Smadzeņu audu lejupejošās proteomikas uzlabošana ar FAIMS 2. daļa

Datu analīze

Proteoformas identifikācija tika veikta ar TopPIC versiju 1.3.53. Iestatījumi TopPIC ietvēra prekursora logu 3 m/z (lai ņemtu vērā izotopu apvalku), masas kļūdas toleranci 15 ppm, maksimālo/min nezināmu masas nobīdi 500 Da un maksimālo. atļauto nezināmo modifikāciju skaits no 1.

Pēdējos gados arvien vairāk pētījumu ir parādījuši, ka pastāv cieša saikne starp olbaltumvielu morfoloģiju un atmiņu. Olbaltumvielas ir vissvarīgākās molekulas dzīves aktivitātēs. Viņi spēj kontrolēt šūnu dzīves aktivitātes un uzturēt normālu cilvēka ķermeņa darbību. Pētījumos atklāts, ka proteīnu morfoloģijai ir ne tikai svarīga loma šūnu dzīves aktivitātēs, bet arī neatņemama saistība ar atmiņas funkciju smadzenēs. Tiklīdz olbaltumvielu morfoloģija mainīsies, tā ietekmēs savienojumu starp neironiem, tādējādi ietekmējot cilvēku atmiņas spēju.

Agrīnās dzīves stadijās olbaltumvielu morfoloģijas izmaiņām ir būtiska nozīme smadzeņu attīstībā un darbībā. Ja olbaltumvielu morfoloģija nav tāda, kādai tai vajadzētu būt, tas izraisīs virkni neiroloģisku problēmu, kas galu galā novedīs pie atmiņas zuduma, kognitīviem traucējumiem utt.

Tomēr nav jāuztraucas. Mūsdienu medicīnas tehnoloģijas ir ļāvušas cilvēkiem pielāgot olbaltumvielu morfoloģiju, izmantojot diētu, lai uzlabotu atmiņu. Bagātīgs un daudzveidīgs uzturs ir bagāts ar olbaltumvielām, taču, izvēloties olbaltumvielas, mēģiniet izvēlēties pārtiku ar zemu tauku saturu, zemu holesterīna un zemu ogļhidrātu saturu, lai izvairītos no pārmērīgas uzņemšanas nelabvēlīgās ietekmes uz organismu.

Īsāk sakot, olbaltumvielu morfoloģija un atmiņa nav atdalāmas. Mums vajadzētu pievērst uzmanību veselīgam uzturam un sabalansētam olbaltumvielu patēriņam, lai saglabātu labu veselību, vienlaikus saglabājot labu atmiņu. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo tai ir antioksidanta, pretiekaisuma un pretnovecošanās iedarbība, kas var palīdzēt samazināt oksidācijas un iekaisuma reakcijas smadzenēs, tādējādi aizsargājot cilvēka veselību. nervu sistēma. Turklāt Cistanche var arī veicināt nervu šūnu augšanu un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot neironu tīklu savienojamību un darbību. Šie efekti var palīdzēt uzlabot atmiņu, mācīšanās spējas un domāšanas ātrumu, kā arī var novērst kognitīvo disfunkciju un neirodeģeneratīvo slimību rašanos.

Noklikšķiniet uz Zināt, lai uzlabotu īstermiņa atmiņu

MS2 spektri tika meklēti, salīdzinot ar datubāzi, kas savienota ar ierakstiem no Homo sapiens Swiss-Prot (20 352), Swiss-Prot splicevariants (22, 000) un TrEMBL (54 436), kā arī parastajiem piesārņotājiem. Identificētās proteoformas tika filtrētas līdz viltus atklāšanas līmenim (FDR) 1%, izmantojot TopPIC.

Pakārtotā datu analīze tika veikta R vidē statistikas skaitļošanai un figūru ģenerēšanai.54 Pakārtotajā analīzē proteoformas no viena un tā paša gēna ar vienādām sākuma un beigu aminoskābēm, kas tika konstatētas ±5 Da robežās, tika apvienotas kā viena proteoforma, lai palielinātu stingrību. mūsu uzdevumiem.

