No olbaltumvielām neatkarīgā fosfāta loma hroniskas nieru slimības progresēšanā

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Irēna Farija Duajere¹ un citi

Abstract:Vairāki faktori veicinanieru darbībaHNS pacientu skaita samazināšanās, un fosfātu satura nozīme uzturā joprojām ir diskusiju jautājums. Šī pētījuma mērķis ir analizēt mehānismu, ar kuru fosfāts neatkarīgi no olbaltumvielām ir saistīts ar CKD progresēšanu. Pieaugušām Munich-Wistar žurkām tika veikta 5/6 nefrektomija (Nx), tās tika barotas ar diētu ar zemu olbaltumvielu saturu un sadalītas divās grupās. Tikai fosfātu saturs (zems fosfātu saturs, LoP, 0,2 procenti ; augsts fosfātu saturs, HiP, 0,95 procenti ) atšķir diētu. Pēc sešdesmit dienām bioķīmiskie parametri unnierestika analizēta histoloģija. HiP grupai bija sliktāka nieru darbība ar augstāku PTH, FGF-23 līmeni un daļēju fosfātu izdalīšanos. Nieru audu histoloģiskajā analīzē tie arī uzrādīja lielāku intersticiālās fibrozes procentuālo daļu, -aktīna, PCNA unnierumakrofāgu infiltrācija. LoP grupa uzrādīja augstāku beklīna-1 ekspresiju nieru kanāliņu šūnās, kas ir autofagiskās izplūdes marķieris, salīdzinot ar HiP grupu. Mūsu atklājumi izceļ fosfāta darbību indukcijānieresintersticiāls iekaisums un fibroze, kas veicina nieru slimības progresēšanu. Fosfāta iespējamā ietekme uz nieru šūnu autofagijas mehānisma disregulāciju ir jāturpina pētīt ar klīniskiem pētījumiem.

Atslēgvārdi:fosfāts;diēta; CKDprogresēšana;nierufibroze; autofagija;apoptoze

Galvenais ieguldījums:Nieru aizsardzības mehānismi, ierobežojot fosfātu diētu, vēl nav noteikti. Šajā pētījumā fosfātu pārslodze ietekmēja HNS progresēšanu, aktivizējot iekaisuma ceļus un inducējotnieresintersticiāla fibroze. Hiperfosfatēmijas ietekme uz nieru šūnu apoptozi un autofagisko līdzstrādnieku ir jāturpina pētīt.

Cistanche tubulosa novērš nieru slimību, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu

1. Ievads

Hronisksnieresslimība (CKD) tiek uzskatīta par sabiedrības veselības problēmu. Tās izplatība pieaug līdz ar vecumu un svārstās no 11 līdz 13 procentiem visā pasaulē [1]. Lai gan HNS parasti ir neatgriezenisks stāvoklis, slimības progresēšanas palēnināšanai var izmantot vairākas pieejas, piemēram, asinsspiediena, dislipidēmijas un hiperglikēmijas kontrole, angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibitora lietošana un zema proteīna diēta [2–7] . Starp šīm stratēģijām diēta ar zemu proteīna saturu ir vislielākais apspriežamais priekšlikums par kavēšanosnieresfunkciju pasliktināšanās, jo pastāv bažas par tā atbilstību, drošību un efektivitāti. Vienprātības trūkums par olbaltumvielu samazināšanas priekšrocībām uzturā ir atkarīgs no olbaltumvielu un fosfātu satura pārklāšanās diētā. Tā kā olbaltumvielu avoti ir bagāti ar fosfātiem, ir ieteicams samazināt olbaltumvielu uzņemšanu, lai panāktu ierobežotu fosfātu uzņemšanu. Ir iespējams ierobežot proteīnu, neierobežojot fosfātu, lai gan pretējais ir grūti.

Eksperimentālajos pētījumos zema proteīna diētas ietekme pasargāja HNS modeļus no glomerulu bojājumiem un proteīnūrijas [8], veicinot lielāku glomerulārās filtrācijas ātruma saglabāšanu [9]. Jāņem vērā, ka uztura olbaltumvielas un fosfāti ir ļoti savstarpēji saistīti. Tāpēc, lai gan daži eksperimentālie pētījumi ir vērsti uz olbaltumvielu ierobežojuma izolētās ietekmes novērtēšanu, tie var būt arī neobjektīvi nejauša fosfātu ierobežojuma dēļ. No otras puses, ir skaidri pierādīts fosfātiem bagātas diētas individuālais ieguldījums HNS attīstībā [10, 11]. Tika pierādīts, ka diēta ar augstu fosfātu saturu izraisa vairāk intersticiālunieresfibroze un tubulārā atrofija ar minimālu glomerulosklerozi urēmiskām žurkām. Interesanti, ka pēc fosfātu ierobežošanas bojājumi tika samazināti [12]. Jāatzīmē, ka olbaltumvielu saturs uzturā šajā pētījumā netika minēts.

