Tubulozīds B no Cistanche Salsa glābj PC12 neironu šūnas no 1-metil-4-fenilpiridīnija jonu izraisītas apoptozes un oksidatīvā stresa

Ievads

Patoloģiski sporādiskai Parkinsona slimībai (PD) parasti raksturīgs kateholamīnerģisko neironu, īpaši substantia nigra pars compacta (SNc) dopamīnerģisko neironu zudums un raksturīgas intraneironas| ieslēgumi, ko sauc par Lūija ķermeņiem skartajos smadzeņu reģionos. Neskatoties uz dažādiem faktoriem, kas ir saistīti ar PD patoģenēzi, mehānismi, kas saistīti ar PD ierosināšanu un progresēšanu, joprojām ir neskaidri. Lai gan PD cēlonis joprojām nav noskaidrots, vairākas pierādījumu līnijas stingri norāda uz oksidatīvā stresa iesaistīšanos, beidzot neironu nāvei vai apoptozei pārmērīgas brīvo radikāļu veidošanās dēļ. Fakts, ka nigrālā dopamīnerģiskā sistēma var radīt augstu brīvo radikāļu līmeni un tai ir salīdzinoši zems oksidatīvās aizsardzības sistēmas līmenis, vēl vairāk apstiprina šo hipotēzi. Gan in vivo, gan in vitro pētījumi parādīja oksidatīvā stresa izraisītu neirotoksicitāti MPP＋, kas ir aktīvs l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridīna (MPTP) metabolīts uz dopamīnerģiskiem neironiem. Brīvo radikāļu iesaistīšanās, ko pārmērīgi rada oksidatīvais stress, kas ir tiešais neirodeģeneratīvo traucējumu, piemēram, PD, cēlonis, liecina par antioksidantu galveno lomu. Tubulozīds B (att. l) bija viens no feniletanoīdu savienojumiem, kas izolēts no Cistanche salsa kātiem. Iepriekšējie pētījumi atklāja, ka daudziem feniletanoīdiem, tostarp tubulozīdam B, ir spēcīga brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāte.

Ņemot vērā šos atklājumus, mēs šajā pētījumā pētījām tubu]nside B ietekmi uz MPP{0}}inducēto neirotoksicitāti in vitro, izmantojot simpātiskās nervu feohromocitomas šūnu līniju PC12, kas gadu gaitā ir veiksmīgi izmantota neironu funkciju pētīšanai.

DABĪGA CISTANČE TUBULOZA PARKINSONA SLIMĪBAS NOVĒRŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiāli un metodes

Materiāli

Tubulosīdu B no Cistanche Salsa laipni piegādāja Dr. Li Lei (Pekinas Universitātes Farmācijas zinātņu skolas Dabas produktu nodaļa, Pekina, Ķīna). Izmantojot HPLC analīzi, savienojuma tīrība bija vairāk nekā 98%. Dulbecco modificētā Ērgļa barotne (DMEM), zirga serums un augļa teļa serums tika iegādāti no GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridionija jons (MPP+), poli-L-lizīns, 3-(4,{ {8}}dimetiltiazol-2 -il)-2, 5- difeniltetrazolija bromīds (MTT), propīdija jodīds (PI), RNāze A, proteināze K un 2; 7'-dihlorfluoresceīna diacetāts (DCFH-DA) tika iegādāts no Sigma.

Šūnu kultūra

PCI2 šūnas tika uzturētas DMEM, kas papildināts ar 10% zirga seruma, 5% augļa teļa seruma, 100 V/ml penicilīna un 100 ug/ml streptomicīna. Šūnas tika kultivētas mitrinātā inkubatorā, kas aerēts ar 95% gaisu un 5% CO2 37 grādu temperatūrā. Visi eksperimenti tika veikti 24-48 h pēc šūnu iesēšanas. Šūnas tika regulāri novāktas, veicot tripsinizāciju par 0, 25%, kad šūnas tuvojās subkonfluenta stadijai, un izklāja 25 cm kultivēšanas kolbās, kas sadalītas 1:8.

