Ģenētiskās testēšanas loma nieru slimību pediatrisko pacientu diagnostikas darbā: vienas iestādes pieredze

AbstraktsMērķisIedzimtas nieru slimības ir viens no galvenajiem bērnu nieru mazspējas cēloņiem, kā rezultātā palielinās mirstība, augstas veselības aprūpes izmaksas un nepieciešamība pēc orgānu transplantācijas. Nākamās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģijas var palīdzēt diagnosticēt retas monogēnas slimības, ļaujot optimizēt medicīnisko vadību un terapeitiskās izvēles.

Metodes Klīniskā eksomu sekvencēšana (CES) tika veikta 191 pediatriskā pacienta grupai no vienas iestādes, kam sekoja Sangera sekvencēšana, lai apstiprinātu identificētos variantus un ģimenes segregācijas pētījumiem. Rezultāti Visiem pacientiem bija nieru slimības klīniskā diagnoze: galvenās slimību kategorijas bija glomerulārās slimības (32,5%), ciliopātijas (20,4%), CAKUT (17,8%), nefrolitiāze (11,5%) un kanāliņu slimība (10,5%). 7,3% pacientu bija citi stāvokļi. Pārliecinošs ģenētiskais tests, pamatojoties uz CES un Sanger validāciju, tika iegūts 37, 1% pacientu. Visaugstākais noteikšanas līmenis tika sasniegts ciliopātijas (74,4%), kam sekoja nefrolitiāze (45,5%) un kanāliņu slimības (45%), savukārt lielākā daļa glomerulāro slimību un CAKUT netika diagnosticētas. Secinājumi Rezultāti liecina, ka ģenētiskā testēšana, ko konsekventi izmanto diagnostikas darbplūsmā bērniem ar hronisku nieru slimību, var (i) apstiprināt klīnisko diagnozi, (ii) nodrošināt agrīnu diagnostiku iedzimtu stāvokļu gadījumā, (iii) un iepriekš neatpazītu slimību ģenētisko cēloni. slimības un iv) pielāgotas transplantācijas programmas.

Atslēgvārdi Klīniskā eksomu sekvencēšana, Nākamās paaudzes sekvencēšana,Nieru slimības, ģenētiskā testēšana, bērnu kohorta

KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTU CISTANCHE PARNIERU SLIMĪBA BEIGĀS STĀDES

Ievads

Pediatriskās nefropātijas ietver ļoti dažādas slimību vienības klīniskā attēlojuma, evolūcijas un terapeitisko iespēju ziņā [1–4]. Apmēram 30% bērnu ar hronisku nieru slimību (HNS) cieš no monogēna stāvokļa, procentuālais daudzums palielinās, ja tiek ņemti vērā bērni ar beigu stadijas nieru slimību (ESRD) [5, 6]. Daudzi no šiem bērniem transplantācijas laikā netiek diagnosticēti [4, 6, 7]. Diagnozes noteikšana šiem pacientiem nozīmē ne tikai diagnostiskās odisejas beigas, bet arī vairākas priekšrocības prognozēšanai, vadībai un ārstēšanai.

Novatoriskie pētījumi ir konsekventi parādījuši, ka nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) metožu ieviešana ir ievērojami uzlabojusi diagnostikas rezultātus pacientiem ar iedzimtām nieru slimībām (IKD) [8]. Pavisam nesen plaši izplatītā NGS izmantošana ir padarījusi pieejamu ģenētisko diagnozi saprātīgā laikā un par pieņemamām izmaksām, radot jautājumu par to, vai un kad tā būtu jāintegrē ikdienas diagnostikas darbplūsmā [5].

