Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Nieru epitēlija mērķa mitohondriju transkripcijas faktora A deficīts izraisa progresējošu mitohondriju izsīkumu, kas saistīts ar smagu cistisko slimību--I daļa

Kens Išijs^1,2,11 un citi

Patoloģiska mitohondriju funkcija ir labi atpazīstama akūtas un hroniskas slimības pazīmenieres slimības. Lai gūtu priekšstatu par mitohondriju lomuniereshomeostāzi un patoģenēzi, mēs mērķējām uz mitohondriju transkripcijas faktoru A (TFAM), proteīnu, kas nepieciešams mitohondriju DNS replikācijai un transkripcijai, kam ir izšķiroša nozīme mitohondriju masas un funkcijas uzturēšanā. Izpētīt mitohondriju darbības traucējumu sekasnieresepitēlija šūnas, mēs inaktivējām TFAM ar sinusa okulis saistītajā homeobox 2-izpaušanānierescilmes šūnas. TFAM deficīts izraisīja ievērojami samazinātu mitohondriju gēnu ekspresiju, mitohondriju izsīkumu, nefronu nobriešanas kavēšanu un smagas pēcdzemdību cistiskās slimības attīstību, kas izraisīja priekšlaicīgu nāvi. Tas bija saistīts ar patoloģisku mitohondriju morfoloģiju, skābekļa patēriņa samazināšanos un palielinātu glikolītisko plūsmu. Turklāt mēs noskaidrojām, ka TFAM ekspresija tika samazināta pelēm un cilvēkiempolicistiskas nieres, ko pavadīja mitohondriju izsīkums. Tādējādi mūsu dati liecina, ka TFAM ekspresijas disregulācija un mitohondriju izsīkums ir molekulāras iezīmes.nierescistiskā slimība, kas var veicināt tās patoģenēzi.

ATSLĒGVĀRDI: glikolīze; nieru attīstība; mitohondriji;policistiska nieru slimība; TFAM

cistancheir labs priekšpolicistiska nieru slimība

Tulkošanas paziņojums

Mēs esam izmantojuši peles ģenētiku, lai izprastu mitohondriju disfunkcijas lomuniereshomeostāze. Mitohondriju transkripcijas faktora A (TFAM) inaktivācija ar sinusa okulis saistītās homeobox 2 epitēlija cilmes šūnās izraisījanieruneveiksmesmagas dēļpolicistiska niere slimība. Mūsu atklājumi liecina, ka progresējoša mitohondriju disfunkcija ir saistīta ar nepilnīgu epitēlija diferenciāciju unnierucistoģenēze. Turklāt mēs noskaidrojām, ka cilvēkiem tika samazināta TFAM ekspresija un mitohondriju skaitspolicistiska niereaudi. Mūsu pētījumi liecina, ka terapeitiskās stratēģijas, kuru mērķis ir uzlabot mitohondriju veselību, var būt noderīgas, ārstējot pacientus ar autosomāli dominējošu stāvokli.policistiska niereslimība.

Mitohondriju (mt) disfunkcija ir plaši pazīstama patoloģiska iezīmenieres slimībasun var izraisīt šūnu bojājumus, iekaisumus un fibrozi.1 In thenieres, cauruļveida epitēlija šūnas ir ļoti atkarīgas no adenozīna trifosfāta (ATP), kas rodas oksidatīvās fosforilācijas (OXPHOS) rezultātā, jo tās veic vairākas enerģiju patērējošas epitēlija transportēšanas funkcijas. Tāpēc efektīvas mt ATP ražošanas uzturēšana ir būtiska normālai nieru darbībai un sistēmiskai elektrolītu homeostāzei. Turklāt jaunākie pierādījumi liecina, ka mitohondrijiem ir liela nozīme gēnu regulēšanā, šūnu signalizācijā un šūnu diferenciācijā, veidojot starpmetabolītus un reaktīvās skābekļa sugas (ROS). 2Neskatoties uz šiem sasniegumiem, mt signālu loma parasto patoģenēzē ir.nieresslimībasnav labi saprotams.