Šūnu dzīvotspējas analīze

Šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot modificētu MTT testu, kā aprakstīts iepriekš [10]. Īsumā, PC12 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu I × 104 šūnas vienā iedobē. Kultūras tika audzētas 48 stundas, un pēc tam barotne tika nomainīta uz barotni, kas satur dažādu koncentrāciju burnside B vai MPP＋. Pēc inkubācijas līdz 48 stundām un 72 stundām MTr šķīdumu (5 mg/ml DMEM) pievienoja 96-iedobju plāksnēm, un šūnām ļāva inkubēt 4 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēc barotnes noņemšanas šūnu un krāsvielu kristāli tika šķīstoši, pievienojot 200 μL DMSO, un absorbcija tika mērīta pie 570 nm (540 nm kā atsauce) ar modeļa 550 mikroplašu lasītāju (Bio-Rad). Šūnu dzīvotspēja tika analizēta arī, izmantojot tripāna zilās izslēgšanas metodi. Šūnas tika savāktas, viegli granulētas un iekrāsotas ar 0, 6% tripānzilā šķīdumu 3 lietus. Nekrāsoto šūnu procentuālais daudzums pēc tam tika novērtēts desmit nejauši izvēlētos mikroskopa laukos. Kā pozitīvas zāles tika izmantots 100 ng／ml epidermas augšanas faktors (EGF).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA BEZMAKSAS RADIKĀLU ATTĒRŠANAS AKTIVITĀTEI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Apoptozes noteikšana ar plūsmas citometriju

Apoptotiskās šūnas tika noteiktas ar plūsmas citometriju, izmantojot propīdija jodīdu (PI) [11]. Īsumā, aptuveni 1 × 106 šūnas, kas inkubētas ar testa vielām, tika novāktas, centrifugējot un vienu reizi mazgātas ar PBS. Šūnas tika fiksētas ar 70 % etanolu 24 stundas - 20 grādos un vienu reizi mazgātas ar PBS. Pēc tam šūnas tika atkārtoti suspendētas 300 μL PBS, kas satur 0, 5 mg / ml RNaseA un 0, 5 mg / ml PI. Pēc turpmākas inkubācijas 30 minūtes tumsā, plūsmas citometrija tika veikta ar FACScan (Becton Dickinson, Heidelberga, Vācija).

DNS fragmentācijas analīze ar elektroforēzi

Mēs izmantojām Mūra protokolu [12], kas izolēja tikai fragmentētu DNS, un eksperimenti tika normalizēti, izmantojot vienādu skaitu kultūru no katras testa grupas. Īsumā, 3 × 106 neironi no katra apstrādātā parauga tika mazgāti Henka līdzsvarotā sāls šķīdumā (1000g 10 minūtes), un mēģenes apakšā izveidotās granulas tika homogenizētas. ar 1 ml līzes buferšķīduma (10 mM Tris pie pH 7,4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) 20 minūtes uz ledus. Pēc centrifugēšanas pie 11, 000 g uz 20 lietus pie 4 grādiem, supernatanti, kas satur fragmentētu DNS, tika izņemti un sagremoti ar 20 mg/ml RNāzi A 37 grādu temperatūrā 1 stundu un 0,1 mg/ml proteināzi K 56 grādos. uz papildus 1h. Sadalītā DNS tika ekstrahēta, izmantojot fenolu un hloroformu, un centrifugēta pie 10, 000g 1 lietus 4 C temperatūrā. Ūdens fāze tika pārnesta jaunā Ependorfa mēģenē, sajaukta ar 2 tilpumiem ledusauksta etanola un pēc tam. novieto 20 grādu temperatūrā vismaz 1 stundu, lai nogulsnētu DNS. Pēc centrifugēšanas 15, 000g 20 min 4 grādos, supernatanti tika noņemti, un DNS granulas vienu reizi nomazgāja ar 80% etanolu (15 000 g 15 minūtes 4 grādos), žāvēja gaisā un izšķīdina 20 μl. TE buferšķīdums pie pH 7,6. Pēc tam visam paraugam tika veikta elektroforēze uz 1,5% agarozes gēla 1 stundu pie 85 V. Gelu pārbaudīja un fotografēja Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, ASV).