Ģenētiskā diagnoze bērniem ir ļoti svarīga dažādos aspektos. Pirmais ir tas, ka tas var būt nozīmīgs slimības klīniskajā pieejā, tipisks piemērs ir nefrotisko sindromu gadījums, kad strukturālo variantu identificēšana ar podocītiem saistītos gēnos ir pretrunā imūnsupresīvām terapijām, kuras citādi tiktu regulāri lietotas vairāku gadu laikā. mēneši [9]. Otrais ir tas, ka tas var būt ļoti svarīgi bērna ģimenei un citu locekļu identificēšanai, kuri pārnēsā variantu, kas, iespējams, tiks nodots nākamajām paaudzēm. Kad probandā ir identificēts patogēns variants, ģimenes locekļu kaskādes testēšana un ģenētiskās konsultācijas variantu nesējiem ir standarta prakse klīniskajā ģenētikā [5]. Trešais ir tas, ka patogēnā varianta pārzināšana ir būtiska transplantācijas kontekstā, kur donors var būt radinieks. Patiešām, ir ļoti svarīgi izslēgt viena un tā paša varianta(-u) klātbūtni orgānu donorā, kā arī ir svarīgi identificēt visus ģimenes locekļus, kuriem potenciāli nepieciešama transplantācija. Ceturtais ir tas, ka dažām slimībām ir augsts recidīva risks pēc orgānu transplantācijas, piemēram, fokusa segmentālā glomeruloskleroze [10], vai arī to iznākumu var uzlabot, pielāgojot veicamo transplantāciju, piemēram, primārās transplantācijas gadījumā. hiperoksalurija, kur kombinēta nieru un aknu transplantācija var radīt labāku iznākumu [11]. Visbeidzot, skaidra slimības diagnoze var būt noderīga, lai pacients varētu piedalīties klīniskajos pētījumos un gūt labumu no jaunām ārstēšanas iespējām [12, 13].

2018. gada beigās, sadarbojoties bērnu nefrologiem un ģenētiķiem, mēs sākām veikt ģenētiskos testus monogēnu stāvokļu noteikšanai, kas potenciāli var izraisīt ESRD un līdz ar to transplantāciju. Mūsu slimnīca ir lielākā Itālijas ziemeļrietumu daļā, kur atrodas aptuveni 5 miljoni cilvēku. Mēs izvēlējāmies "viens izmērs der visiem" analīzi ar klīniskā eksoma secību, ti, aptuveni 6700 gēnu, kas ir saistīti ar monogēniem apstākļiem, koncentrējoties uz analīzi uz gēnu paneļiem, kas pielāgoti klīniskajām aizdomām un tādējādi ierobežojot nejaušus atklājumus un samazinot laiku secības analīzei.

Kopumā, izmantojot šo cauruļvadu, mēs ieguvām diagnostikas rezultātu saskaņā ar publicētajiem datiem ar zināmu neviendabīgumu starp dažādām klīniskām aizdomām, kā paredzēts. Iegūtie rezultāti apstiprina ikdienas ģenētisko testu un konsultāciju iekļaušanu nefropātijas skarto pediatrisko pacientu diagnostikas darbplūsmā. Patiešām, izraisošo variantu identificēšana ir būtiska to klīniskajai vadībai un, iespējams, optimālai dzīvu donoru atlasei.

materiāli un metodes

Pacientu vervēšana

Pētījuma pamatā bija 191 secīga pediatriskā pacienta diagnostikas grupa (vecums pieņemšanas brīdī < 18 gadus vecs), ko pieņēma darbā Regīnas Margeritas bērnu slimnīcas Pediatrijas nefroloģijas, dialīzes un transplantācijas nodaļas un nosūtīja uz Imunoģenētikas un transplantācijas bioloģijas dienestu. ģenētiskā analīze. Visi pētījumā iekļautie pacienti pēc iespējas sniedza rakstisku informētu piekrišanu, ko parakstīja abi vecāki.