Klīniskajā scenārijā diēta ar zemu olbaltumvielu saturu samazināja urēmisko toksīnu koncentrāciju un saglabāja atlikušo nieru darbību, pat pārejot no konservatīvās aprūpes uz pakāpeniskas dialīzes shēmām [13].Diētisksolbaltumvielasierobežojums arī ir aizkavējis HNS progresēšanu nesen veiktā metaanalīzē [14]. Tomēr, tā kā olbaltumvielu ierobežojums bija saistīts ar zemāku fosfātu līmeni serumā, šo uztura labvēlīgo ietekmi daļēji varēja izskaidrot ar fosfātu ierobežojumu. Līdz šim lielākais perspektīvais pētījums, MDRD [15], parādīja tikai nelielu ieguvumu no diētas ar zemu olbaltumvielu saturu pacientiem ar mērenu nieru mazspēju, savukārt pacientiem ar smagu nieru mazspēju nieru slimības progresēšana netika ietekmēta. Tomēr šajā izmēģinājumā netika aplūkots fosfāta saturs uzturā un tā individuālā ieguldījuma palēnināšanās.CKDprogresēšana joprojām nav zināma.

Ir zināms, ka fosfāts var pazemināt nierēs un cirkulējošo Klotho [16], pretnovecošanās proteīnu, kas iesaistīts citoaizsardzībā un antifibrozē, ar antioksidantu un antiapopotisku iedarbību [17]. Turklāt jau ir pierādīta bojāta autofagija nieru šūnās Kloto deficīta dēļ [18]. Autofagija ir katabolisks process ar kritiskām funkcijām šūnu homeostāzes uzturēšanā un šūnu dzīvotspējas saglabāšanā stresa apstākļos. Daži pierādījumi liecina par saistību starp autofagiju un HNS progresēšanu, izmantojot dažādus ceļus, tostarp TGF-signalizāciju [19], kas ir spēcīgs fibrogēns faktors nieru fibrozes attīstībai. TGF- ietekmē vairākus bioloģiskos procesus, regulējot šūnu proliferāciju un diferenciāciju, apoptozi un darbojas, saistoties ar specifiskiem transmembrānas receptoriem, kas inducē intracelulāro signalizāciju, ko mediē SMAD proteīni [20]. Apoptoze ir ieprogrammētas šūnu nāves mehānisms, kas atšķiras no nekrozes. Fosfāts ir aprakstīts kā apoptozes starpnieks endotēlija [21], osteoblastu [22] un peritoneālo mezoteliālo šūnu [23] eksperimentālajos modeļos. Ir pierādījumi par apoptotisko šūnu nāves līdzdalību progresēšanānierestraumas [24], bet fosfāta ietekme uz nieru šūnu apoptozi vēl nav noskaidrota.

Tā kā mehānisms, ar kuru diēta ar augstu fosfātu saturu paātrina HNS progresēšanu, vēl nav pilnībā noskaidrots, mēs izvirzījām hipotēzi, ka tas varētu būt saistīts ar disfunkcionālu autofagisku cilvēku. Tāpēc pašreizējā pētījumā mēs novērtējām divas Minhenes-Vistaras žurku grupas pēc fosfātu satura to uzturā (zems 0,2 procenti pret augstu0,95 procenti) un pārbaudījām Diēta ar zemu fosfātu saturuniereshistoloģiskās un imūnhistoķīmiskās izmaiņas, tostarp autofagijas marķieris, beklins{0}}.

2. Rezultāti

Hemodinamiskie, morfoloģiskie un bioķīmiskie parametri, kas iegūti no zema (LoP) un augsta fosfātu satura diētas (HiP) grupām, ir norādīti 1. tabulā. Kā gaidīts, 5/6- nefrektomija izraisīja kreatinīna klīrensa samazināšanos un palielināšanos. seruma urīnvielas un kreatinīna līmenis abās grupās. Dzīvniekiem no HiP grupas bija zemāka nieru funkcija, par ko liecina augstāks kreatinīna līmenis un zemāks kreatinīna klīrenss; tiem arī bija zemāks hematokrīts un zemāks galīgais svars. HiP grupā palielinājās seruma un daļējas fosfāta izdalīšanās, kā arī parathormona (PTH) un fibroblastu augšanas faktora -23 (FGF-23) palielināšanās. Jāatzīmē, ka astes spiediens, sākotnējais svars un albumīna izdalīšanās ar urīnu grupās bija līdzīgas.

Histoloģiskie atradumi parādīti 1.–3. Abās grupās glomerulosklerozi (GS) tikko konstatēja. Tomēr intersticiālās fibrozes procentuālais daudzums bija ievērojami augstāks žurkām HiP grupā. Attiecīgi šiem dzīvniekiem bija arī lielāks - gludās muskulatūras aktīna iekrāsotās zonas procentuālais daudzums un lielāka makrofāgu infiltrācija nierēs, novērtējot pēc ED-1 ekspresijas, kā parādīts 2. tabulā. Fosforilētā SMAD (p-SMAD) ekspresija, TGF-beta ceļa aktivācijas marķieris, grupās neatšķīrās.

HiP grupā dominēja proliferatīvo šūnu kodola antigēna (PCNA) pozitīvās šūnas, kas liecina, ka fosfātu pārslodze veicināja intensīvāku nieru šūnu proliferāciju. Un otrādi, apoptotisko šūnu skaits bija lielāks LoP grupā. Tāpat beklīna 1-pozitīvās šūnas bija ievērojami augstākas tubulointersticiālos bojājumos LoP grupā, kas norāda uz iespējamu augstāka fosfāta ietekmi, inhibējot reģeneratīvo autofagisko procesu.nieresaudi.

