības starp cilvēka ģenētiku un atmiņu ir daudz apspriests jautājums, īpaši mūsdienu sabiedrībā, kur mēs koncentrējamies uz personības attīstību un mācīšanos. Lai gan mūsu ģenētiskā informācija nosaka mūsu pamatīpašības dzimšanas brīdī, atmiņa atšķiras no fiksētām īpašībām, piemēram, mūsu auguma un ādas krāsas. Tā vietā to var kultivēt un uzlabot, un tam ir svarīga loma ikdienas dzīvē.

Pirmkārt, zinātniskie pētījumi liecina, ka atmiņa nav tieši saistīta ar ģenētiskajiem gēniem. Lai gan daži cilvēki piedzimst gudrāki par citiem, ilgtermiņā atmiņu var pakāpeniski uzlabot, mācoties un pilnveidojoties. Mācību procesā no pamatskolas līdz universitātei mums pastāvīgi jāizmanto un jāuzlabo atmiņa, lai uzlabotu savu akadēmisko sniegumu. Piemēram, mēs atceramies problēmas un risinājumus, veicot atkārtotu pārskatīšanu un praktizēšanu, kas palīdz attīstīt mūsu atmiņas spējas.

Otrkārt, veselīgs dzīvesveids ļoti palīdz arī mūsu atmiņai. Fiziskajai veselībai ir liela ietekme un ietekme uz atmiņu, piemēram, pietiekams miegs, veselīgs uzturs un mērens vingrinājums. Mēs sākam ar savu ķermeni un paliekam veseli, veicot vingrinājumus un veselīgu dzīvesveidu, kas padarīs mūsu atmiņu skaidrāku un asāku.

Visbeidzot, mēs varam arī paplašināt savas atmiņas spējas, pastāvīgi paplašinot savu redzesloku un piedaloties dažādās jaunās lietās. Piemēram, mēs varam mēģināt apgūt jaunu valodu un piedalīties tādās sabiedriskās aktivitātēs kā ceļošana, un šī pieredze var radīt vairāk atmiņu mūsu prātos.

Īsāk sakot, attiecības starp cilvēka ģenētiku un atmiņu ir sarežģītas un daudzveidīgas, un, protams, būs atbilstošas ​​atšķirības, kuru pamatā ir personīgās ģenētiskās atšķirības. Bet mums nevajadzētu ignorēt to, ko mēs varam darīt: mūsu atmiņas un pašpārvaldes spēju uzlabošana, nepārtraukti mācoties, veselīgi dzīvojot un pastāvīgi paplašinot savu redzesloku, ir labākais veids, kā pārvarēt ģenētiskās atšķirības. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche ir tradicionālā ķīniešu medicīna ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche efektivitāti nodrošina dažādas aktīvās sastāvdaļas, tostarp miecskābe, polisaharīdi, flavonoīdu glikozīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību daudzos veidos.

Noklikšķiniet uz Zināt, lai uzlabotu īstermiņa atmiņu

Spēja korelēt NDD kandidāta gēnus ar šūnu fenotipiem, piemēram, RNS un proteīnu ekspresijas profiliem, morfoloģiskām izmaiņām un bioķīmiskiem parakstiem hiPSC atvasinātās šūnās, atvieglo pētījumus par to, kā cilvēka ģenētiskie komponenti kompleksos NDD, piemēram, AD un PD, tiek izteikti šūnu līmenis.

Turklāt hiPSC ļauj modelī iekļaut pacienta ģenētiskā fona ģenētisko sarežģītību, kas bieži tiek noliegta (piemēram, ķīmiskie modeļi) vai pārāk vienkāršota (piemēram, monoģenētiski dzīvnieku modeļi).

Ir labi atzīts, ka neirodeģenerācijas sākumu, progresēšanu un smagumu nosaka sarežģīti ģenētiski faktori un vairāku ģenētisko variantu mijiedarbība ar salīdzinoši nelielām sekām.