Paraugu sagatavošana, sekvencēšana un bioinformātikas analīzes

Nukleīnskābju ekstrakcija no perifērajām asinīm, DNS kvalitātes analīze, bibliotēkas sagatavošana un sekvencēšana tika veikta, kā ziņots iepriekš [14]. No sekvencēšanas iegūtie neapstrādātie dati tika pārveidoti FASTQ failos un pēc tam saskaņoti ar Enrichment 3.1.0 vai DRAGEN bagātināšanas rīkiem (Illumina) un kartēti TruSight One Expanded v2.{5}} manifestā, izmantojot Homo Sapiens UCSC GRCh37 genomu kā atsauce, lai iegūtu viena nukleotīda variantus, kopiju skaita variantus (CNV) un failu strukturālos variantus. Kopiju skaita identificēšanai tika izmantota bāzes līnija, kas izveidota no 5 dažādu pacientu sekvencēšanas datiem, kuri visi bija negatīvi attiecībā uz CNV (atbilstoši masīva salīdzinošajiem genoma hibridizācijas datiem). Šī pieeja ļauj noteikt CNV pat seksuālās hromosomās, jo atsauces grupā bija gan sievietes, gan vīrieši, un analizējamā subjekta dzimums vienmēr tika norādīts izlīdzināšanas fāzē. Variantu izsaukšana un prioritāšu noteikšana tika veikta pēc noteiktiem kritērijiem. Interesējošā gēna nolasījumu izlīdzināšanu un eksonu pārklājumu pārbaudīja un rādīja Integrative Genomics Viewer IGV, kas ir brīvi pieejams UC Sandjego Kalifornijas Universitātē un MIT Plašajā institūtā un Hārvardas universitātē Bostonā (//software.broadinstitute. org/ software/igv/). Varianti, kas jāiekļauj galīgajā ģenētiskajā ziņojumā, tika klasificēti saskaņā ar Amerikas Medicīnas ģenētikas un genomikas koledžas (ACMG) kritērijiem.

In silico gēnu slimību saraksta izveide

Gēni, kas jāņem vērā variantu identificēšanai un prioritāšu noteikšanai, tika noteikti, pamatojoties uz klīniskajām aizdomām. In silico gēnu saraksti tika izveidoti, saskaņojot (i) datus no dažādām datu bāzēm, korelējot genotipu ar fenotipu (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) un (ii) datiem no literatūras. Pieejamie gēnu saraksti tiek atjaunināti reizi gadā, pamatojoties uz jauniem gēnu slimību asociācijas pierādījumiem.

Sangera sekvencēšana un no ligācijas atkarīgā zondes pastiprināšana (MLPA)

Sangera sekvencēšanas un/vai MLPA analīzes tika veiktas, lai apstiprinātu NGS identificētos variantus un ģimenes segregācijas pētījumus. Īsumā, DNS tika iegūta, sākot no otras neatkarīgas probandas perifēro asiņu alikvotas daļas un no vecākiem. Interesējošie DNS reģioni tika pastiprināti ar PCR, izmantojot īpašus eksperimentālos apstākļus. Pastiprināto reģionu tīrība un specifika tika pārbaudīta ar 0,8 vai 1,5% agarozes gelu. Pastiprinātie PCR produkti pēc tam tika sekvencēti, izmantojot tos pašus primerus. PKD1 variantiem validācija tika veikta, izmantojot liela attāluma PCR, kam sekoja ligzdots PCR, lai izvairītos no jebkādiem secinājumiem no pseidogēniem.

Rezultāti

Ģenētiskās analīzes rezultātu atgriešanas kritēriju noteikšana

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gēnu, kas visi ir iesaistīti dažādās nieru slimību formās [14]. Šim pētījumam mēs ieviesām analīzi ar apakšpaneļiem, kas koncentrējās uz konkrētu aizdomu klīnisko kategoriju (piemēram, CAKUT, glomerulopātija, tubulopātija utt.), Un iepriekš analizējām konkrētu gēnu grupu. Šī pieeja ierobežoja analizēto gēnu skaitu, vienkāršojot analīzes un samazinot nejaušu atradumu skaitu. Tikai tad, kad analītiskā lauka beigās ar attiecīgo(-iem) paneli(-iem) ģenētiskais rezultāts bija negatīvs un (i) klīniskais fenotips nebija skaidri norādīts vai (ii) pārklājas dažādas slimību kategorijas, ģenētiskā analīze tika attiecināta uz t.s. "nieru pilns saraksts vai nieres", superpanelis, kurā ir visi apakšpaneļos iekļautie gēni.