3. Diskusija

Šajā eksperimentālajā pētījumā tika pētīts, vai fosfātu ierobežojums uzturā ir efektīvs solis, lai palēninātu CKD progresēšanu neatkarīgi no vienlaicīgas uztura olbaltumvielu ierobežošanas. Mēs pētījām dažādu fosfātu saturu ({{0}},2 pret 0,95 procentiem) diētu ietekmi 5/6-nefrektomijas dzīvnieku modelī, visi dzīvnieki saņēma diētu ar zemu olbaltumvielu saturu. (12 procenti). Mūsu atklājumi parādīja, ka diēta ar augstu fosfātu saturu bija saistīta ar hiperfosfatemiju, neskatoties uz PTH, FGF-23 palielināšanos un līdz ar to arī fosfātu daļēju izdalīšanos. Turklāt HiP izraisīja nieru darbības traucējumus un intersticiālās fibrozes palielināšanos, kas bija saistīta ar augstāku aktīna ekspresiju, makrofāgu infiltrāciju un šūnu proliferāciju, kā arī autofagijas inhibīciju.

Metaanalīze no 12 kohortas pētījumiem, kuros bija iesaistīti 25 546 HNS nedialīzes pacienti, parādīja neatkarīgu saistību starp fosfātu līmeni serumā,nieresneveiksmes un mirstība [25]. Turklāt retrospektīvs kohortas pētījums ar 13 772 pacientiem ar dialīzes gadījumiem atklāja saistību starp hiperfosfatemiju un citām CKD-minerālu un kaulu slimības anomālijām ar straujāku atlieku samazināšanos.nieresfunkcija [26]. Mehānisms, ar kuru fosfātu ierobežošana aizkavē CKD progresēšanu, vēl nav noteikts. Eksperimentālā pētījumā mēs parādījām, ka ar fosfātiem bagātināta diēta ir saistīta ar vairāk pavājinātu nieru darbību, salīdzinot ar diētu ar zemu fosfātu saturu Wistar žurkām, kurām tika veikta paratiroidektomija un 5/6-nefrektomija, izmantojot fiksētu epitēlijķermenīšu. hormonu (PTH) papildināšana [11]. Kusano et al. [10] parādīja, ka nieru funkcijas aizsardzība bija saistīta ar diētu ar zemu fosfātu saturu (0,3 procenti) neatkarīgi no urēmisko žurku uztura olbaltumvielu satura. Žurkas ar parasto fosfātu (0,5 procenti) diētu tomēr sniedza šīs priekšrocības tikai tad, ja tās baroja ar ļoti zemu olbaltumvielu (8,4 procenti) diētu. Kopumā šie rezultāti norāda, ka uztura fosfāta loma var būt spēcīgāka nekā uztura olbaltumvielas. Tomēr neviens no iepriekš minētajiem pētījumiem nemēģināja izpētīt iespējamos ceļus, kas varētu būt saistīti ar fosfātu izraisītiem nieru bojājumiem.

Fosfātu pārslodzes darbība HNS progresēšanā ir bijusi vairāku pētījumu priekšmets. Etiķetes et al. vispirms ierosināja šo iespēju dzīvnieku modelī, bet uztura [27] proteīns netika kontrolēts, kas, iespējams, maskēja izolēto fosfāta iedarbību. Iespējamais ieguvums no fosfātiem neatkarīga ierobežojuma, nevis proteīna ierobežojuma CKD scenārijā, ir ļoti interesants, jo risks kontrolēt fosfātu līmeni serumā kopā ar ierobežotu olbaltumvielu uzņemšanu var izraisīt nepietiekamu uzturu un lielāku mirstību.

Fosfātu diētas saturs ne vienmēr nosaka fosfātu koncentrāciju serumā HNS pacientiem [28], uzsverot uztura ierobežojuma nozīmi neatkarīgi no šī elementa koncentrācijas serumā. Fosfāta patoloģiskā ietekme uz kauliem un sirds un asinsvadu sistēmu motivē iejaukšanos hiperfosfatēmijas ārstēšanā. Klīniskajā praksē intervences, lai samazinātu fosfātu līmeni, sastāv no diētas ierobežojumiem un fosfātu saistvielām. Lai gan nelielas izlases pētījumā [29] šīs pieejas ieguvumi attiecībā uz klīniskajiem parametriem bija apšaubāmi, ņemot vērā zināšanas, ka fosfātu pārpalikums ir atbildīgs par PTH un FGF-23 pārprodukciju, ir saprātīgi saglabāt pēc iespējas zemāks fosfātu līmenis pacientiem ar HNS [30].