Lai izpētītu mt funkcijunieruhomeostāzi un patoģenēzi, mēs mērķējām uz mitohondriju transkripcijas faktoru A (TFAM). TFAM ir kodolā kodēts faktors, kas ir būtisks mt funkcijai, mt kopiju skaita uzturēšanai un mt DNS strukturālajai stabilitātei, jo tas regulē mt genoma replikāciju un transkripciju, saliekot promotora DNS.3,4 Zīdītāju mt DNS satur 37 gēnus, 13 no kurām kodē elpošanas ķēdes kompleksa proteīna apakšvienības, 22 kodē pārneses RNS un 2 ribosomu RNS.3 Tādējādi TFAM ir tieši iesaistīts mt elektronu transportēšanas un ATP sintēzes regulēšanā, transkripējot gēnus, piemēram, mitohondriju kodēto citohromu b ( MT-CYB), mitohondriāli kodētā citohroma c oksidāzes 1. apakšvienība (MT-CO1) un mitohondriāli kodētā ATP sintāzes membrānas apakšvienība 6 (MTATP6).3,5Bez TFAM šūnas zaudē spēju ražot ATP, izmantojot OXPHOS, nevar radīt ievērojamu daudzumu mt. ROS un pakāpeniski izsīkst mitohondriji.6–9 Ģenētiskie pētījumi ir parādījuši, ka TFAM ir būtiska normālai embrioģenēzei, jo globāla homozigota Tfam inaktivācija izraisīja intrauterīnu. letalitāte embrionālajā 10.5. dienā, savukārt heterozigota deficīts, lai gan tas samazināja mt kopiju skaitu par ~ 40 procentiem un izraisīja elpošanas ķēdes deficītu, neizraisīja embrionālo letalitāti.6 Tādējādi TFAM ģenētiskā mērķēšana ir noderīga eksperimentāla stratēģija lomas izpētei. progresējoša mt disfunkcija šūnu diferenciācijā un audu homeostāzē. Šūnu tipam specifiskā nosacītā Tfam inaktivācija liecināja, ka OXPHOS un/vai mt ROS ģenerēšana ir būtiska šūnu diferenciācijai, funkcijai un normālai fizioloģijai.6–10.

Var rasties primāri mt traucējumi kodola vai mt gēnu mutāciju dēļnieres slimībavisbiežāk izpaužas kā tubulointersticiāls ievainojums vai izolēta kanāliņu disfunkcija.11,12 Lai gan tas ir saistīts ar noteiktu cilvēku slimību, piemēram, neirodeģeneratīvo traucējumu, patoģenēzi,13 specifiskas TFAM mutācijas izraisanieruslimība nav reģistrēta. Pavisam nesen samazināta TFAM ekspresija ir saistīta ar hroniskunieresslimība. Mt integritātes zudums Tfam inaktivācijas dēļ izraisīja tubulointersticiālu slimību unnieru neveiksmepelēm, ko daļēji izraisīja mt DNS stresa izraisītas cikliskās GMP-AMP sintāzes (cGAS) – interferona gēnu (STING) atkarīgo iekaisuma reakciju stimulatora aktivizēšanās.

Šeit mēs ziņojam, ka pelēm ar nosacītu Tfam inaktivāciju ar sinusa okulis saistītajās homeobox 2 (SIX2) – ekspresējošās nefrona cilmes šūnās15 attīstās smaga cistiskā slimība un tās priekšlaicīgi mirst no.nieruneveiksmekā jaunas nepilngadīgas peles.Tfam^-/- pelēm bija raksturīgi nefronu nobriešanas defekti, kas bija saistīti ar mt samazināšanos, OXPHOS samazināšanos un vielmaiņas pāreju uz glikolīziTfam^-/- nieruepitēlijs. Ņemot vērā cistiskās slimības smagumuTfam^-/- pelēm, mēs analizējām 2 peles modeļuspolicistiska niereslimība(PKD), ko izraisa mutācijas vai nu policistīnā-1 (PKD(policistiskā nieru slimība)1) vai cistīns-1 (Cys1), kā arī cilvēka audi no pacientiem ar autosomāli dominējošu policistisku nieru slimību (ADPKD). Mēs to nosakāmTfam^-/- ir disregulēts gan peļu, gan cilvēka PKD cistās(policistiskā nieru slimība), audi. Kopumā mūsu pētījumi liecina, ka TFAM disregulācija un mt samazināšanās ir raksturīgas pazīmesnierucistiskās slimības un var veicināt to patoģenēzi.

