UMOD mutācijas hroniskas nieru slimības gadījumā Taivānā

Abstract:UMODir pirmais identificētais un visbiežāk mutētais gēns, kas izraisa autosomālu dominējošo stāvoklitubulointersticiāla nieru slimība(ADTKD). Jaunākie pētījumi liecina, ka ADTKD-UMODir samērā izplatīts cēlonishroniska nieru slimība(CKD). Tomēr ADTKD statuss-UMODTaivānā joprojām nav zināms. Šajā pētījumā mēs identificējām trīs heterozigotusUMODmissense varianti, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) un c.817G > T (p.Val273Phe), kopā 221 atlasītā CKD ģimenē (1,36%). Iepriekš nav ziņots par diviem no šiem missense variantiem, p.Cys41Arg un p.Gly60Asp. In vitro pētījumi parādīja, ka abiem uromodulīna variantiem ir defekti šūnu membrānu tirdzniecībā un izdalīšanā uz barotni. Struktūras modelis paredzēja izmainītu disulfīda saišu veidošanos abos variantos, bet tika prognozēts, ka tikai p.Gly60Asp izraisīs proteīna destabilizāciju. Mūsu atklājumi paplašina mutāciju spektru un norāda, ka ADTKD-UMODveicināja nelielu, bet nozīmīgu HNS cēloni Taivānas iedzīvotāju vidū.

Atslēgvārdi: uromodulīns;hroniska nieru slimība(CKD); autosomāli dominējošs tubulointersticiālsnieru slimība(ADTKD); nieru mazspēja (KF).

KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTĀS CISTANČE AUGU PIEMĒROTĀJI NIERU SLIMĪBAI

1. Ievads

ADTKD ir reta dominējoša iedzimta slimība, ko izraisa heterozigotas mutācijas UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] un SEC61A1 [5]. UMOD ir pirmais identificētais un visizplatītākais ADTKD cēlonis, un tas ir plaši izpētīts [1,6]. Lai gan tas ir reti sastopams, ADTKD ir trešais visizplatītākais monogēnsnieru slimībapēc ADPKD un IV tipa kolagēna nefropātijas, bet ADTKD-UMOD izplatība joprojām nav skaidra, un jaunākie pētījumi liecina, ka tas veido līdz 2% pacientu ar KF vai 0,3% no visiem indivīdiem ar HNS [7, 8]. UMOD kodē uromodulīnu un ir visizplatītākais proteīns cilvēka urīnā [9]. Uromodulīns ir nierēm specifisks proteīns, ko ražo Henles cilpas biezās augšupejošās daļas epitēlija šūnas un distālā vītņotā kanāliņa sākuma daļa [10], un tas veidojas kā polimērs ar lielu molekulmasu caur savu zonu. pellucida domēns [11]. Turklāt uromodulīns ir ļoti glikozilēts proteīns ar septiņām N-glikozilācijas vietām un šķelšanos C-gala galā ar serīna proteāzes hepsīnu, pirms tas tiek izvadīts cauruļveida lūmenā [9, 12, 13]. Uromodulīna funkcija ietver aizsardzību pret kalcija oksalāta kristalizāciju [14], aizsardzību pret urīnceļu infekcijām no uropatogēnām baktērijām [15–18] un Ca2+-K+ jonu kanāla regulēšanu [19]. UMOD mutāciju ietekme ir aizkavēta nobriešana, aizture endoplazmatiskajā retikulumā (ER), samazināta ekspresija plazmas membrānā un samazināta urīna izdalīšanās, kas izraisa ER stresu un nesalocītu proteīna reakciju [20–22].

ADTKD-UMOD klīniskie fenotipi ir nespecifiski un ietver CKD, podagru, hiperurikēmiju, normālu vai vieglu proteīnūriju, ģimenes anamnēzes esamību vai trūkumu, un visvairāk skartās personas, kas sāk KF vecumā no 30 līdz 50 gadiem [23]. Nieru histoloģija parāda kanāliņu paplašināšanos vai atrofiju, kanāliņu bazālās membrānas atcelšanu vai sabiezēšanu, intersticiālu fibrozi un mutēta uromodulīna uzkrāšanos kā polimorfus nestrukturētus materiālus, ko atklāj PAS krāsošana [24, 25].