Diēta ar zemu olbaltumvielu saturu izraisa zemu fosfātu biopieejamību un samazina seruma FGF-23 [31,32], kas ir starpnieks no nātrija atkarīgās fosfāta reabsorbcijas nieru kanāliņu šūnās. Tas liek domāt, ka fosfātu regulēšanas mehānismu progresējošas CKD var kaut kādā veidā ietekmēt fosfātu uzņemšana pilnīgi neatkarīgi no olbaltumvielu diētas satura. Šī iemesla dēļ mēs esam novērtējuši fosfātu diētas ietekmi uz HNS progresēšanu, izmantojot 5/6-nefrektomijas modeli. Iepriekšējā eksperimentālā pētījumā jau ir pierādīts, ka fosfāts var mainīt antiproteinurisko reakciju uz diētu ar ļoti zemu olbaltumvielu saturu (0,3 g/kg), parādot korelāciju starp fosfātu līmeni serumā un fosfatūriju ar antiproteinurisko reakciju uz ierobežota olbaltumvielu diēta neatkarīgi no nieru darbības [33]. Krusteniskā pētījumā, kurā piedalījās 11 pacienti ar HNS (eGFR 30–55 ml/min/m2), seruma fosfātu diennakts ritms tika mainīts ar diētu ar augstu fosfātu saturu, kas nebija izskaidrojams ar fosfātu izdalīšanos urīnā, PTH vai FGF. -23 [34]. Šis rezultāts pastiprina fosfātu diētas ierobežojuma nozīmi HNS pacientiem kā neatkarīgu terapeitisko mērķi.

Šķiet, ka hemodinamiskais stāvoklis nav saistīts ar nieru darbības pasliktināšanos HiP grupā, jo arteriālais spiediens abās grupās bija līdzīgs. Turklāt mēs savā modelī neatradām nozīmīgus glomerulāru bojājumus, ko varētu izskaidrot ar olbaltumvielu ierobežojumu. Tomēr mēs novērojām vairāk intersticiālu fibrozi HiP diētas grupā.

Intersticiāla fibroze labi korelē ar nieru funkcijas zudumu cilvēkiem un žurkām.

Iepriekšējais pētījums ir saistīts ar nieru fibrozes attīstību, ko izraisa diēta ar augstu fosfātu saturu, izmantojot peptidil-prolilizomerāzes Pin 1 [35], turpretim citos dokumentos ir norādīts uz aKloto deficīta kaitīgo lomu.nieresaudu fibroze [36,37]. Kloto ģenētiskā dzēšana eksperimentālos modeļos izraisa novecošanos, augšanas aizkavēšanos un kalcifikāciju [38]. FGF23-Kloto signalizācija kavē fosfātu reabsorbciju nierēs. CKD apstākļos Kloto ekspresija ir samazināta nieru kanāliņos [39]. Turklāt fosfātiem bagāta diēta ir saasinājusi Kloto deficītu išēmijas-reperfūzijas akūtu nieru bojājumu modelī un vēl vairāk veicinājusi palielinātunieresaudu fibroze, paātrinot HNS progresēšanu [18]. Fosfātu diētas ietekme uz Klotho nieru ekspresiju jau tika pierādīta peļu modeļos [40]. Iespējams, starp citiem ceļiem fosfātu pārslodze pasliktina nieru darbību, modulējot Kloto ekspresiju uz kanāliņu šūnām; tas būtu sīkāk jāpēta turpmākajos pētījumos.

Apoptozi un fibrozi mediē citokīni, piemēram, TGF- [41,42]. Mēs esam aprakstījuši sekundārā hiperparatireozes saistību ar augstāku TGF ekspresiju sirds remodelācijas procesā [43]. Domājams, ka pastāv saistība starp PTH aktivāciju un TGF-signalizāciju, kas stimulē fibroblastu proliferāciju, kolagēna sintēzi un fibrozi. Ir pat eksperimentāli pierādījumi par TGF- un PTH receptoru integrētu iedarbību uz kaulu šūnām, regulējot kaulu remodelācijas signālus [44]. TGF-/Smad signalizācijas lomanieresslimība jau ir aprakstīta. TGF- saistās ar transmembrānu receptoru, izraisa Smads proteīnu fosforilēšanos un veicina to pārvietošanos uz kodolu, lai panāktu transkripcijas efektu. Tāpēc tie ir būtiski TGF saimes locekļu signālu pārraidei. Patiešām, Smad2 un Smad3 proteīnu pārmērīga ekspresija fibrotiskajās nierēs dzīvnieku modeļos ar CKD jau ir pierādīta [45]. Interesanti, ka ir pierādījumi, ka Smads aktivizē citi mediatori, kas nav atkarīgi no TGF-, piemēram, uzlabotie glikācijas galaprodukti [46] un angiotenzīns II [47]. Tā kā eksperimentālā modelī PTH aizstāšana neietekmēja hiperfosfatēmijas ietekmi uz HNS progresēšanu [11], mēs domājam, vai fosfātam būtu tieša loma nieru Smad signalizācijā. Mūsu modelī nebija hiperfosfatēmijas ietekmes uz p-Smad ekspresiju nieru kanāliņu šūnās.

Tomēr tas neizslēdz TGF ceļa aktivācijas iespēju neatkarīgi no Smads fosforilācijas. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai izpētītu šo alternatīvo ceļu.