cistancheir labs priekšpolicistiska nieru slimība

REZULTĀTI

Tfam inaktivācija SIX2 cilts šūnās izraisa smagu cistisku slimību, kā rezultātānieruneveiksmeLai izpētītu mt funkcijunieruepitēlijā mēs inaktivējām Tfam SIX{0}}ekspresējošās cilmes šūnās, kas rada visus nefrona segmentus, izņemot savācējvadu (CD).15 Šim nolūkam mēs šķērsojām Tfam floxed alēli ar baktēriju mākslīgo hromosomu transgēnām pelēm, kas ekspresē. uzlabots zaļā fluorescējošā proteīna/Cre rekombināzes saplūšanas proteīns (eGFP/Cre), ko transkripcijas kontrolē Six2 promotors (1.a attēls).16 Peles ir homozigotas Tfam floxed alēlei un heterozigotas eGFP/Cre transgēnam (Seši{0}}eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) turpmāk tiek saukts par sešiem2-Tfam^-/- mutanti. Seši2-Tfam^-/- peles piedzima paredzētajās Mendeļa attiecībās, un tās nebija atšķiramas no Cre metiena biedru kontroles, veicot vizuālu pārbaudi dzimšanas brīdī. Tomēr ķermeņa svara atšķirības starp sešiem2-Tfam^-/- mutanti un Cre metiena biedru kontroles kļuva redzami 14. pēcdzemdību dienā (P) (5,7 plus -0,3 g mutantiem pret 7,5 plus -0,3 g kontrolēm, n=4 katrai); P =0.004; Papildu tabula S1). Seši2-Tfam^-/- mutantu pelēm bija raksturīgas palielinātasnieressalīdzinot ar kontrolēm (nieres/ķermeņa svara attiecība 1,45 procenti plus -0,19 procenti mutantiem pret 0,60 procentiem plus - 0,02 procenti kontrolei, n {{8} } katrs, P < 0,001;="" 1.b="" attēls,="" papildu="" tabula="" s1)="" un="" nomira="" vecumā="" no="" p20="" līdz="" p30="" (1.b="" attēls).="" nepilngadīgo="" letalitāte="" mutantu="" kohortā="" bija="" saistīta="">nieruneveiksmeno smagas cistiskās slimības ar urīnvielas slāpekļa līmeni asinīs 68,40 plus -5,32 mg/dl pelēm mutantēm, salīdzinot ar 16.8 2.0 mg/dl kontroles grupām ( n= 6 un attiecīgi 7; P < 0,0001;="" 1.b="" un="" c="" attēls).="" turklāt="" six2-tfam/mutantiem="" attīstījās="" ievērojama="" albuminūrija="" (urīna="" albumīna/kreatinīna="" attiecība="" 43,58="" plus="" -362.475,18="" mg/g="" six2-tfam/mutantiem="" pret="" 3,39="" mg/g="" kontroles="" grupās="" attiecīgi="" pie="" p14,="" n="6" un="" 10;="" p="">< 0,0001).="" tas="" atbilst="" cre="" rekombināzes="" ekspresijas="" modelim="" six2="" nefrona="" cilmes="" šūnās,="" kas="" rada="" no="" vāciņa="" mezenhīmu="">nierukanāliņi un podocīti.15 Atšķirībā no Six2-Tfam^-/- mutanti, peles ar heterozigotu Tfam deficītu SIX2 cilmes šūnās attīstījās normāli, bija auglīgas un neattīstījās atklātinieresslimība(Papildu attēls S1).