Kā pirmo soli mēs definējām kritēriju kopumu NGS rezultātu interpretācijai. Pēc klīniskās eksomu sekvencēšanas (CES) un datu saskaņošanas tika noteikts analīzes cauruļvads, lai filtrētu attiecīgos variantus. Konkrēti, pamatojoties uz klīniskām aizdomām, identificētie varianti tika filtrēti, pamatojoties uz in silico gēnu sarakstiem, kas ir raksturīgi dažādām slimību makrokategorijām. Sinonīmi varianti, kas neietekmē splicēšanas mehānismu, vai iekšējie varianti, kas nav kartēti savienojuma reģionā, tika izslēgti, ņemot vērā tikai nesinonīmos, muļķīgos, kadru nobīdes un savienojumus ietekmējošos variantus. Tika iekļauti tikai desmit reti sastopami varianti (biežums mazāks par 1% populācijā) un varianti, kuru alēļu biežums pacientam ir vismaz 0,2 un vismaz 20 nolasījumu pārklājums. Atlikušie varianti tika anotēti un tālāk atlasīti, pamatojoties uz (i) mantojuma veidu, (ii) nukleotīdu saglabāšanu, (iii) olbaltumvielu ietekmi, izmantojot dažādas datu bāzes, lai pārbaudītu punktu skaitu, un (iv) literatūru, ja tāda ir. Šajā brīdī filtrētie varianti tika uzskaitīti tā sauktajā "tehniskajā ziņojumā". Tehnisko ziņojumu interpretēja medicīnas ģenētiķis, lai sagatavotu galīgo ģenētisko ziņojumu pacientam un viņa ģimenei. Ģenētiskās konsultācijas laikā tika ierosināti ģimeņu segregācijas pētījumi, lai (i) apstiprinātu variantus probandā un (ii) iekļautu/izslēgtu variantus, kas nav izraisījuši, pamatojoties uz to segregāciju ģimenē (1. att.).

Pieņemot šos kritērijus, mēs varējām definēt trīs dažādas ģenētisko ziņojumu kategorijas. Pirmkārt, "pārliecinošs ziņojums", kas ietvēra patogēnos (C5) un iespējamos patogēnos (C4) variantus. Ziņojumi par nezināmas nozīmes variantiem (C3) tika uzskatīti par pārliecinošiem tikai tad, ja tie pilnībā atbilst klīniskajam attēlam un ja ģimenes segregācijas pētījumi apstiprināja to iespējamo lomu. Otrkārt, "neskaidrs ziņojums", kurā bija iekļauti CES identificētie C3 varianti, kas vēl nav vai nevarēja tikt apstiprināti ģimenes segregācijas pētījumu kontekstā, vai C4/C5 varianti, kas pilnībā neatbilda klīniskajam fenotipam. Treškārt, "nepārliecinošs ziņojums", kas ietvēra (i) negatīvu CES analīzi, kas nozīmē, ka NGS nav identificējis nevienu variantu; ii) atsevišķi varianti recesīvos gēnos; un iii) C3 varianti, kas neatbilst klīniskajam fenotipam, kas identificēti, kad analīzi attiecināja uz visiemar nieru slimībām saistītie gēni(1. att.).

Savervētās kohortas galvenās iezīmes

Šajā pētījumā ir aprakstīta 191 pediatriskā pacienta grupa (0–18 gadus veca), kurus Pediatrijas nefroloģijas nodaļa no 2018. gada novembra līdz 2022. gada maijam secīgi nosūtīja ģenētiskai analīzei, un katru gadu tiek reģistrēti vidēji 50 jauni pacienti. . Ģenētiskās testēšanas kritēriji bija (i) nefropātija, kas saistīta ar pozitīvu nieru slimību ģimenes anamnēzē vai (ii) klīniskas aizdomas par monogēnu stāvokli, vai (iii) nepieciešamība izslēgt monogēnu stāvokli (kā nefrotisko sindromu gadījumā, ja ir atšķirības). monogēnas un nemonogēnas slimības ir klīniski nozīmīgas prognozēšanai un ārstēšanai).