Kaulu audu novērtējumā fosfātu pārslodze ir izraisījusi osteoblastiem līdzīgu šūnu apoptozi [22]. Rojas u.c. transplantēto pacientu kaulu biopsijās parādīja, ka apoptotisko šūnu skaits bija lielāks tiem, kuriem ir zems fosfātu līmenis un PTH, tas ietekmēs osteoblastu palielināšanos un apoptozes novēršanu [48]. Šī PTH inhibējošā ietekme uz kaulu šūnu apoptozi ir pierādīta iepriekš [49]. Papildus ietekmei uz kaulu audiem apoptotiskie ceļi ir saistīti arī ar akūtu nieru mazspēju [48] un varētu būt iespējams starpnieks HNS progresēšanā. Mūsu modelī mēs novērojām lielāku to šūnu īpatsvaru, kurām tika veikta apoptoze LoP grupā, bez statistiskas nozīmes. Šie apsvērumi liecina par traucētu apoptozes mehānismu, ko izraisa hiperfosfatēmija. Tomēr mums jāpatur prātā, ka nebija iespējams novērtēt fosfāta ekskluzīvo ietekmi uznieresaudu apoptozi, kad arī dzīvniekiem ir attīstījies PTH un FGF{0}} paaugstināšanās.

Pašreizējā pētījumā mēs pievērsāmies vēl vienam iespējamam nieru darbības traucējumu mehānismam, ko izraisījusi diēta ar augstu fosfātu saturu, proti, autofagijas disfunkcija, mērot proteīna beklīnu-1, regulējošo proteīnu, kas nepieciešams autofagosomu membrānas kodolu veidošanai [50]. Autofagija ir katabolisks ceļš, kas ietver šūnu komponentu degradāciju caur lizosomām [51,52]. Beklin-1 fosforilēšana tiek uzskatīta par autofagijai raksturīgu signālu fosfatidilinozīta-3-fosfātkināzes kompleksa aktivācijai un piesaistei autofagosomu bioģenēzes membrānas vietām [53]. Beklīna-1 notriekšana nomāc autofagiju [54], un išēmijas-reperfūzija palielina tās līmeni [55]. Beklīna{13}} samazināšanās un vienlaikus paaugstināta mTOR regulēšana samazina ļaundabīgo šūnu augšanu, izceļot autofagijas izdzīvošanu veicinošo efektu [52].

Klotho antifibrotiskā iedarbība bija saistīta arī ar pārregulētu autofagijas procesu, ceļu, caur kuru AKI modelī tika vājināts išēmisks ievainojums un to pasliktināja augsts fosfātu līmenis [18]. Eksperimentālie pētījumi ir parādījuši, ka autofagiskā plūsma mazina makrofāgu infiltrāciju un fosfātu izraisītu nieru fibrozi. Turklāt fosfātiem bagāta vide in vitro inducē mitofagiju cauruļveida šūnās [56]. Mūsu dati parādīja, ka fosfātu saturs uzturā arī modulēja beklīna -1 ekspresiju nieru kanāliņos in vivo. HiP diēta bija saistīta arī ar lielāku šūnu proliferāciju un tendenci uz zemāku apoptozes ātrumu, kā parādīts attiecīgi PCNA un TUNEL analīzē. Tomēr mūsu modelī nebija iespējams noteikt, vai tas notika kā tieša fosfātu pārslodzes ietekme vai PTH un FGF-23 līmeņa anomālijas, ko izraisīja hiperfosfatēmija. Šis konstatējums ir jāapstiprina klīniskajā scenārijā.

Galvenā šī pētījuma priekšrocība bija novērtēt fosfātu ierobežojuma ietekmi uz HNS progresēšanu uzturā ar zemu olbaltumvielu saturu, kas ietvēra tā ietekmes uz histoloģiskajiem modeļiem un molekulārajiem fenotipiem izpēti.nieresaudi. Cik mums zināms, šis ir pirmais pētījums, kas demonstrē beklīna{0}} ekspresijas modulāciju, kas ir autofagijas marķieris nieru kanāliņu šūnās, izmantojot fosfātu diētu in vivo. Galvenais ierobežojums bija neiespējamība nodalīt hiperfosfatēmijas ietekmi no citām ar CKD-MBD saistītām anomālijām, piemēram, paaugstināta PTH un FGF-23. Mēs arī nevarējām novērtēt diētu ar vidēju fosfātu saturu vai nieru Klotho ekspresiju. Tomēr mūsu modelis atveido reālās dzīves stāvokli, kur HiP diēta parasti ir saistīta ar hiperparatireozi un augstu FGF-23 līmeni.

4. Secinājumi

Kopumā šis pētījums sniedza pierādījumus tam, ka fosfātu diētai ir nozīme CKD progresēšanā, iespējams, palielinot intersticiālo fibrozi. Turklāt fosfātiem bagāta diēta var mainītnieresautofagijas process. No olbaltumvielām neatkarīga ceļa identificēšana, caur kuru fosfāts pasliktina nieru darbību, var pavērt svarīgu ceļu jaunu pieeju izstrādei, kuras mērķis ir novērst vai samazināt HNS progresēšanu klīniskā vidē.