1. attēls|Tfam inaktivācija SIX2 cilts šūnās izraisa smagu cistisku slimību un nieru mazspēju. (a) Shematisks attēls, kas ilustrē eksperimentālo pieeju un mērķa sekvenču atrašanās vietu Tfam floxed alēlē. Kopējās genoma nieres DNS polimerāzes ķēdes reakcijas analīze, kas izolēta no metiena biedru kontroles (Cre ) un sešiem2-Tfam^-/-peles pēcdzemdību dienas (P) 7 vecumā; nerekombinējošā Tfam floxed alēle tiek apzīmēta ar 2-lox (2); rekombinētā alēle ar 1-lox, savvaļas tipa alēle ar wt; þ vai — norāda Six2-eGFP/Cre transgēna esamību vai neesamību. (b) Kreisie paneļi, Cre kontroles un sešu nieru fotogrāfijas2-Tfam^-/- pelēm P20 vecumā. Nieru svars (KW) ir izteikts procentos no ķermeņa svara (BW) (n= 4–14). Labie paneļi, urīnvielas slāpekļa (BUN) līmenis asinīs Cre metiena biedru kontrolē (co) un Six2-Tfam^-/-peles P7 vecumā (attiecīgi n=7 un 6) un Kaplan-Meier izdzīvošanas līknes Cre kontrolei un sešiem2-Tfam^-/- pelēm, salīdzinot ar log-rank testu (n=10–13). (c) Formalīnā fiksētu, parafīnā iestrādātu nieru sekciju reprezentatīvi attēli no Cre control un Six2-Tfam^-/-pelēm vecumā P7 un P29, kas iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E) un analizētas ar imūnhistoķīmiju, lai noteiktu a-gludo muskuļu aktīnu (ACTA2) un klasteru diferenciācijas (CD) antigēnu 31. Ciparu zīmes attēlo cistiskās struktūras, bet zvaigznītes attēlo glomerulus. Stieņi ¼ 1 mm veseliem nieres šķērsgriezumiem, 100 mm lieljaudas H&E attēliem un 50 mm IHC attēliem. Dati ir izteikti kā vidējais plus SEM un tika analizēti ar 2-saites Stjudenta t-testu. ***P < 0,001.="" lai="" optimizētu="" šī="" attēla="" skatīšanu,="" lūdzu,="" skatiet="" šī="" raksta="" tiešsaistes="" versiju="" vietnē="">

Sešu analīze2-Tfam^-/- peles, kas arī izteica ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reportiera alēli, kas šeit saukta par Six2-mT/mG;Tfam^-/- pelēm, norādot, ka lielākā daļa cistisko struktūruTfam^-/- nieres tika iegūtas no šūnām ar Six{0}}eGFP/Cre ekspresiju (papildu attēls S2). Cistas sešos2-Tfam^-/- nieresuzrādīja proliferācijas pierādījumus, par ko liecina Ki67-pozitīvu cistu oderējušo epitēlija šūnu klātbūtne (vidēji w40 procenti no visām cistu oderējušajām epitēlija šūnām), savukārt šūnas, kas ir pozitīvas attiecībā uz šķelto kaspāzi 3, cistās netika konstatētas (papildu attēls S3 ). Šie atklājumi saskan ar paaugstinātu fosforilētās ārpusšūnu signālu regulētās kināzes (p-ERK) un b-katenīna līmeni sešos2-Tfam^-/- nieru audi (papildu attēls S3). Kopumā mūsu dati liecina, ka seši2-Tfam^-/- nierēm piemīt molekulāras iezīmes, kas bieži ir saistītas arnierucistiskās slimības.

3. attēls |Tfam^-/-cistas neizpauž kopīgus nefrona segmentam raksturīgos marķierus. (a) Formalīnā fiksētu, parafīnā iestrādātu nieru sekciju reprezentatīvi attēli no Six2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Formalīnā fiksētu, parafīnā iestrādātu nieru sekciju reprezentatīvi attēli no Six2-mT/mG;Tfam^-/-pelēm P14 vecumā ar IF tika iekrāsotas eGFP un uromodulīns. Zvaigznītes attēlo cistas ar intraluminālo uromodulīnu. Intraluminālā uromodulīna klātbūtne tika pārbaudīta cistās ar maksimālo diametru 50–100μm vai cistās, kuru maksimālais diametrs pārsniedz 100 mm. Stieņi=(a,b) 100 mm. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnēwww.kidney-international.org.