Šī iedzimtā ģenētiskā ainava, kas fiksēta pacientu radītos hiPSC modeļos, ļauj mums izpētīt ģenētiskos noteicošos faktorus un bioloģiskos faktorus, kas savienoti ar spēju ģenerēt modulārus, augstas precizitātes in vitro NDD modeļus, lai balstītos uz mūsu pašreizējo izpratni par slimības bioloģiju. hiPSC tehnoloģija pašlaik ir vienīgā pieejamā cilvēka pieeja. Uz modeļiem balstīti modeļi, kuros tiek tverta pilna pacientu ģenētiskā ainava.

Arī iespēja izmantot genoma rediģēšanas tehnoloģijas, piemēram, CRISPR-Cas9, izmantojot hiPSC, ļāva ģenerēt izogēnus modeļus precīzu ģenētisko variantu novērtēšanai. Papildus mērogojamībai hiPSC ir pašatjaunojami.

Tādējādi no hiPSC iegūtie modeļi ir daudzsološa sistēma preklīniskajiem pētījumiem. Turklāt cilvēka ģenētiskā daudzveidība, kas fiksēta pacientu iegūtajā hiPSC kapacitātē, padara tos piemērotus "personalizētas medicīnas" pieeju novērtēšanai.

Spēja efektīvi pārbaudīt individuālas reakcijas uz ārstēšanu un identificēt nereaģējošos vai vāji reaģējošus cilvēkus pirms ievadīšanas klīniskā vidē vēl vairāk uzsver hiPSC atvasinātu modeļu piemērotību preklīniskajiem novērtējumiem (2. attēls).

Kopumā potenciālā informācija, kas iegūta preklīniskajos pētījumos hiPSC modeļos, ir stabila, atbilstoša cilvēkiem un ir būtiska, lai to īstenotu klīnisko pētījumu plānošanā (piemēram, pētījuma subjektu stratifikācija), lai uzlabotu rezultātu precizitāti.

Dzīvnieku modeļu ierobežojumu pārvarēšana

Kā iepriekš apspriests, hiPSC piedāvā veidu, kā pārvarēt daudzas problēmas, kas pastāv pašreizējos uz dzīvniekiem balstītos modeļos. Pirmkārt, no iPS atvasinātie modeļi nodrošina uz cilvēku balstītu platformu, lai novērtētu iespējamos terapeitiskos līdzekļus cilvēka slimības faktiskajā ģenētiskajā ainavā.

Otrkārt, iegūstot šūnas no pacientiem, tiek apieti daudzi tehniski jautājumi par labāko veidu, kā modelēt cilvēka slimību mutācijas, jo modelis satur unikālo pacienta ģenētisko fonu. Treškārt, hiPSC šūnas ir viegli pieejamas ģenētiskai un farmakoloģiskai manipulācijai, ļaujot veikt augstas caurlaidības strukturālās un funkcionālās pārbaudes, kas novērtē slimības fenotipu.

Šim nolūkam mēs nesen izstrādājām no hiPSC atvasinātu DA neironu modeli, kas iegūts no PD pacienta ar SNCA trīskāršošanu, lai novērtētu all-in-one LV GT, kura mērķis ir samazināt SNCA līmeni. Mūsu LV iejaukšanās veiksmīgi samazināja SNCA līmeni un izglāba ar slimībām saistītos fenotipus, veidojot reaktīvas oksidatīvās sugas (ROS) un saglabājot šūnu dzīvotspēju.140

Ceturtkārt, salīdzinot ar standarta grauzēju modeli, in vitro hiPSC balstītus modeļus var izveidot ievērojami īsākā laika posmā, aptuveni 30 dienās, atšķirībā no dzīvnieku modeļiem, kuru ilgums var būt no mēnešiem līdz gadiem.

Piektkārt, saskaņā ar iepriekšējo punktu uz hiPSC balstīti modeļi ir ievērojami lētāki un patērē vairāk enerģijas nekā modeļi ar grauzējiem, jo ​​īpaši ņemot vērā pastāvīgās dzīvnieku turēšanas saistības un infrastruktūru, noteikumus, kā arī apmācības un atbilstības prasības. Aizvien ekonomiskāka preklīniskā slimību modelēšana palielina pētnieku grupu pieejamību, lai novērtētu iespējamās terapijas, uzlabo tulkojamību un galu galā uzlabo DMT attīstības efektivitāti.202

Kopumā šīs priekšrocības piešķir no PSC iegūtajiem modeļiem izteiktas priekšrocības neirodeģenerācijas pētījumos, un šādiem modeļiem ir potenciāls radīt jaunus atklājumus, kas nebija pieejami iepriekšējos šūnu kultūras un dzīvnieku slimību modeļos.