Grupa tika sadalīta, pamatojoties uz klīniskajām aizdomām, ņemot vērā 6 dažādas slimības makrokategorijas: iedzimtas nieru un urīnceļu anomālijas (CAKUT; n=34), ciliopātijas (n=39), glomerulopātijas. (n=62), nefrolitiāzi (n=22), tauopātijas (n=20) un citas slimības, kas ietvēra arī sindromiskus fenotipus (n=14). Izņemot CAKUT un tubulopātijas, kas uzrādīja vienādu sadalījumu starp sievietēm un vīriešiem, visās pārējās kategorijās bija vīriešu dzimuma subjektu izplatība (2.a attēls). Aplūkojot darbā pieņemšanas vecumu, starp dažādām grupām netika izcelts būtiski atšķirīgs sadalījums, vidējais vecums bija attiecīgi no 6,7 līdz 10 gadiem "Citu slimību" un glomerulopātiju gadījumā. Tomēr, aplūkojot vidējo vecumu, CAKUT slimības uzrādīja viszemāko vērtību (4,6 gadi), ievērojot iedzimtu fenotipu. No etniskās piederības viedokļa, neatkarīgi no aplūkotās slimības makrokategorijas, lielākā daļa pacientu bija eiropieši, kam sekoja afrikāņi, un tikai daži pacienti bija aziāti, latīņamerikāņi vai krustojumi (2.b attēls). No kohortas tikai 8 pacientiem bija radniecīgi vecāki.

1. att. Ģenētisko datu analīzes konveijera un variantu iekļaušanas kritēriji. Analītiskā cauruļvada shematisks attēlojums, kas pieņemts variantu identificēšanai un prioritāšu noteikšanai, ieskaitot visus filtrēšanas un filtrēšanas kritērijus. Iegūtie varianti tika iekļauti galīgajā ģenētiskajā ziņojumā. Kad vien iespējams, tika veikti variantu(-u) validācijas un ģimeņu segregācijas pētījumi. Ģenētiskie ziņojumi tika klasificēti kā pārliecinoši, neskaidri vai nepārliecinoši, pamatojoties uz norādītajiem kritērijiem. Pamatojoties uz šo klasifikāciju, tika aprēķināts mūsu nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) darbplūsmas diagnostikas ātrums. 1 kg: 1000 genomu datubāze; Alt fr: mainīta frekvence; C3: nezināmas nozīmes variants; C4: iespējamais patogēns variants; C5: patogēns variants; AR: autosomāli recesīvs

Visbeidzot, ņemot vērā nieru slimību ģimenes anamnēzi, atsevišķi aplūkojot vīriešus un sievietes, bija acīmredzama neviendabība sadalījumā starp pozitīvajiem un negatīvajiem gadījumiem, ņemot vērā dažādās slimību kategorijas. Kopumā lielākajai daļai darbā pieņemtās kohortas un neatkarīgi no dzimuma nebija raksturīga pozitīva ģimenes anamnēze, kā parādīts CAKUT, glomerulopātijām, tauopātijām un citiem nieru darbības traucējumiem. Tomēr ciliopātijas un nefrolitiāzes gadījumā ievērojama daļa gadījumu bija ar pozitīvu ģimeni ar atšķirīgu sadalījumu starp sievietēm un vīriešiem (13 gadījumi no 22 attiecībā uz ciliopātijām un 5 no 12 gadījumiem ar nefrolitiāzi; 2.c attēls).

No klīniskā viedokļa kohorta bija diezgan neviendabīga ar dažādām primārajām slimībām (2.d attēls). Tostarp biežākās klīniskās aizdomas bija policistiska nieru slimība (n=27), CAKUT (n=25), nefrotiskais sindroms (n=19), fokālā segmentālā glomeruloskleroze (FSGS; n =14) un Alporta sindroms (n=13; 2.d attēls).

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTU DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 25% EHINAKOZĪDU UN 9% AKTEOZĪDU NIERU INFEKCIJAI