cistancheir labs priekšnieres

Six{0}}Tfam ir bojāta nefronu nobriešana^-/-pelēm

Tā kā var paiet vairākas nedēļas, līdz pelēm ar audiem specifisku Tfam inaktivāciju attīstās patoloģija17, mēs pēc tam pārbaudījām laika gaitu.nieruslimības attīstība sešās valstīs2-Tfam^-/-pelēm. Mēs savācām nieres no kontroles un mutācijas pelēm vecumā P0, P7 un P14 un izmantojām histoloģiskās metodes, imūnfluorescences (IF) krāsošanu un gēnu ekspresijas analīzi.nieresizraksti novērtējumam. IF krāsošana ar SIX2 un E-kadherīnu P0 vecumā parādīja, ka nieres no kontroles un sešiem2-Tfam^-/-bija histoloģiski līdzīgi. Kortikālo nefrogēno zonu struktūru veidošanās, piemēram, SIX2þ vāciņa mezenhīms, E-kadherīnu ekspresējošie urīnizvadkanāla galiņi un topošās nefronu struktūras, piemēram,nieruvezikulas un komata formas un S formas ķermeņi netika bloķēti sešos2-Tfam^-/-nieres (2.a attēls). Šie histoloģiskie atklājumi atbilda nefrogēnos marķierus kodējošo gēnu ekspresijas līmeņiem. Six2, sapārotā 2. kastes (Pax2), LIM homeoboksa proteīna 1 (Lhx1) un spaltam līdzīgā transkripcijas faktora 1 (Sall1) mRNS līmeņi kontroles un sešu mRNS līmeņos būtiski neatšķīrās2-Tfam^-/- peles kopāniereshomogenāti no P0nieres(2.b attēls). Tas liecināja, ka TFAM inaktivācija SIX2 nefronu priekštečos būtiski neietekmēja nefrogēno struktūru veidošanos.

Lai gan topošās nefrona struktūras veidošanās netika kavēta, krāsošana ar Alcian Blue/periodskābi – Šifa un lotosa tetragonolobusa lektīnu liecināja par nepilnīgu terminālo nefrona nobriešanu sešos 2-Tfam^-/-pelēm P{{0}} vecumā. Alcian zilā/periodiskā skābe – Šifa, kas krāso cauruļveida pamatnes membrānas un suku apmali, un lotosa tetragonolobusa lektīns, kas identificē specifiskus oligosaharīdus proksimālo kanāliņu šūnu otas malās, tika samazināts mutantu nierēs. 2.c attēlā parādīta alcian zilā/periodskābe – Šifa krāsošanās laika punktos P0, P7 un P14. Lotosa tetragonolobusa lektīna histoķīmija un IF krāsošana Vilmsa audzēja 1 proteīnam P{{10}}, P7 un P14 laika punktos ir parādīta S4 papildu attēlā. Vecumā P0 relatīvais laukums, kas pozitīvi iekrāsojās ar lotosa tetragonolobusa lektīnu, bija 2,10 procenti, 0,51 procenti un {{30}},39 procenti 0,1 procents P7 vecumā pret 6,25 procentiem 0,28 procentiem un 6,2 procentiem 1,1 procentiem attiecīgi kontrolēm (n ¼ 3–4, P ¼ 0,0004 un 0,0007, attiecīgi; S4 papildu attēls). Atbilstoši šiem histoloģiskajiem atklājumiem ir ievērojama gēnu ekspresijas samazināšanās, kas kodē glomerulāro un nefronu segmentam raksturīgos marķierus podocīnu, nefrīnu, akvaporīnu 1 (Aqp1), nātrija-fosfāta kotransportieri 2a (NaPi2a), uromodulīnu, nātrija-kālija hlorīda kotransportieri 2. Nkcc2) un pret tiazīdiem jutīgu nātrija hlorīda kotransportētāju (Ncc) sešos2-Tfam^-/-pelēm (2.b attēls). Kopumā šie dati liecina, ka seši2-Tfam^-/- nieresuzrāda pakāpenisku nobriedušu proksimālo nefronu segmentu un glomerulu skaita samazināšanos.