Šeit apskatītie pētījumi parāda 2D un 3D hiPSC modeļu iekļaušanas nepieciešamību un vērtību NDD mehāniskajos pētījumos, kas izskaidro faktorus, kas saistīti ar slimības cēloņsakarību un patogēniem ceļiem, kā arī translācijas un zāļu atklāšanas pētījumos, piemēram, terapeitisko mērķu identificēšanā un validācijā. .

Kopā hiPSC iegūtie NDD modeļi ir lēciens uz priekšu medicīniskajā izpētē, pateicoties uzlabotai slimību modelēšanai, kas ir ievērojami iespējama, ar salīdzinoši īsākiem eksperimentiem, kas ir rentabli un, iespējams, vissvarīgākais, precīzi un piemēroti cilvēku slimību modelēšanai.

2. attēls. Uzlabota DMT zāļu izstrādes cauruļvada shēma NDD, palielinot hiPSC atvasinātu modeļu iekļaušanu un/vai aizstāšanu. Jebkura iespējamā DMT izstrāde sākas ar atklāšanas fāzi, kas ietver gan atbilstošo gēnu mērķu identificēšanu, gan slimības mehānismus.

Turpmākie slimību modeļi tiek izstrādāti agrīnā preklīniskajā fāzē, lai izpētītu šūnu slimību patofizioloģiju un apstiprinātu zāļu mērķus, kā arī agrīnu CGT-IP / DMT agrīnu skrīningu un optimizāciju. Pakāpeniska DMT attīstība, tostarp turpmāka modeļa izstrāde un mērķa validācija, kā arī ārpusmērķa efektu izpēte, notiek preklīniskās fāzes vidū.

DMT progresējot, vēlīnā preklīniskajā fāzē tiek iegūta papildu informācija par farmakokinētisko un farmakodinamisko aktivitāti. Plašāka no hiPSC iegūto modeļu izmantošana šajās fāzēs ir pievilcīgs uzlabojums esošajam zāļu izstrādes cauruļvadam vairāku iemeslu dēļ; proti, tie ir rentabli, daudzpusīgi un, pats galvenais, pārvar daudzus iedzimtos ierobežojumus esošajiem NDD dzīvnieku modeļiem.

Šajā posmā INDpieteikumus var iesniegt iespējamajiem DMT, kas pašlaik satur 4 kritiskus mērķus, kas jāsasniedz ar jebkuru topošo DMT, jo īpaši CGT-IP: (1) mērķa atlase, (2) vadošā savienojuma izstrāde un optimizācija, (3) sākotnējie mērķi. un pieaugošs dozēšanas režīms, un (4) iespējamības un ROA noteikšana.

Katru no tiem var precīzi un atbilstoši risināt, aizstājot uz hiPSC balstītus modeļus preklīniskajos pētījumos. Pēc tam DMT var saņemt FDA apstiprinājumu, lai sāktu klīniskos izmēģinājumus.

Var iekļaut uz hiPSC balstītu modeļu iekļaušanu papildu 1.a fāzē, kas veicina uzlabotu kandidātu skrīningu vervēšanas fāzē un potenciālo nereaģējošo vai vājo atbildes reakciju identificēšanu, pamatojoties uz preklīniskiem ģenētiskiem pētījumiem.

DMT ar pierādāmu drošību 1.a fāzē pēc tam virzās uz 1., 2. un 3. fāzes klīniskajiem pētījumiem, pēc kuriem tie, kuriem ir ievērojama pozitīva ietekme, saņem jauno zāļu lietošanas (NDA) regulatīvo apstiprinājumu un tiek nodoti lietošanai patērētājiem ar pastāvīgu farmakovigilances palīdzību, lai identificētu visus iepriekš neidentificētos. nelabvēlīgi rezultāti laika gaitā.