5. Materiāli un metodes

Šajā pētījumā tika iekļauti pieauguši Minhenes-Wistar žurku tēviņi, kas iegūti no vietējās iestādes. Žurkas tika uzturētas 23 ± 1 ◦C temperatūrā ar gaisa mitrumu 60 ± 5 procentiem 12:12- h gaismas-tumsas ciklā. Visiem dzīvniekiem bija brīva piekļuve krāna ūdenim, un tie tika baroti ar zemu olbaltumvielu diētu (12 procenti olbaltumvielu). Dzīvnieki tika nogalināti divus mēnešus vēlāk, kad tika analizētas asinis, urīns un nieru audi. Visām žurkām tika noteikts astes manšetes spiediens, kreatinīna klīrenss un ikdienas albumīna izdalīšanās ar urīnu. Eksperimenta plāns ir parādīts A pielikumā (attēls A1).

5.1. Analītiskās metodes

Sešdesmit dienas pēc Nx dzīvnieki tika anestēzēti ar nātrija tiopentālu (50 mg / kg ķermeņa svara), un tika savākti asins paraugi. Kreatinīna koncentrācija serumā tika novērtēta ar kolorimetrisko metodi. Seruma albumīns, fosfāts, urīnviela, kalcijs un hematokrīts tika mērīti ar standarta metodēm. PTH tika mērīts ar ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, ASV). FGF-23 tika mērīts, izmantojot ELISA komplektu (KAINOS, Japāna) saskaņā ar ražotāja protokolu. Mēs aprēķinājām glomerulāro filtrāciju ar kreatinīna klīrensu, pamatojoties uz kreatinīna līmeni serumā un urīnā un izteikts ml/min, kas aprēķināts pēc formulas: urīna kreatinīns (mg/dL) × urīna biedrs (mL/min)/seruma kreatinīns (mg/dL). Urīna albumīns tika noteikts ar radiālo imūndifūziju.

-trešdaļas no kreisās pusesnieresaizverot divus vai trīs kreisās nieru artērijas zarus. Zilīgi operētām žurkām tika veikta anestēzija un manipulācijas ar nieru pedikulām, nesamazinot nieru masu. Pēc atveseļošanās no anestēzijas dzīvnieki tika atgriezti sākotnējos būros, kas tika sasildīti nākamo 24 stundu laikā.

Frakcionēta fosfāta (FEP) izdalīšanās tika iegūta no urīna un seruma fosfāta (mg/dl), urīna un seruma kreatinīna (mg/dL), un izteikta procentos ar šādu formulu: (urīns/seruma fosfāts)/ (urīns/serums). kreatinīns) × 100.

5.2. Eksperimentālās grupas

Dzīvnieki tika iedalīti divās grupās pēc fosfātu satura uzturā, kā norādīts tālāk: Zema fosfāta diēta (LoP): n=20; dzīvnieki saņēma TD-90016, 12 procentu proteīna diētu, modificēta, lai iegūtu 0,2 procentu fosfātu koncentrāciju. Diēta ar augstu fosfātu saturu (HiP): n=19; dzīvnieki saņēma TD-90016, 12 procentu olbaltumvielu diētu, kas modificēta, lai iegūtu 0,95 procentu fosfāta koncentrāciju.

5.3. Histoloģiskās metodes

Atlikumsnierestika perfūzēts in situ novērotajā MAP ar sāls šķīdumu un pēc tam ar Duboscq-Brasil šķīdumu fiksācijai. Pēc nosvēršanas divas koronālās nieru šķēles tika fiksētas buferētā 4 procentu formaldehīdā. Pēc tam nieru audi tika iestrādāti parafīnā un sagatavoti histomorfometrijai un imūnhistoķīmijai, kā aprakstīts iepriekš [57].

Visus morfometriskos novērtējumus 4-µm biezās daļās veica viens novērotājs, kas bija akls grupām. Katrai žurkai glomerulosklerozes (GS) smagums tika novērtēts sekcijās, kas iekrāsotas ar Šifa periodisko skābi (PAS), piešķirot katram glomerulam (uz vienu žurku tika pārbaudīts vismaz 120) punktu skaitu, lai novērtētu kušķa laukuma sklerozēto daļu. , un iegūstot GS indeksu (GSI) katrai žurkai, kā aprakstīts iepriekš [58]. Lai novērtētu intersticiālas izplešanās pakāpi, ar punktu skaitīšanas metodi tika novērtēts ar punktu skaitīšanas paņēmienu starp nieru garozas laukuma procentuālo daļu, ko aizņem intersticiāla fibroze (IF procenti) ar Masona krāsotajām sekcijām [59].

5.4. Imūnhistoķīmija

Četras µm biezas, parafīnā iestrādātas nieru sekcijas tika uzstādītas uz stikla priekšmetstikliņiem, kas pārklāti ar 6% silāna. Sekcijas tika deparafinētas, rehidrētas un pēc tam karsētas citrāta buferšķīdumā, lai uzlabotu antigēna izguvi. Tie tika iepriekš inkubēti ar 5 procentiem normāla truša (ED-1) vai zirga (aktīnam) serumu Tris buferšķīdumā (TBS) vai kazeīna bāzes proteīna bloku šķīdumā (Protein Block; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, ASV (PCNA, pSmad un Beclin)), lai novērstu nespecifisku saistīšanos. Inkubācija ar primāro antivielu tika veikta nakti 4 ◦C temperatūrā. Negatīvās kontroles tika veiktas, izlaižot primāro antivielu.