Tā kā Six2-eGFP/Cre aktivitātes rezultātā veidojas no TFAM deficīta vāciņa mezenhīma atvasināti nefrona segmenti, mēs paredzējām, ka CD epitēlija šūnu nobriešana, kas ir no urīnizvadkanāla pumpuriem, netiks ietekmēta sešos {{2} }Tfam^-/-nieres. Atbilstoši šim priekšstatam ir tāds, ka iekrāsošanās ar Dolichos biflorus aglutinīnu, kas reaģē ar N-acetil-D-galaktozi distālajā kanāliņā un CD, liecināja par Dolichos biflorus aglutinīna pozitīvo struktūru relatīvu pārspīlējumu sešās valstīs2-Tfam^-/-nieres. P7 vecumā Dolichos biflorus aglutinīna pozitīvi iekrāsotie apgabali veidoja 13,91 procentus 0,9 procentus no mutantu kopējās platības, salīdzinot ar 1,93 procentiem 0,1 procentu kontroles grupā (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Papildu attēls S4). Nātrija kanāla epitēlija 1 alfa apakšvienības (Scnn1a) vai akvaporīna 2 (Aqp2), kuras abas ir ekspresētas CD epitēlija šūnās, mRNS ekspresija nebija būtiski samazināta salīdzinājumā ar kontroli (2.b attēls). Pretstatā Six2-Tfam^-/-nieres, Tfam inaktivācija homeobox B7 (HOXB7) cilmes šūnās, kas rada CD epitēlija šūnas, kā rezultātā tiek zaudēta CD nefrona marķiera ekspresija un viegla cauruļveida dilatācija, bet ne cistoģenēze (papildu attēls S5). Kopumā mūsu dati liecina, ka TFAM funkcijas zudums SIX2 cilmes šūnās nebloķē topošo nefronu struktūru attīstību, bet kavē terminālo nefronu nobriešanu.

Tfam^-/-cistām trūkst kopējo nefrona segmenta marķieru

Raksturot histoģenētisko izcelsmiTfam^-/- nierucistas, mēs veicām IF analīzesTfam^-/- nieresat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm raksturoja uromodulīna intraluminālas nogulsnes, kas liecināja par izcelšanos no nefrona segmentiem, kas atrodas distālā attālumā no proksimālā kanāliņa un Henles lejupejošās cilpas (3.b attēls).

Progresējošas mt funkcijas un morfoloģijas anomālijasTfam^-/- epitēlija šūnas

Lai raksturotu Tfam dzēšanas metabolisma seku laika gaitu, mēs vispirms pārbaudījām Tfam un TFAM regulēto mt-Co1, mt-Cyb un mt-Atp6 mRNS līmeni.Tfam^-/- nieresvecumā P0, P7 un P14. Kā gaidīts, Tfam, mt-Co1, mt-Cyb un mt-Atp6 mRNS līmenis tika ievērojami samazināts (4.a attēls).Tfam^-/-epitēlija šūnās, kas marķētas ar eGFP (Seši{{0}} mT/mG; Tfam / peles), bija ievērojams MT-CO1 proteīna ekspresijas samazinājums (papildu attēls S7). Mt DNS kopiju skaits tika samazināts par 63 procentiem, kas atbilst mt izsīkumam, kas ir TFAM deficīta pazīme (4.a attēls). Turpretim kodolgēnu, kas kodē nikotīnamīda adenīna dinukleotīdu: ubikinona oksidoreduktāzes kodola apakšvienības 3 (Ndufs3) un sukcināta dehidrogenāzes kompleksa flavoproteīna apakšvienības A (Sdha), ekspresija netika ietekmēta P0 vecumā, bet tika samazināta P7 un P4a (Figure P14a) vecumā. Šie mt gēna un proteīna analīzes atklājumi atbilst pakāpeniskai mt kopiju skaita zudumam Tfam / epitēlijā.

Pēc tam mēs pētījām Tfam inaktivācijas metabolisma ietekmi primārajās proksimālajās kanāliņu epitēlija šūnās (PTEC), kas izolētas P7 vecumā.Tfam^-/- PTEC uzrādīja ievērojamu skābekļa bāzes patēriņa rādītāju samazināšanos (40.77 4.10 mutantiem pret 61.75 5.18 pmol/min/104 šūnām kontrolēm, n=3 katra, P =0.034), ar ATP saistīta elpošana (33.11 3.91 mutantiem pret 46.92 4.91 pmol/min/104 šūnas kontrolēm, n{{18} } katrs, P=0.093), maksimālā elpošana (116.8 14.19 mutantiem pret 225.5 13.55 pmol/min/104 šūnām kontrolei, n{{ 28}} katrs, P=0.005) un rezerves elpošanas kapacitāte (76.05 10.18 mutantiem pret 163.7 8.61 pmol/min/104 šūnām kontrolgrupām). , n =3 katrs, P=0.003; 4.b attēls).