No hiPSC iegūto in vitro modeļu ierobežojumiLaiks un reproducējamība

HiPSC kultivēšanas tehnoloģijas parādījās pēdējā desmitgadē, un to lietderība slimību modelēšanā un iespējamo DMT preklīniskajā novērtēšanā ir salīdzinoši jauna.

Tāpat kā jebkurai jaunajai tehnoloģijai, mēģinot precīzi atjaunot NDD bioloģiskās īpašības, ir jāņem vērā vairāki ierobežojumi. Pirmkārt un galvenokārt, hiPSC audzēšana un precīzu un uzticamu šūnu modeļu ģenerēšana var būt dārga, darbietilpīga un laikietilpīga. HiPSC līniju validēšana atbilstoši medicīniskiem pētījumiem piemērotā standartā vidēji maksā no 10 $000 līdz 25 USD,000.203

Pārprogrammēšanas, diferenciācijas un nobriešanas procesi tiek pagarināti. Sākotnējo audu šūnu pārprogrammēšana uz hiPSC var ilgt vismaz 20 līdz 30 dienas,151 un sekojošā šūnu diferenciācija un nobriešana mainās atkarībā no vēlamā šūnu veida un izmantotās metodes; Piemēram, nobriedušu neironu, astrocītu un mikrogliakāna ģenerēšanai ir nepieciešamas attiecīgi no 6 līdz 15 nedēļām, 204 4 līdz 9 nedēļām, 205 206 vai 5 līdz 9 nedēļām, 164 207.

Rezultātā pētnieki bieži dod priekšroku cilmes šūnu izmantošanai kā stabiliem starpproduktiem eksperimentiem, jo ​​tās plaši atspoguļo mērķa šūnu tipu un var tikt ģenerētas ātrākā laika posmā.204 Tādējādi laika ierobežojumi un izmaksas, kas nepieciešamas hiPSCmodel sistēmas izveidei, var rada bažas daudzām pētniecības grupām.

Turklāt, modelējot NDD, tiek ņemts vērā arī laiks, kas nepieciešams galveno ar slimībām saistītu šūnu fenotipu attīstībai hiPSC atvasinātajās šūnās. Lai gan pacientam ir vajadzīgi gadu desmiti, lai parādītu klīniskus un patoloģiskus simptomus, ar slimību saistīti molekulārie fenotipi no hiPSC atvasinātajos modeļos tika atklāti aptuveni 2 mēnešus pēc nobriešanas.208

Neskatoties uz to, ierobežojumi izriet no ierobežotā uz hiPSC balstīto modeļu kultūras dzīves ilguma, kas var nebūt pietiekams, lai izveidotu pilnīgu priekšstatu, kas līdzinās slimībai šūnu un audu līmenī.

Stratēģijas, kuru mērķis ir paātrināt diferenciācijas un nobriešanas procesu, piemēram, Notch un g-sekretāzes inhibitoru iekļaušana, lai saīsinātu nogatavināšanas laiku,209 un neirogenīna -2 (Ngn2) vai neiroD1 pārmērīga ekspresija158 ir bijušas daļēji veiksmīgas un radīja citas problēmas, kas saistītas ar ārpusdzemdes izpausmi.

Citi ierobežojumi ir saistīti ar sistēmu reproducējamību atkārtotos eksperimentos un raksturīgo modeļu mainīgumu, tostarp neveiksmes attiecībā uz hiPSC iegūto kultūru tīrību un nevēlamu heterogēnu šūnu populāciju klātbūtni.210

Tādējādi ir svarīgi ņemt vērā šūnu populāciju neviendabīgumu, izmantojot hiPSC atvasinātus slimības modeļus, īpaši DMT skrīningu un efektivitātes novērtēšanu. Turklāt ir ziņots, ka hiPSC kultūrām ir genoma nestabilitāte, un tās var iegūt ģenētiskas aberācijas un mutācijas šūnu paplašināšanās un pārprogrammēšanas laikā.211

Jāievēro arī piesardzība, izmantojot dažādas genoma rediģēšanas metodes radītās izogēnās līnijas, jo var rasties potenciāli ārpusmērķa efekti (piemēram, neparedzēta klonu mainība starp izogēnajām līnijām un ārpusmērķa mutaģenēze).212 213 Tāpēc ir svarīgi periodiski novērtēt. hiPSC genoma stabilitāte nodrošina stingru DMT skrīningu.