Lai gan 5Da slieksnis ir patvaļīgs, šī pieeja kompensēja nepareizi piešķirtos monoizotopiskos pīķus, neskaidrības nezināmās masas nobīdēs un citas artefaktas novirzes. Lai noteiktu proteoformu relatīvo standartnovirzi (RSD) atkārtojumos, mēs izmantojām TopPIC “iezīmes intensitātes” izvadi.

Fragmentācijas secību pārklājuma kartes un saistītie spektri tika ģenerēti, izmantojot LCMsSpectator programmatūru.55

Konkrētie LCMsSpectator iestatījumi ietvēra prekursoru jonu pielaidi 10 ppm, ražošanas pielaidi 10 ppm, minimālo S/N slieksni 1,5, Pīrsona korelācijas slieksni 0,7, noklusējuma izlīdzināšanu 9 punktus, un prekursora izotopu relatīvās intensitātes slieksnis 0,1.

REZULTĀTI UN DISKUSIJA

FAIMS pievienošana ievērojami palielina proteomu pārklājumu

Garozas audu paraugs no pacienta, kuram diagnosticēta Alcheimera slimība, tika apstrādāts pēc darbplūsmas, kā parādīts 1. attēlā. Vispirms mēs centāmies analizēt FAIMS veiktspēju dažādos CV, salīdzinot ar tiem, kuriem nav FAIMS (saukti par "Nav FAIMS").

Ir vērts atcerēties, ka FAIMSinterfeiss rada nelielu jonu pārraides zudumu, iespējams, jo garāks jonu ceļš caur avotu.56 Tāpēc, lai labāk atspoguļotu tipiskus apstākļus un nodrošinātu taisnīgus salīdzinājumus, dati "Nav FAIMS" tika savākti, izmantojot to pašu paraugu bez uzstādīta FAIMS vienība.

Šie "Nav FAIMS" dati tika savākti trīs eksemplāros un analizēti saskaņā ar darbplūsmu, kā parādīts 1. attēlā ar 6 populārāko DDA MS2 analīzi. Datu kopas "Nav FAIMS" vidēji identificēja 754 ± 35 proteoformas (2.A attēls un S1 tabula) un kolektīvi identificēja 1073 unikālas (neliekas) proteoformas (2.B attēls), kas iegūtas no 293 unikāliem gēniem (2.C attēls), kas aptver 29 359 aminoskābes visā proteomā (2.D attēls).

Metriskais "proteomu pārklājums" (2.D attēls) ir definēts kā neliekas aminoskābes, kuras aptver katras proteoformas secība. Būtībā šī metrika ņem vērā gan identificēto proteoformu garumu, gan daudzveidību.

Mēs uzskatām, ka tas ir līdzsvarotāks rādītājs salīdzinājumā ar neapstrādātu proteoformu un gēnu skaitu, jo tas novērš novirzes pret mazākām proteoformām. Lai gan vienkārša proteoformu vai ģenēzes uzskaite ir intuitīva, šķiet, ka šos rādītājus spēcīgi ietekmē īsi proteolītiskie fragmenti. FAIMS datu kopas tika savāktas no –50 līdz –20 CV, kas skenētas ar 5 V soli.

Katrs no iegūtajiem 7 CV tika savākts trīs eksemplāros. Attiecībā uz proteoformām un gēniem FAIMS pārspēja "Nav FAIMS" visiem CV, kas tika pārbaudīti diapazonā no –50 līdz –30 CV (attēls 2A–C).

Piemēram, trīs datu kopas pie –50 CV identificēja 1833 ± 17 proteoformas, kas ir vidējais pieaugums par ~ 140% vienā skrējienā, salīdzinot ar "Nav FAIMS". Kopumā šīs trīs datu kopas ar –50 CV identificēja 2564 unikālas proteoformas no 530 unikāliem gēniem, kas kopumā aptver 43 437 aminoskābes, kas ir pieaugums par 95, 69 un 69%, salīdzinot ar trim "NoFAIMS" datu kopām (attēls 2B-D). un S1 tabulu).