Lai vēl vairāk raksturotu mt izsīkuma un bojājumu pakāpi, mēs pārbaudījāmTfam^-/- nieresizmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju un {{0}}dimensiju strukturētā apgaismojuma mikroskopiju (3D SIM). P7 vecumā mitohondrijiem bija neregulāras formas un balonu veidošanās, kas atbilst iepriekšējiem atklājumiem Tfam nokautām pelēm. Transmisijas elektronu mikroskopiskā analīze liecināja, ka mitohondriju strukturālās anomālijas, piemēram, palielināts izmērs un patoloģiskas kristas, progresēja pēcdzemdību periodā, jo morfoloģiskās atšķirības starp mutantiem un kontroli bija mazāk pamanāmas P0 vecumā un kļuva smagākas ar vecumu (4.c attēls). ). 3D SIM tika izmantota, lai pārbaudītu mt apjomu un tīkla izmēru sešos{6}}mT/mG; Tfam/mutanti, salīdzinot ar sešām2-mT/mG kontroles pelēm P7 vecumā; mt tilpums tika mērīts 5 līdz 8 kanāliņu šķērsgriezumos katrā sekcijā, pārbaudot 25 līdz 40 eGFP pozitīvas garozas epitēlija šūnas, kas iekrāsotas uz no sprieguma atkarīgo anjonu selektīvo kanālu 1 ar IF krāsošanu. Mēs atklājām, ka kopējais mt tilpums uz vienu eGFP pozitīvo šūnu ir ievērojami samazināts (62.66 16.46 mm3/šūna mutantiem pret 177.4 30.17 mm3/šūna kontrolei, n ¼ 3 katra , P ¼ 0.0289), un tas bija saistīts ar izmaiņām kopējā mt tilpuma attiecībā pret kopējo šūnu tilpumu no 0.230 0.01 kontroles grupās uz 0.{{ 33}}.016 Six2-Tfam/mutanti (n ¼ 3 katrs, P ¼ 0,0017; 4.c attēls). Maksimālais mt tīkla lielums, kas mēra lielāko mt tīklu visās pārbaudītajās eGFP pozitīvajās šūnās, tika samazināts sešos 2-Tfam^-/- nieres(143.2 23.2 mm3 mutantiem pret 318.3 49.45 mm3 kontrolei, n ¼ 3 katrs, P ¼ 0.0327). Kopumā ultrastrukturālie un SIM atklājumi, kā arī mt gēnu un proteīnu analīzes rezultāti atbilst progresējošam mt kopiju skaita zudumam.Tfam^-/- epitēlijs.

Cistancheir labs priekšpolicistiska nieru slimība

TFAM deficīts novirza nieru epitēlija metabolismu uz glikolīzi

PTECsnieresizmanto taukskābju b-oksidāciju un OXPHOS ATP ģenerēšanai un ir glikoneoģenētiski.18 Lai gūtu papildu ieskatu vielmaiņas pārmaiņās, kas saistītas ar Tfam inaktivāciju, mēs veicām RNS sekvencēšanas analīzinieresno sešiem2-Tfam^-/-un Cre metiena biedru kontroles peles P7 vecumā. Mēs noskaidrojām, ka galvenie regulējošie gēni, kas iesaistīti glikolīzē, piemēram, heksokināze 2 (Hk2) un enolāze 2 (Eno2), tika regulēti. Turpretim vairumam trikarbonskābes ciklā iesaistīto gēnu ekspresija tika samazināta (piemēram, izocitrāta dehidrogenāze 1 [Idh1]), kā arī taukskābju b-oksidācijā iesaistīto gēnu, piemēram, acetilkoenzīma A aciltransferāzes 1B, ekspresija. Acaa1b), vidējas ķēdes acilkoenzīma A dehidrogenāze (Acadm) (5.a un b attēls, S8 papildu attēls). Atbilstoši trikarbonskābes cikla oksidācijas gēnos iesaistīto gēnu ekspresijas samazināšanās bija neitrālu lipīdu uzkrāšanās, ko noteica eļļas sarkanā O krāsošana saldētā veidā.nieressekcijas P14 vecumā (5.c attēls).