Taivānā ir visaugstākā HNS un KF sastopamība un izplatība, pamatojoties uz USRDS ziņojuma starptautiskajiem salīdzinājumiem [26]. Tomēr neviens pētījums nav vērsts uz ADTKD-UMOD statusu CKD populācijā Taivānā. Šajā pētījumā mēs pārbaudījām ADTKD-UMOD mutāciju izplatību izvēlētā CKD kohortā vienā terciārajā centrā Taivānā.

2. Materiāli un metodes

2.1. CKD indivīdi un DNS sagatavošana

Šajā pētījumā tika pieņemta darbā 221 CKD ģimene (228 personas) no Gaosjunas Medicīnas universitātes slimnīcas CKD aprūpes programmas. Iekļaušanas kritēriji ietvēra podagras epizodes vai hiperurikēmiju ar eGFR mazāku par 90 ml/min/1,73 m2 pirms 40 gadu vecuma. Asins paraugi, ciltsraksta informācija un piekļuve laboratorijas darbu rezultātiem tika iegūti no personām pēc informētas piekrišanas. Pētījums tika veikts saskaņā ar Helsinku deklarāciju, un to apstiprināja KMUH Institucionālā pārskata padome (KMUHIRB-G(II)-20160024). DNS no perifēro asiņu paraugiem tika ekstrahēta saskaņā ar standarta metodi.

2.2. Eksomu sekvencēšana un bioinformātikas analīze

Exome bibliotēkas izveidei tika izmantots Nextera Flex for Enrichment and Exome panelis (CEX V2, Illumina, Sandjego, CA, ASV). Izmēra izvēle, secības uztveršana, bagātināšana un eluēšana tika veikta saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam DNS bibliotēku lieluma sadalījums tika mērīts, izmantojot TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, ASV), kam sekoja secība Illumina NovaSeq 6000 ar 150 bp pāra gala nolasījumiem. Iegūtie fastq dati tika saskaņoti ar atsauces cilvēka genoma secību (GRCh37 / hg19), un mēs veicām nukleotīdu variantu izsaukšanu, izmantojot DRAGEN Bio-IT platformu (Illumina). VCF fails tika analizēts programmā CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, ASV). Identificētie varianti tika marķēti kā patogēni/iespējami patogēni, nenoteiktas nozīmes varianti (VUS) vai labdabīgi saskaņā ar Amerikas Medicīnas ģenētikas un genomikas koledžas (ACMG) klasifikāciju, izmantojot programmatūru VarSome, un mēs salīdzinājām ClinVar esošos variantus. , HGMD un dbSNP datu bāzes. Atklātos patogēnos, iespējams patogēnos un VUS variantus apstiprināja Sangera sekvencēšana. Sangera sekvencēšanai PCR produkti tika attīrīti ar garneļu sārmainās fosfatāzes/eksonukleāzes I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, ASV) apstrādi un pēc tam pakļauti sekvencēšanai no abiem galiem ar termociklera sekvencēšanu, izmantojot BigDye® terminatora 3.1 sekvencēšanu. komplekts (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) pēc analīzes ar ABI 3730XL DNS analizatoru (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Segregācijas analīze tika veikta, ja DNS bija pieejama no ģimenes locekļiem. UMOD 2., 3., 4. un 5. eksoni tika pārbaudīti, izmantojot Sangera sekvencēšanu 221 CKD ģimenes probandā, izņemot DY5 ģimeni, kas saņēma eksomu sekvencēšanu. UMOD tiek izmantota NCBI atsauces secība NM_003361.4. Nukleotīdu numurēšanai un mutāciju vai variantu nosaukšanai tika izmantota standarta nomenklatūra, ko ieteikusi Cilvēka genoma variāciju biedrība (http//www.hgvs.org/; piekļūta 2022. gada 18. jūlijā).