Turklāt, lai gan FAIMS pie -25 V novēro mazāk unikālu proteoformu un gēnu, salīdzinot ar "No FAIMS", pašas proteoformas vidēji ir daudz garākas. Tādējādi, ņemot vērā proteoformas garumu (attēls 2D), –25 V datu kopas aptver gandrīz tikpat daudz aminoskābju no proteomas (28 398), salīdzinot ar "No FAIMS" (29 359), to darot ar tikai uz pusi mazāk proteoformu (2.B attēls). ).

Mēs arī pētījām, vai FAIMS varētu nodrošināt tikpat stabilu un reproducējamu analīzi, salīdzinot ar bez FAIMS. Mēs novērtējām kvantitatīvās noteikšanas reproducējamību, aprēķinot katras proteoformas pazīmes intensitātes RSD (ekvivalents variācijas koeficientam), ja proteoforma atbilst kritērijam, ka tā tiek novērota visās trīs atkārtotās datu kopās katram CV iestatījumam.

Tā kā FAIMS un "Nav FAIMS" datu kopas tika savāktas no viena bioloģiskā parauga, atkārtojumu atšķirības ir jāattiecina tikai uz instrumentāliem faktoriem.

Boksdiagramma 3. attēlā (kā arī atsevišķas histogrammas S1 attēlā) parāda, kā RSD sadalījums tiek salīdzināts starp FAIMS un "Bez FAIMS" datu kopām.

Pamatojoties uz vidējo RSD, FAIMS pievienošana radīja līdzīgu vai nedaudz uzlabotu kvantitatīvās noteikšanas kvalitāti salīdzinājumā ar "Nav FAIMS". RSD uzlabojumi starp zemākiem spriegumiem (–20 līdz –30 CV) var būt saistīti ar novērojumu, ka šajā diapazonā tiek pārraidīts mazāk proteoformu, nodrošinot augstākas kvalitātes MS1 spektrus un tādējādi labākus iezīmju intensitātes novērtējumus.

Turklāt ir vērts atzīmēt, ka no šiem atkārtojumiem noteiktie RSD ir līdzīgi iepriekšējiem eksperimentiem no augšas uz leju55 un no apakšas uz augšu57,58, kas veikti ar līdzīgu instrumentu.

Kopumā šie dati parāda, ka FAIMS pievienošana TDP spēcīgi palielina proteoformu identifikāciju, nezaudējot kvantitatīvās noteikšanas kvalitāti.

Tālāk mēs pētījām identifikāciju pārklāšanos starp CV, kas varētu nodrošināt lielāko nelieko novērojumu kopumu.

Izmantojot pārklāšanās koeficientus, kas definēti kā krustpunkts starp divām kopām, dalīts ar mazāko no abām kopām, mēs noteicām līdzību starp katru datu kopu. Kopējais vidējais pārklāšanās koeficients gan proteoforma, gan gēnu identifikācijām katrā FAIMS CV bija 0,76.

Tas ir salīdzināms ar pārklāšanās koeficientu no datu kopām “Nav FAIMS” (0.77), kas liecina, ka tehniskajiem atkārtojumiem ir līdzīga reproducējamība. Siltuma karte, kurā parādīti proteoformu un gēnu FAIMS pārklāšanās koeficienti, ir parādīta attiecīgi 4. un S2 attēlā.

Proti, gēnu identifikāciju pārklāšanās visā CV telpā ir daudz lielāka salīdzinājumā ar proteoformām, lai gan tas ir īpaši pamanāms, salīdzinot garākos CV attālumus.

Piemēram, pārklāšanās starp −50 un −20 CV ir 0,64 gēnu līmenī un 0,06 proteoformas līmenī. Tas bija paredzēts, jo katru gēnu potenciāli var attēlot vairākas proteoformas.

4. attēlā parādīts, ka, lai gan 5–10 V CV atšķirība rada pārklāšanās koeficientus, kas lielākoties pārsniedz 0,5, attālumi, kas ir lielāki par 15 V, rada lielākas atšķirības un tāpēc ir labāk izvietoti, lai uztvertu pietiekami dažādas proteoformu kopas.

Izmantojot šīs datu kopas, mēs tālāk noskaidrojām, kuras CV kombinācijas ir optimālas, lai panāktu maksimālu gēnu identifikāciju, proteoformu identifikāciju un sekvences pārklājumu ar ierobežojumiem attiecībā uz CV skaitu katrai kombinācijai.