Tika izmantotas šādas primārās antivielas: monoklonāla peles anti-žurka ED-1 antiviela (Serotec, Oksforda, Apvienotā Karaliste) makrofāgu noteikšanai; peles monoklonāla anti-alfa gluda (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MI, ASV), aktīna noteikšanai; poliklonāla anti-Beclin 1 antiviela (Boster, Pleasanton, CA, ASV), autofagijas analīzei. Pēc mazgāšanas sekcijas tika inkubētas ar biotinilētu anti-peļu IgG (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, ASV) 45 minūtes, kam sekoja VECTASTAIN® ABC-AP komplekts, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA). , ASV) 30 min. Pēc tam sekcijas tika izstrādātas ar ātri sarkanas krāsas šķīdumu.

Monoklonālajai peles antiproliferējošam šūnu kodola antigēnam (Dako, Dānija) un fosfora-smad2 (Ser465/467) antivielām (Cell Signaling, Danvers, MA, ASV) endogēnā peroksidāzes inhibīcija tika veikta ar 3% ūdeņraža peroksīda šķīdumu un metanolu 30 min. Pēc tam sekcijas nakti inkubēja ar primāro antivielu mitrinātā kamerā 4 ◦C temperatūrā. Nākamajā dienā sekcijas 45 minūtes inkubēja ar biotinilētu anti-peļu IgG (H plus L) vai biotinilētu anti-žurku IgG (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, ASV), kam sekoja inkubācija ar VECTASTAIN® ABC- HRP komplekts (Vector, Burlingame, CA, ASV) 30 minūtes. Pēc tam sekcijas tika izstrādātas, izmantojot 3-amino-9-etilkarbazola substrāta hromogēnu (AEC) (Sigma Chemical, Sentluisa, MO, ASV). Visas sekcijas tika noskalotas destilētā ūdenī, pretkrāsotas ar Mayer's Hemalum šķīdumu (Merck, Darmštate, Vācija), kas pārklāts ar Kaiser's glicerīna želatīnu (Merck, Darmštate, Vācija).

Lai noteiktu intersticiālu nieru blīvumu ED-1, p-Smad, Beclin un PCNA, pozitīvo šūnu skaits/mm2 tika novērtēts aklā veidā ar 400x palielinājumu. Lai novērtētu aktīnu, mēs izmantojām punktu skaitīšanas paņēmienu, izmantojot mikroskopu ar 100-punktveida aci, kas savienota ar video monitoru. Mēs analizējām 25 laukus ar palielinājumu 3200. Rezultāti tika izteikti procentos, ņemot vērā kopējo platību.

5.5. Apoptoze

Apoptoze nieru kanāliņu šūnās tika noteikta ar TUNEL metodi (TdT mediēta X-dUTP Nick gala marķēšana), izmantojot norādījumus, ko sniedz Apoptag plus Peroxidase in Situ apoptozes noteikšanas komplekts (S7101, Millipore Sigma, MA, ASV). Apoptotiskās šūnas tika analizētas 25 laukos ar palielinājumu 1000x, lai iegūtu galīgo vērtību, kas izteikta šūnās/mm2.

5.6. Statistiskā analīze

Atšķirības starp LoP un HiP grupām tika pārbaudītas, izmantojot attiecīgi neatkarīgu Studenta testu vai Mann-Whitney testu. Attiecības starp mainīgajiem tika pārbaudītas pēc Spīrmena korelācijas koeficienta. Dati tiek parādīti kā vidēji ± SE, ja vien nav norādīts citādi. P-vērtība<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Finansējums:Šo pētījumu atbalstīja Sanpaulu pētniecības fonds (FAPESP — Grant #. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz un Elias atbalsta CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico), taču šim finansiālajam atbalstam nebija nozīmes šī raksta tapšanā.

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums:Šis pētījums tika veikts saskaņā ar vietējās ētikas pārbaudes padomes ieteikumiem. Protokolu apstiprināja Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, process Nr. 090/10 un apstiprināšanas datums 2010. gada 10. augusts). Visas eksperimentālās procedūras stingri ievēroja starptautiskos standartus manipulācijām ar laboratorijas dzīvniekiem un to kopšanu.

Paziņojums par datu pieejamību:Šajā pētījumā sniegtie dati ir pieejami pēc attiecīgā autora pieprasījuma.

Pateicības:Autori pateicas Vāgneram Domingesam par viņa ekspertu tehnisko palīdzību. Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Hill, NR; Fatoba, ST; Labi, JL; Hērsts, JA; O'Kalagana, Kalifornija; Lasersons, DS; Hobbs, FD Hroniskas slimības izplatība pasaulēnieresslimība — sistemātisks pārskats un metaanalīze. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.

2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lī, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; un citi. Diabēts ar agrīnunieresiesaistīšanās var saīsināt paredzamo dzīves ilgumu par 16 gadiem. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.