Samazināta TFAM ekspresija peles un cilvēka PKD audos ir saistīta ar mt samazināšanos

Tā kā seši2-Tfam^-/- nieresbija ļoti līdzīgs PKD(policistiskā nieru slimība) nieres, mēs pēc tam novērtējām, vai TFAM tika neregulēts PKD(policistiskā nieru slimība)audus. Vispirms mēs pārbaudījām TFAM un TFAM regulēto gēnu ekspresiju 2 labi izveidotos ģenētiskos PKD peles modeļos. Tfam mRNS līmenis tika ievērojami samazināts visu nieru homogenātos no Pkd^-/- un Cys^cpk/cpkpelēm, kurām ir mutācijas vai nu PKD1(policistiskā nieru slimība)vai Cys1. Tas bija saistīts ar mitohondriju un kodolu kodēto mt gēnu ekspresijas samazināšanos, kā arī ar disregulētu glikolītiskā gēnu ekspresiju. Līdzīgi kā Seši2-Tfam^-/-nieres, PKD(policistiskā nieru slimība)^-/- un Cys^cpk/cpk nierestika raksturoti ar paaugstinātu Eno2 un Hk2 un ievērojami samazinātu fosfoglicerāta kināzes (Pgk) 1, piruvāta dehidrogenāzes kināzes (Pdk) 1 un Pdk4 transkripta līmeni (6.a attēls). TFAM proteīna ekspresija, kas novērtēta ar IF krāsošanu, tika samazināta cistu apvalka epitēlija šūnās, salīdzinot ar epitēlija šūnām no blakus esošajām noncistiskām kanāliņām (6.b attēls). Tas bija saistīts ar samazinātu mt-Co1 un mt-Atp6 ekspresiju ar RNS fluorescences in situ hibridizāciju (6.b attēls, S9 papildu attēls); mt tilpums, kā noteikts 3D SIM kartē, tika samazināts par 55 procentiem, salīdzinot ar epitēlija šūnām no blakus esošajām noncistiskām kanāliņām vai PTEC no normālas kontroles.nieres. Atšķirības mt tilpumā starp parastajiem kontroles PTEC un PTEC no noncistiskām kanāliņiem netika atrastas (6.c attēls).

Lai pārbaudītu, vai TFAM ekspresijas zudums ir cilvēka PKD kopīga molekulārā iezīme(policistiskā nieru slimība), mēs analizējām nefrektomijas paraugus no 5 ADPKD pacientiem, izmantojot imūnhistoķīmiju, IF krāsošanu, RNS fluorescenci in situ hibridizāciju un 3D SIM. Samazināta TFAM ekspresija tika novērota 75,2 procentiem plus -7,5 procentiem nonierucistas, kas analizētas ar imūnhistoķīmiju. Tas bija saistīts ar samazinātu MT-CO1 un MT-ATP6 ekspresiju ar RNS fluorescences in situ hibridizāciju (7.a attēls, S10 papildu attēls); mt tilpums cistu apšuvumajās epitēlija šūnās tika samazināts par aptuveni 70 procentiem, novērtējot ar 3D SIM karti (7.b attēls). Kopumā 2 PKD analīze(policistiskā nieru slimība)peles modeļi un cilvēka ADPKD audi liecināja, ka TFAM deficīts un mt izsīkums ir izplatīti konstatējumi PKD(policistiskā nieru slimība)audus un var ietekmēt patoģenēzinierucistiskā slimība.

cistanche ir labspolicistiska nieru slimība

Diskusija

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu informāciju par šī raksta II daļu (diskusija).

Izvilkums no:'NieresUz epitēlija mērķtiecīga mitohondriju transkripcijas faktora A deficīts izraisa progresējošu mitohondriju izsīkumu, kas saistīts ar smagu cistisko slimību, raksta Ken Ishii1, 2,11 et al.

---NieresInternational (2021) 99, 657–670