Pirmkārt, mēs izveidojām optimālās kombinācijas jebkuram CV skaitam no 1 līdz 7, izmantojot unikālo proteoformu, gēnu un proteomu sekvences pārklājumu (5. attēls).

Piemēram, izmantojot kombinācijas, kas ierobežotas ar trim CV, 5.A un B attēlā ir detalizēti aprakstīts, kā -35, -40 un -50 V ir ideāli piemēroti, ja vēlaties palielināt proteoformu vai gēnu skaitu.

Šajos trīs CV (deviņas datu kopās) identificētās proteoformas un gēni aptver 84% no kopējām unikālām proteoformām un 92% no kopējiem gēniem visā 21 datu kopas komplektā.

Nosverot proteoformas garumu ar sekvences pārklājumu kā metriku, ideālā kombinācija ir –30, –40 un –50 CV, kas aptver 88% unikālo aminoskābju no visām 21 FAIMS datu kopām ar tikai nelielu proteoformu un gēnu identifikācijas zudumu ( 4221 proteoforma un 723 gēni, 5C attēls). Tomēr šīs kombinācijas ietver visus atkārtojumus un atspoguļo maksimālo identifikāciju, ko varētu sasniegt konkrētai CV kombinācijai. Tāpēc, lai demonstrētu ārējās CV soļošanas priekšrocības, mēs nolēmām izpētīt, kādus skaitļus var saprātīgi sasniegt vidēji ar trīs piegājieniem, kur katrs piegājiens ir atšķirīgs CV.

Izmantojot –50, –40 un –30 V datu kopas kā piemēru, mēs noteicām vidējās unikālās proteoformas, unikālos gēnus un proteomu secību pārklājumus, pamatojoties uz 27 unikālām kombinācijām no trim dažādiem atkārtojumiem katrā CV.

Pamatojoties uz šo analīzi, mēs varētu iegūt 2986 (± 46) unikālas proteoformas un 618 (± 12) unikālus gēnus, kas vidēji aptver 64 534 (± 1089) aminoskābes. Salīdzinot ar “No FAIMS” trīskāršām datu kopām, kas identificēja 1073 unikālas proteoformas un 293 unikālus gēnus, kas aptver 29 359 aminoskābes, ārējais CV solis pie –50, –40 un –30 V varētu vairāk nekā dubultot katru metriku.

Tomēr optimālā CV kombinācija, visticamāk, būs atkarīga arī no organisma un audiem, no kuriem paraugs ir iegūts, izmantotajām parauga sagatavošanas darbībām, kā arī no jebkuras papildu bezsaistes frakcionēšanas, kas ieviesta pirms LC-MS analīzes.

Kopumā, ņemot vērā pārklāšanās analīzi (4. attēls), var secināt, ka 15 V vai lielāki attālumi starp CV nodrošina vismazāko proteoformu pārklāšanos, savukārt 5–10 V atdalīšana no –50 līdz –30 CV palielina gēnu, proteoformu un proteomu skaitu. secības pārklājums.

Lai vēl vairāk noteiktu FAIMS ietekmi uz proteomu pārklājuma dziļumu, mēs salīdzinājām gēnus, kas identificēti no mūsu lejupējiem datu kopām, ar tipisku cilvēka smadzeņu augšupēju analīzi.

Visaptverošas augšupvērstas cilvēka smadzeņu audu datu kopas ļāva mums novērtēt 8528 proteīnu daudzumu, izmantojot svērto spektrālo skaitīšanu.59–61 Olbaltumvielas tika apvienotas 10 dažādās pārpilnības procentiles, pamatojoties uz spektrālajiem skaitļiem, kas apkopoti no vairākām cilvēka smadzeņu augšupēju datu kopām.

Veicot savstarpējas atsauces ar mūsu lejupejošajām datu kopām, mēs varējām noteikt, no kurienes ir iegūti gēni un proteoformas, un sarindot aplēsto proteīnu pārpilnību (izmantojot datu kopā normalizētos spektrālos skaitļus) cilvēka smadzenēs (6. attēls).

Gēni, kas tika atrasti mūsu lejupejošā analīzē, bet ne no apakšas uz augšu atsauces komplektā, tika iekļauti kā "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com