Intracelulārās ROS veidošanās mērīšana

Intracelulāro peroksīdu veidošanās tika konstatēta ar konfokālo skenēšanas lāzermikroskopu, izmantojot nefluorescējošu savienojumu 2"7"-dihlorfluoresceīna diacetātu (DCFH-DA) [13], kas tiek deesterificēts šūnās ar endogēno esterāžu palīdzību līdz jonizētam brīvajam. skābe, 2,7"-dihlorfluoresceīns. 2",7-Dihlorfluoresceīns var tikt oksidēts par fluorescējošu 2"7"-dihlorfluoresceīnu (DCF), izmantojot hidroantioksidantus. Šūnas tika inkubētas ar 10 μM DCFH-DA 30 minūtes 37 grādu temperatūrā. Kultūras tika mazgātas divas reizes ar Henka līdzsvarotu sāls šķīdumu un attēlotas tajā pašā vidē. Attēlveidošana tika veikta, izmantojot konfokālo skenēšanas lāzera mikroskopu, DCF tika ierosināts pie 488 nm, un emisijas filtrs bija 510 nm barjerfiltrs. Lai nodrošinātu derīgu salīdzinājumu, visiem novērojumiem tika izmantoti vieni un tie paši iegūšanas parametri. Tika iestatīta optimālā vertikālā pozīcija šūnu vidū, un pēc tam lauks tika ātri skenēts. Tā kā apgaismojums pie ierosmes viļņa garuma 488 nm izraisīja palielinātu fluorescenci šīs krāsas oksidēšanās dēļ, katrs lauks tika pakļauts Iight iedarbībai vienādu laiku. Sākotnējās vērtības no nestimulētām šūnām tika izmantotas kā kontroles vērtības, lai salīdzinātu ar MPP apstrādātajām šūnām klātbūtnē vai beztubulozīds B. Pēc skenēšanas vidējā relatīvā fluorescences intensitāte 15-20 neironu šūnu ķermeņos vienā mikroskopa laukā tika kvantificēta četrās atsevišķās kultūrās katrā ārstēšanas stāvoklī.

Statistiskā analīze

Visas iegūtās vērtības tika izteiktas kā vidējie ± SD. Atšķirību statistisko nozīmīgumu starp grupām noteica ar Stjudenta t-testu; Aprēķinātās p vērtības, kas mazākas par 0,05, tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām.

Rezultāti

Kā parādīts 2. attēlā, MPP+ izraisīja no devas atkarīgu PCI2 šūnu dzīvotspējas samazināšanos. Turpretim EGF, labi zināms neirotrofiskais faktors, radīja būtisku šūnu dzīvotspējas aizsardzību pie 100 ng/ml MPP. Tubulozīda B (5, 10, 50 vai 100 ug-ml) klātbūtnē tika vājināta arī citotoksiskā iedarbība. }), lai gan ar mazāku spēku nekā atsauce

zāles (3. attēls). Tubulozīds B šajās koncentrācijās uzrādīja no devas atkarīgu citoprotektīvu iedarbību, un savienojums viens pats neizraisīja nekādu acīmredzamu citotoksicitāti (dati nav parādīti). Gēla elektroforēze DNS ekstraktam no PCI 2 šūnām, kas apstrādātas ar 200 µM MPP+ 48 stundas, parādīja DNS kāpnes. klasiska apoptozes pazīme, tubulozīds B, lietojot devas 10 un 100 μg·ml{8}}izraisīja DNS kāpņu veidošanos (4. attēls). 5. attēlā parādītas tipiskas plūsmas citometriskās analīzes histogrammas par MPP izraisītu apoptotisko šūnu nāvi PC12 šūnās tubulozīda B klātbūtnē vai bez tā. Šūnu cikla profila kvantitatīva noteikšana ar PI atklāja šūnu skaitu ar subdiploīdām īpašībām (M1 apgabals). liecina par apoptotisku DNS fragmentāciju. Neapstrādātajās šūnās apoptotiskā subdiploīda frakcija bija minimāla līdz 5 94% no kopējām 10 000 šūnām (5. A attēls). Pēc 48 stundu ilgas MPP iedarbības apoptozes procentuālais daudzums palielinājās līdz 43°02;j (5. B attēls). Pievienojot šūnu kultūrai, tubulozīds Binhibēta MPP{0}}inducēta apoptozeno devas atkarīgā veidā. Koncentrācijā 10 ug·ml-1tubulozīda B aizsardzība nebija statistiski nozīmīga, bet pie 50 un 1 00ug·ml-1, attiecīgi, samazinājums par 45 un 63 %, tika novērots. palielinot izdzīvošanas šūnu procentuālo daudzumu (5D, E attēls).

Intracelulārās ROS uzkrāšanos var noteikt, izmantojot DCFH-DA．PC12 šūnas, kas apstrādātas ar 200 uM MPP＋ 48 stundas, un pēc krāsošanas ar DCFH-DA krāsvielu šūnas iekšienē parādījās intensīva fluorescence (6. attēls). Vienlaicīga apstrāde ar tubulozīdu B (devās 10 un 100 ug·ml) inhibēja MPP＋一 izraisītu ROS veidošanos (samazināta procentuālā daļa bija attiecīgi 24．52％ un 55．63％).