3. Kakinuma, Y.; Kavamura, T.; Bills, T.; Jošioka, T.; Ičikava, I.; Fogo, A. Angiotenzīna inhibīcijas no asinsspiediena neatkarīga ietekme uz hroniskas nieru mazspējas asinsvadu bojājumiem.NieresInt. 1992, 42, 46–55.

4. Cepts, LF; Augļu dārzs, TJ; Kasiske, BL Lipīdu samazināšanas ietekme uz nieru slimības progresēšanu: metaanalīze.NieresInt. 2001, 59, 260–269.

5. Išidoja, S.; Morisejs, Dž.; Makkrekens, R.; Rejs, A.; Klahr, S. Angiotenzīna II receptoru antagonists uzlabo nieru tubulointersticiālu fibrozi, ko izraisa vienpusēja urētera obstrukcija.NieresInt. 1995, 47, 1285–1294.

6. Audižjē, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brauns, Ņūdžersija; Fogo, AB Esošās glomerulosklerozes regresija, inhibējot aldosteronu. J. Am. Soc. Nefrols. 2005, 16, 3306–3314.

7. Nath, KA; Krēns, SM; Hostetter, TH Uztura proteīnu ierobežojums konstatētu nieru bojājumu gadījumā žurkām. Glomerulārā kapilārā spiediena selektīva loma progresējošā glomerulārā disfunkcijā. Dž.Klins. Izpētīt. 1986, 78, 1199–1205.

8. Brenners, BM; Meiers, TW; Hostetter, TH Olbaltumvielu uzņemšana uzturā un progresējošais rakstursnieresslimība: hemodinamiski mediētu glomerulu bojājumu loma progresējošas glomerulārās sklerozes patoģenēzē novecošanās, nieru ablācijas un iekšējās nieru slimības gadījumā. N. Engl. J. Med. 1982, 307, 652–659.

9. Bellizzi, V. Zema proteīna diēta vai uztura terapija hroniskasnieresslimība? Asins attīrīšana. 2013, 36., 41.–46.

10. Kusano, K.; Segava, H.; Ohniši, R.; Fukušima, N.; Miyamoto, K. Zema proteīna un zema fosfora diētas loma hroniskas slimības progresēšanānieresslimība urēmiskām žurkām. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008, 54, 237–243.

11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reiss, LM; Paskvaluči, Kalifornija; Moyses, RM; Jorgetti, V. Hiperfosfatēmijas nelabvēlīgā ietekme uz miokarda hipertrofiju, nieru darbību un kauliem žurkām ar nieru mazspēju.NieresInt. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]

12. Finčs, JL; Lī, DH; Liapis, H.; Riters, C.; Džans, S.; Suaress, E.; Ferders, L.; Slatopolsky, E. Fosfātu ierobežošana ievērojami samazina mirstību urēmiskām žurkām ar konstatētu asinsvadu kalcifikāciju. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.

13. Cupisti, A.; Blasko, P.; D'Alesandro, C.; Džiannē, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Atlikušo nieru funkciju aizsardzība un uztura ārstēšana: pirmā soļa stratēģija urēmisko toksīnu samazināšanai nieru slimības beigu stadijas pacientiem. Toksīni 2021, 13, 289.

14. Jans, B.; Su, X.; Sju, B.; Qiao, X.; Vangs, L. Uztura olbaltumvielu ierobežojuma ietekme uz hroniskas slimības progresēšanunieresslimība: sistemātisks pārskats un metaanalīze. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]

15. Klahr, S.; Levijs, AS; Beks, Dž. Caggiula, AW; Hansikers, L.; Kusek, JW; Striker, G. Uztura olbaltumvielu ierobežojuma un asinsspiediena kontroles ietekme uz hroniskas nieru slimības progresēšanu. Uztura modifikācija nieru slimību pētījuma grupā. N. Engl.

J. Med. 1994, 330, 877–884. [CrossRef]

16. Hu, MC; Ši, M.; Čo, HJ; Adamss-Hūts, B.; Paeks, J.; Kalns, K.; Šeltons, Dž.; Amaral, AP; Fauls, C.; Taniguči, M.; un citi. Kloto un fosfāts ir patoloģiskas urēmiskās sirds remodelācijas modulatori. J. Am. Soc. Nefrols. 2015, 26, 1290–1302.

17. Hu, MC; Ši, M.; Čo, HJ; Džans, Dž.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huangs, LJ; Moe, OW Eritropoetīna receptors ir Kloto izraisītas citoaizsardzības pakārtots efektors. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.

18. Ši, M.; Flores, B.; Džilinzs, N.; Bjans, A.; Čo, HJ; Jans, S.; Liu, Y.; Levīns, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho mazina AKI progresēšanu uz CKD, aktivizējot autofagiju. J. Am. Soc. Nefrols. 2016, 27, 2331–2345.

19. Dings, Y.; Kims, S.; Lī, SY; Kū, JK; Van, Z.; Choi, ME Autofagija regulē TGF-beta ekspresiju un nomācnieresfibroze, ko izraisa vienpusēja urētera obstrukcija. J. Am. Soc. Nefrols. 2014, 25, 2835–2846.

20. Moustakas, A.; Součeļnickis, S.; Heldin, CH Smad regulēšana TGF-beta signāla transdukcijā. J. Cell Sci. 2001, 114, 4359–4369.