2.3. Šūnu kultūra un pārejoša transfekcija

HEK293 šūnas (CRL-1573, ATCC, Manasasa, VA, ASV) tika kultivētas Hema F-12 barotnes Kaighn modifikācijā (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlingtona). , MA, ASV), kas papildināts ar 10% termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV), 100 vienības/ml penicilīna, 100 µg/ml streptomicīna (10378016, Thecientificrmo Fisher ) un 10 vienības/ml -interferonu (IF002, Merck/Millipore Sigma). Šūnas tika uzturētas 37 ◦C mitrinātā atmosfērā ar 5% CO2.

Pārejoša HEK293 šūnu transfekcija tika veikta, izmantojot Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Īsumā, 2,5 µl Lipofectamine 2000 tika pievienoti tieši 100 µL Optimum barotnē (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) un inkubēti 5 minūtes istabas temperatūrā. Lipofectamine 2000–Optimum maisījumam tika pievienots pavisam 1 µg DNS un inkubēts vēl 20 minūtes. Inkubācijas beigās DNS maisījums tika pievienots šūnu kultūras plāksnēm ar serumu nesaturošu barotni. Šūnu veselības stāvokļa noteikšanai pēc pārejošas transfekcijas mēs izmantojām LUNA-II™ automatizēto šūnu skaitītāju (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Koreja), lai noteiktu tripānzilo krāsojošo šūnu dzīvotspēju citā laika punktā un lielākajā daļā gadījumu. transfektētās šūnas palika dzīvas pēc atšķirīgas uromodulīna pārmērīgas ekspresijas (dati nav parādīti).

2.4. Vietnē virzīta mutaģenēze

HA iezīmētais savvaļas tipa uromodulīna vektors tika iegūts no Dr. Rampoldi [27]. P.Cys41Arg un p.Gly60Asp mutāciju konstrukcijas tika izveidotas, izmantojot QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Mutācijas apstiprināja Sangera sekvencēšana

2.5. ELISA un frakcionēšana

Tukšais vektors, savvaļas tipa uromodulīns, p.Cys41Arg uromodulīns un p.Gly60Asp uromodulīna ekspresijas konstrukcijas tika īslaicīgi transfekētas uz HEK293 šūnām. Pēc pārejošas transfekcijas barotne tika savākta 8, 24 un 32 stundās, pēc tam pirms mērīšanas uzglabāta -80 ◦ C. Imunoblotēšanai barotne tika kondensēta ar Centri con (YM3, ikona, Merck/Millipore Sigma) pirms SDS-PAGE elektroforēzes. ELISA tika izmantota, lai veiktu uromodulīna mērījumus barotnē saskaņā ar ražotāja norādījumiem (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Īsumā, barotne un standarti tika atšķaidīti komplektā iekļautajā testa atšķaidītājā un pievienoti iedobēm divos eksemplāros. Pēc 2, 5 stundu inkubācijas istabas temperatūrā iedobes nomazgāja ar PBS un pievienoja biotinilētu uromodulīna antivielu. Pēc 1 stundu ilgas inkubācijas istabas temperatūrā iedobes atkārtoti nomazgāja un pievienoja streptavidīna-mārrutku peroksidāzes sekundāro antivielu. Pēc 45 minūšu inkubācijas istabas temperatūrā iedobes tika atkārtoti mazgātas, un krāsa tika izveidota, pievienojot TMB substrāta šķīdumu un inkubējot tumsā istabas temperatūrā 30 minūtes. Reakcija tika apturēta, pievienojot komplektā iekļauto apturēšanas šķīdumu, kam sekoja tūlītēja nolasīšana pie OD450 un OD550. Barotnes uromodulīna koncentrācija tika noteikta ar interpolāciju uz standarta līknes.