Izaicinājumi sporādiskas NDD patofizioloģijas un šūnu fenotipu apkopošanā

NDD sarežģītība un visaptveroša raksturojuma un mehāniskās izpratnes trūkums par to šūnu fenotipiem rada izaicinājumus spējai tos apkopot ar šūnu modeļiem, tostarp uz hiPSC balstītām sistēmām.

NDD cēloņi ir sarežģīti un daudzfaktoriāli, tostarp poligēni riska faktori (ti, multigēni un varianti), epigenētikas pazīmes, novecošanās, dzimums un vides faktori, piemēram, oksidatīvā stresa izraisītāji, no kuriem dažus ir grūti izraisīt, jo īpaši bezgalīgā dažādu veidu sarakstā. kombinācijas, laboratorijas sistēmā.

Turklāt lielākā daļa no hiPSC atvasināto AD-PD modeļu ir iegūti no pacientiem ar ģimenes mutācijām, kas veido tikai ļoti nelielu kopējo gadījumu daļu.214 215 Tā kā mehānismi, kas ir ģimenes un sporādisku formu pamatā, var atšķirties, ir jāizveido modeļi, kas atvasināti no hiPSC un fibroblasti, kas iegūti no sAD vai sporādiskiem PD pacientiem.

Lai sasniegtu šo mērķi, pēdējos gados ir parādījušās pacientu šūnu krātuvju iniciatīvas; tie ietver Lietišķās cilmes šūnu (ASC), Kalifornijas Reģeneratīvās medicīnas institūtu (CiRA), Cedars Sinai izraisīto pluripotento cilmes šūnu kodolu, Eiropas Inducēto pluripotento cilmes šūnu banku (EBiSC), Korejas Nacionālo cilmes šūnu banku (KSCB), Nacionālo novecošanas institūtu (NIA). , Nacionālais neiroloģisko traucējumu un insulta institūts (NINDS), Nacionālais vispārējo medicīnas zinātņu institūts (NIGMS) un WiCell pētniecības institūts (WiCell) (S2 tabula).

Paredzamā šo kolekciju izaugsme veicinās no hiPSC atvasinātu modeļu izveidi, kas ir piemērotāki parastās sAD un sporādiskas PD izpētei.

Neskatoties uz to, hiPSC modeļi, kas iegūti no sporādiskiem NDD pacientiem, rada atbilstošus šūnu fenotipus, kas raksturīgi AD181 un PD216, veicot vides manipulācijas, piemēram, pakļaušanu neirotoksīnu iedarbībai un ķīmiskā oksidatīvā stresa indukcijai.

Tāpat nesen veikts pētījums atklāja izmaiņas mitohondriju proteīnu ekspresijā un paaugstinātu oksidatīvo stresu hiPSC, kas radušies no sAD pacientiem, neskatoties uz izteiktu Ab un tau patoloģijas trūkumu217, kas liecina, ka hiPSC modeļi var atklāt vērtīgu ieskatu niansētajā patofizioloģijā, kas raksturīga sporādiskiem NDD apakštipiem.

Turklāt nesen veiktajā Meyer et al.218 pētījumā tika izmantoti hiPSC, kas iegūti no sAD pacientiem, un konstatēts, ka MAPT, kas kodē tau proteīnu, ir ievērojami palielināts no sAD iegūtajās šūnās, salīdzinot ar veselām kontrolēm.

Tādējādi, neskatoties uz šīm problēmām, pašreizējie hiPSC atvasinātie modeļi ir lieliski aizstājēji, kas sniedz iespēju atdarināt slimības patofizioloģiju un noteikt zelta standarta slimības raksturlielumus ar pilnu ģenētisku pamatu sporādiskiem pacientiem, kurus var izmantot kā iznākuma pasākumus, lai uzlabotu turpmākos slimību modeļus.

For more information:1950477648nn@gmail.com