DABĪGA CISTANŠU TUBULOZA PARKINSONA SLIMĪBAS ĀRSTĒŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskusija

PD patoģenēze ietver spēcīgu oksidatīvo stresu, samazinātu antioksidantu līmeni un mitohondriju defektus. zināms, ka tie izraisa apoptozi vairākās šūnu sistēmās. Jo īpaši ir pierādīts, ka brīvie radikāļi izraisa aktīvu šūnu nāvi neironos[14]. MPTP izraisa neatgriezenisku un smagu Parkinsona slimībai līdzīgu sindromu, kas izraisa selektīvu nigrostriatālo dopamīnerģisko neironu deģenerāciju cilvēkiem. Šis neirotoksīns ir izmantots, lai radītu. Ēda PD[15] dzīvnieku modeļus. Monoamīnoksidāze B pārvērš MPTP par Mpp＋, kas uzkrājas mitohondrijās. kur tas inhibē mitohondriju kompleksu I un mitohondriju disfunkciju. funkcija izraisa apoptozi[16]. Tāpēc MPP+ izraisītā neirotoksicitāte dopamīnerģiskajos neironos ir plaši izmantota kā PD etioloģisks modelis neiroprotektīvo līdzekļu skrīningam.

Šajā pētījumā mēs esam pierādījuši, ka MPP+-inducēto šūnu nāvi oksidatīvā stresa dēļ PC12 šūnās samazināja tubulozīds B. Turklāt mēs parādījām, ka tubulozīds B arī aizsargā no devas atkarīgā veidā pret MPP{{ 3}}inducēta DNS kāpņu un apoptozes, ko mēra, izmantojot DNS gēla elektroforēzi un plūsmas citometrisko analīzi. Turklāt vienlaicīga ārstēšana ar augstākām tubulozīda B koncentrācijām kavēja MPP izraisītu ROS veidošanos. Tādējādi tubulozīdam B ir bijusi daudzfunkcionāla neiroaizsargājoša iedarbība. Tubulozīda B darbībā var būt iesaistīti vairāki mehānismi atsevišķi vai kopā. Antioksidanta iedarbība ir iespējamais tubulozīda B mediētas neiroprotekcijas mehānisms. Xiong Q atklāja, ka tubulozīds B uzrādīja spēcīgu brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāti pret 1,1-difenil-2-pikrilhidrazila radikāli un ksantīna]ksantīna oksidāzes radīto superoksīda anjonu radikāli.

Nesen tika ziņots, ka vairākiem feniletanoīdiem piemīt brīvos radikāļus attīrošas īpašības un tie aizsargā oksidatīvā stresa izraisītus toksiskus ievainojumus. ROS, ko ražo MPP+, piemēram, ūdeņraža peroksīds, superoksīda anjons un hidroksilradikālis, viegli bojā bioloģiskās molekulas, kas galu galā var izraisīt apoptotisku vai nekrotisku šūnu nāvi. Tādējādi tubulozīdam B var būt tieša attīrīšanas iedarbība pret ROS. Lai gan mūsu dati nenosaka precīzu vietu, kurā tubulozīds B darbojas, lai nomāktu ROS uzkrāšanos, tie liecina, ka neiroprotektīvais mehānisms ietver antioksidantu ceļu stimulāciju. Tubulozīda B molekulārās struktūras pētījums arī liecina, ka tam piemīt spēcīga spējabrīvo radikāļu attīrīšana(personīgā komunikācija).

Varētu būt piemēroti arī citi mehānismi. Piemēram, tubulozīdam B var būt spēja neitralizēt MPP toksicitāti, kavējot mitohondriju caurlaidības pārejas poru atvēršanos un disfunkciju. Turklāt jāapsver arī tas, vai tubulozīdam B ir tieša augšanu veicinoša iedarbība uz neironu šūnām. Precīzs tubulozīda B neiroprotektīvās darbības mehānisms joprojām nav skaidrs. Ir nepieciešami papildu pētījumi, lai noskaidrotu pilnīgu priekšstatu par tā neiroprotektīvo iedarbību.

Visbeidzot, tubulozīds B noCistanche salsas ekstraktsir acīmredzama aizsargājoša iedarbība uz MPP{0}}inducēto apoptozi un oksidatīvo stresu. Tās neiroprotektīvā iedarbība pret MPP ＋ toksicitāti var būt svarīga un liecina, ka tai var būt terapeitisks potenciāls PD profilaksē un ārstēšanā.

DABĪGA CISTANŠU TUBULOZA PARKINSONA SLIMĪBAS ĀRSTĒŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%