Pēc barotnes savākšanas kultivēšanas traukam pievienotās šūnas tika frakcionētas, izmantojot subcelulāro proteīnu frakcionēšanas komplektu (78840, Thermo Fisher Scientific) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsāk sakot, mēs savācām vienādus daudzumus trīs dažādu veidu uromodulīna šūnu lizāta un noņēmām visu supernatantu, līdz tas bija pēc iespējas sausāks. Šūnu granulai pievienojām ledusaukstu citoplazmas ekstrakcijas buferi, kas satur proteāzes inhibitorus, inkubēja 4 ◦ C temperatūrā 10 minūtes ar maigu samaisīšanu, pēc tam centrifugēja ar ātrumu 500 × g 5 minūtes. Mēs nekavējoties noņēmām supernatantu (citoplazmas ekstraktu) tīrā, iepriekš atdzesētā mēģenē uz ledus un granulai pievienojām ledusaukstu membrānas ekstrakcijas buferi, kas satur proteāzes inhibitorus. Membrānas daļa tika virpuļota 5 sekundes visaugstākajā iestatījumā un inkubēta 4 ◦ C temperatūrā 10 minūtes, viegli maisot. Mēs pārnesām supernatantu (membrānas ekstraktu) uz tīru iepriekš atdzesētu mēģeni uz ledus pēc centrifugēšanas ar ātrumu 3000 × g 5 minūtes. Subcelulārā membrāna un citoplazmas proteīns tika analizēti ar Western blot metodi.

2.6. Imunoblotēšanas analīze

Olbaltumvielu paraugi tika savākti no šūnām ar RIPA buferšķīdumu (R0278, Merck / Millipore Sigma) vai frakcionēšanas soli. Pēc tam proteīna koncentrāciju noteica, izmantojot proteīna testa krāsu (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, ASV) un piekļuvi vienādam proteīna daudzumam, pēc tam atdalot ar elektroforēzi SDS-PAGE. Pēc tam, kad proteīni tika pārnesti uz polivinilidēna difluorīda (PVDF) membrānām (1620177, BIO-RAD), PVDF membrāna tika iegremdēta 5% vājpienā ar 1X TBST, bloķējot 1 stundu istabas temperatūrā, un trīs reizes mazgāta ar 1X TBST. 5 min. Pēc tam mēs inkubējām PVDF membrānu ar primāro antivielu 4 ◦ C temperatūrā nakti, mazgājām to trīs reizes ar 1X TBST 5 minūtes un inkubējām ar sekundāro antivielu 1 stundu istabas temperatūrā. Pēc sekundārās antivielu inkubācijas tas tika mazgāts trīs reizes ar 1X TBST 5 minūtes, pēc tam pievienojām uzlabotās hemiluminiscences (ECL) substrāta komplektu (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) un noteicām proteīna signālu, izmantojot rentgenstaru procesoru (MXP{{). 19}}, KODAK, Ročestera, Ņujorka, ASV) uz rentgena filmām (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primārās un sekundārās antivielas tika atšķaidītas ar 5% vājpienu 1X TBST, un detalizētā informācija ir šāda: 1:2000 uromodulīnam (sc-20631, Santakrusa, Dalasa, Teksasa, ASV) un 1:20 000 trušiem. HRP 2. antiviela (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, ASV).

2.7. Proteīna struktūras prognozēšana

Dinamīts tika izmantots savvaļas tipa un mutanta uromodulīna (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; piekļūts 2022. gada 15. jūnijā) 3D struktūras prognozēšanai, izmantojot cilvēka dabiskā uromodulīna (proteīna) pilna garuma struktūru. Datu banka: 7PFP) [28]. DiANNA tika izmantota savvaļas tipa un mutanta uromodulīna disulfīda saites prognozēšanai (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; piekļūts 2022. gada 16. jūnijā.) [29–31].

2.8. Statistiskā analīze

ImageJ analīzes programmatūra analizēja un kvantitatīvi noteica Western blot joslas. Statistiskās analīzes un grafiki tika veikti un sagatavoti, izmantojot GraphPad Prism8 programmatūru (GraphPad Software Incorporation, Sandjego, CA, ASV), un tika parādīts vidējais ± SEM. Divu grupu salīdzinājumam tika izmantots nesapārots t-tests. Statistikas rezultāti tika atzīmēti šādi: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Katrs eksperiments tika atkārtots vismaz trīs reizes.

Atbalsta pakalpojums:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Veikals:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop