Visa genoma sekvencēšana, lai diagnosticētu neiroloģiskus atkārtotas paplašināšanās traucējumus Apvienotajā Karalistē: retrospektīvas diagnostikas precizitātes un paredzamās klīniskās validācijas pētījums

Lai iegūtu vairāk informācijas:ali.ma@wecistanche.com

Kopsavilkums

Fons

Atkārtotas paplašināšanās traucējumi skar apmēram 1 no 3000 indivīdiem un ir klīniski neviendabīgas slimības, ko izraisa īsu tandēma DNS atkārtojumu paplašināšanās. Ģenētiskā pārbaude bieži ir specifiska lokusam, kā rezultātā cilvēki, kuriem ir netipiskas klīniskas izpausmes, netiek diagnosticēti, īpaši pediatriskiem pacientiem bez iepriekšējas pozitīvas ģimenes anamnēzes. Visa genoma sekvencēšana arvien vairāk tiek izmantota kā pirmās rindas tests citiem retiem ģenētiskiem traucējumiem, un mūsu mērķis bija novērtēt tās veiktspēju, diagnosticējot pacientus arneiroloģiskiatkārtotas paplašināšanās traucējumi.

Metodes

Mēs retrospektīvi novērtējām visa genoma sekvencēšanas diagnostisko precizitāti, lai noteiktu visbiežāk sastopamos atkārtotos paplašināšanās lokusus, kas saistīti arneiroloģiskirezultātus (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT un TBP), izmantojot paraugus, kas iegūti Anglijas Nacionālajā veselības dienestā no pacientiem, kuriem bija aizdomas par saslimšanu.neiroloģiskitraucējumi; Iepriekšējie PCR testa rezultāti tika izmantoti kā atsauces standarts. Visa genoma sekvencēšanas klīniskā precizitāte, lai noteiktu atkārtotu paplašināšanos, tika prospektīvi pārbaudīta iepriekš ģenētiski pārbaudītiem un nediagnosticētiem pacientiem, kuri 2013.–2017. gadā tika pieņemti darbā 100 000 genomu projektā Apvienotajā Karalistē un kuriem bija aizdomas par ģenētisku saslimšanu.neiroloģiskitraucējumi (ģimenes vai agrīnas ataksijas formas, neiropātija, spastiska paraplēģija, demence, motoro neironu slimība,parkinsonisma slimībakustībatraucējumi, intelektuālās attīstības traucējumi vai neiromuskulāri traucējumi). Ja atkārtots paplašināšanas izsaukums tika veikts, izmantojot visa genoma sekvencēšanu, rezultāta apstiprināšanai tika izmantota PCR.

Atzinumi

Visa genoma sekvencēšanas diagnostikas precizitāte, lai noteiktu atkārtotu paplašināšanos, tika novērtēta, salīdzinot ar 793 PCR testiem, kas iepriekš tika veikti NHS no 404 pacientiem. Visa genoma sekvencēšana pareizi klasificēja 215 no 221 paplašinātas alēles un 1316 no 1321 nepaplašinātas alēles, uzrādot 97,3 procentu jutību (95 procenti TI 94,2–99,0) un 99,6 procentu specifiskumu (99,1–99). ·9) 13 ar slimību saistītajos lokusos, salīdzinot ar PCR testa rezultātiem. Paraugos no 11 631 pacientiem, kas piedalījās 100 000 genomu projektā, visa genoma sekvencēšana identificēja 81 atkārtotu paplašinājumu, kas tika pārbaudīts arī ar PCR: 68 tika apstiprināti kā atkārtoti paplašinājumi visā patogēno diapazonā, 11 nebija. -patogēni starpposma paplašinājumi vai permutācijas, un divi bija neizvērsti atkārtojumi (16 procenti viltus atklāšanas rādītājs).

Interpretācija

Mūsu pētījumā visa genoma sekvencēšana atkārtotu paplašināšanos noteikšanai uzrādīja augstu jutību un specifiskumu, un tā ļāva identificētneiroloģiskiatkārtoti paplašināšanās traucējumi iepriekš nediagnosticētiem pacientiem. Šie atklājumi atbalsta visa genoma sekvencēšanas ieviešanu klīniskajās laboratorijās, lai diagnosticētu pacientus, kuriem irneiroloģiskiprezentācija, kas atbilst atkārtotas paplašināšanās traucējumiem.

Finansējums

Medicīnas pētījumu padome, Veselības un sociālās aprūpes departaments, Anglijas Nacionālais veselības dienests, Nacionālais veselības pētījumu institūts un Illumina.

Ievads

Neskatoties uz nesenajiem sasniegumiem mūsu izpratnē par reto ģenētisko pamatuneiroloģiskitraucējumi, līdz 70 procentiem pacientu ar šādiem traucējumiem ģenētiski netiek diagnosticēti.1–3 Daļēji tas ir saistīts ar tehniskajām problēmām, kas saistītas ar sarežģītu un atkārtotu ģenētisko variantu testēšanu, tostarp atkārtotu paplašināšanos; Tiek lēsts, ka šāda izplešanās skar aptuveni 1 no 3000 cilvēkiem (pielikums p 1), un tie ir galvenais iemesls vairāk nekā 40 neiroģenētiskiem traucējumiem4, tostarp Hantingtona slimībai un trauslā X sindromam. Atkārtotas paplašināšanās traucējumi ir klīniski un ģenētiski neviendabīgi, un atkārtota paplašināšanās var būt saistīta ar dažādām slimībām. Piemēram, C9orf72 paplašināšanās var izpausties kā amiotrofiska laterālā skleroze vai frontotemporālā demence.5 Atkārtota paplašināšanās dažādos lokusos var radīt līdzīgas fenotipiskas pazīmes, padarot tās grūti nošķirt klīniski: atkārtojas vismaz desmit spinocerebellāras ataksijas gēnos, kas bieži sastopami pieaugušajiem. sākusies ataksija6 un C9orf72 un AR gadījumā var izraisīt motoro neironu slimību.7,8

Atkārtotus paplašināšanās traucējumus izraisa atkārtotu īsu tandēma DNS sekvenču skaita palielināšanās, un katra traucējuma patogenitātes sliekšņi ir specifiski lokusam. Paplašinājuma lielums svārstās no mazāk nekā 30 atkārtojumiem (piemēram, CACNA1A) līdz vairākiem tūkstošiem atkārtojumu vienību (piemēram, FMR1, DMPK, C9orf72 un FXN, kuru izmērs var sasniegt līdz 5 kb). Atkārtota izplešanās uzrāda molekulāro nestabilitāti, kas var izraisīt atkārtojuma lieluma izmaiņas (parasti pieaugot garumā) paaudzēm un audiem.4 Šajos apstākļos atkārtojumu skaita palielināšanās bieži izraisa agrāku slimības sākšanos un smagāku slimību secīgos gadījumos. 4 Atkārtotu paplašināšanās traucējumu rašanās bērniem var izpausties kā multisistēmu sindromi bez specifiskiem fenotipiem9, un tāpēc bērni ar šiem traucējumiem, visticamāk, tiks nepietiekami diagnosticēti, ja ģimenes anamnēzē nav atkārtotu paplašināšanās traucējumu, nekā tad, ja tie ir klāt.10– 12

Atkārtotu izplešanās laboratoriskais novērtējums parasti aprobežojas ar mērķtiecīgu atsevišķa lokusa molekulāro novērtējumu, pamatojoties uz iespējamo klīnisko diagnozi, izmantojot PCR vai Southern blot metodes13, kas var būt dārgi un laikietilpīgi. Turklāt šo traucējumu daudzveidīgo un pārklājošo fenotipisko pazīmju dēļ ar slimību saistīti atkārtotas paplašināšanās loki var palikt nepārbaudīti.14

Visa genoma sekvencēšana kļūst par pirmās līnijas diagnostikas līdzekli pacientiem ar retām slimībām15, taču līdz nesenam laikam tika uzskatīts, ka tai ir ierobežotas iespējas novērtēt lokusus, kas satur atkārtotus paplašinājumus.16 Tomēr bioinformātikas sasniegumi ir padarījuši iespējamu slimību noteikšanu. -izraisot atkārtotu paplašināšanos no nākamās paaudzes sekvencēšanas datiem.17–22 Šeit mēs ziņojam par visa genoma sekvencēšanas pieejas diagnostisko novērtējumu, lai noteiktu atkārtotus paplašinājumus, izmantojot retrospektīvus PCR datus, un tās klīnisko apstiprinājumu pacientiem 100 000 genomu projektā, kuri bija aizdomas par neiroloģiskiem traucējumiem, kas nebija diagnosticēti ar iepriekšējo ģenētisko testu.

Metodes

Studiju dizains un dalībnieki

Šis visa genoma sekvencēšanas novērtējums atkārtotu paplašināšanos noteikšanai ietvēra gan diagnostikas precizitātes, gan klīniskās precizitātes novērtējumus. Diagnostikas precizitāte tika novērtēta, izmantojot datus no pacientiem, kuri iepriekš tika pārbaudīti ar PCR, lai noteiktu atkārtotu izplešanos, kas, kā zināms, izraisīja neiroloģiskas slimības.4 Pacienti tika identificēti no diviem avotiem: 100 000 Genomes Project un Genomikas laboratorijas, kas atrodas Kembridžas Universitātes slimnīcās ( Kembridža, Lielbritānija). Abām pacientu grupām PCR testēšanu veica Nacionālā veselības dienesta (NVD) laboratorijas pacientu paraugiem kā daļu no kārtējā klīniskā novērtējuma: paraugiem 100 000 genomu projektā PCR testus veica pirms pieņemšanas projektā. University College London Hospital Neiroģenētikas laboratorija (Londona, Lielbritānija); paraugi ar PCR apstiprinātu atkārtotu izplešanos tika iegūti no pacientiem, kurus pārbaudīja Genomikas laboratorija, kas atrodas Kembridžā. Pacienti ar PCR pozitīviem un PCR negatīviem testa rezultātiem atkārtotiem paplašināšanās traucējumiem tika identificēti iekļaušanai mūsu pētījumā, izmantojot laboratorijas ierakstu sistēmas; visi pacienti bija devuši rakstisku informētu piekrišanu viņu parauga izmantošanai kvalitātes nodrošināšanas un pētniecības un apmācības nolūkos klīniskā pakalpojuma optimizācijas un validācijas ietvaros.

Katra parauga visa genoma sekvencēšana tika veikta vienā no divām laboratorijām: Genomics England (Hinkstona, Apvienotā Karaliste) 100 000 genomu projekta paraugiem (n=254) un Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; Sandjego, CA, ASV) paraugiem, kas iegūti Genomikas laboratorijā, kas atrodas Kembridžā (n{3}}). Kopumā šī datu kopa tika izmantota pētījuma diagnostikas precizitātes daļai, un tā sastāvēja no PCR un visa genoma sekvencēšanas datiem no 404 pacientiem, aptverot 13 lokusus, kas pārstāv visbiežāk sastopamos neiroloģiskos atkārtotos paplašināšanās traucējumus: 11 lokusus, kas saistīti ar ataksiju un vēlu. sākušies neirodeģeneratīvi traucējumi (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 un FXN), viens lokuss, kas saistīts ar intelektuālo invaliditāti (FMR1), un viens lokuss, kas saistīts ar miotonisko distrofiju (DMPK). Katram lokusam PCR testa dati bija pieejami vismaz vienai paplašinātai alēlei (pielikums 24. lpp.).

Klīniskā precizitāte tika novērtēta, pārbaudot atkārtotu paplašināšanos atbilstību, kas konstatēta ar visa genoma sekvencēšanu, ar aizdomām par klīnisko diagnozi pēc PCR apstiprināšanas pacientiem ar aizdomām par ģenētiskiem neiroloģiskiem traucējumiem (ģimenes vai agrīnas ataksijas formas, neiropātija, spastiskā paraplēģija, demence , motoro neironu slimība,parkinsonisma slimībakustību traucējumi, intelektuālās attīstības traucējumi vai neiromuskulāri traucējumi), kas tika pieņemti darbā 100 000 genomu projektā 2013.–2017. gadā. 100 000 genomu projekts ir Apvienotās Karalistes programma, lai novērtētu visa genoma sekvencēšanas vērtību pacientiem ar neapmierinātām diagnostikas vajadzībām reto slimību un vēža gadījumā. Pēc Austrumanglijas Kembridžas Dienvidu pētniecības ētikas komitejas (atsauce 14/EE/1112) ētiskā apstiprinājuma projektam 100000 genomu, tostarp datu analīzei un diagnostikas rezultātu atgriešanai pacientiem, šos pacientus pieņēma darbā veselības aprūpes speciālisti un pētnieki no 13 Genomikas medicīnas centri Anglijā un tika iesaistīti projektā, ja viņi vai viņu aizbildnis sniedza rakstisku piekrišanu viņu paraugu un datu izmantošanai pētījumos, tostarp šajā pētījumā. Probands un, ja iespējams, citi ģimenes locekļi tika uzņemti saskaņā ar atbilstības kritērijiem, kas noteikti konkrētiem reto slimību stāvokļiem (pielikums 5.–11. lpp.). Pacienti tika pieņemti darbā 100 000 genomu projektā pēc standarta aprūpes ģenētiskās pārbaudes NHS, kā norādīts atbilstības kritērijos. Standartizēti sākotnējie klīniskie dati tika reģistrēti, izmantojot cilvēka fenotipēšanas ontoloģiju (HPO)23, salīdzinot ar slimībai specifiskiem datu modeļiem.24 Tika apkopots arī ģimenes locekļu slimības statuss attiecībā pret probandas klīnisko indikāciju testēšanai.

Lai identificētu izraisošu atkārtotu paplašināšanos pacientiem ar ģenētiski nediagnosticētu slimību, mēs pārbaudījām pacientus ar aizdomām par ģenētiskiem traucējumiem, kas atbilst atkārtotai paplašināšanās slimībai. Pacienti tika atlasīti, pamatojoties uz viņu slimības un HPO terminu atbilstību ar atkārtotu paplašināšanos saistītiem traucējumiem. Pacientu visa genoma sekvencēšanas dati tika aptaujāti, lai meklētu paplašinājumus noteiktās atkārtojumu kopās, izmantojot četrus dažādus atkārtojuma paplašināšanas paneļus atbilstoši to klīniskajām īpašībām (pielikums p 5). Atkārtotie paplašinājumi, kas atlasīti iekļaušanai šajos paneļos, ir visizplatītākie neiroloģiskās slimības izraisošie atkārtotas izplešanās loki. Pacienti ar klīniskām pazīmēm, kas varētu būt saderīgi ar vairāk nekā vienu atkārtotu paplašināšanās traucējumu, tika pārbaudīti vairākos paneļos. Ja atkārtots paplašināšanas izsaukums tika veikts, izmantojot visa genoma sekvencēšanu, tika veikta apstiprinoša pārbaude ar PCR.

Katram pacientam ar apstiprinātu atkārtotu paplašināšanos vietējais klīnicists tika informēts par iespējamo diagnostikas rezultātu, un tika novērtēts atkārtotas paplašināšanās ieguldījums pacienta klīniskajās pazīmēs. Atkārtotiem paplašinājumiem, kas pilnībā vai daļēji izskaidro pacienta klīniskās pazīmes, tika izdots diagnostikas ziņojums saskaņā ar vietējām standarta procedūrām.

Procedūras

NHS vēsturiskajiem paraugiem, kas tika izmantoti mūsu pētījuma diagnostikas precizitātes daļā, atkārtotas izplešanās iepriekš tika pārbaudītas, izmantojot PCR pastiprināšanu un fragmentu analīzi. Dienvidu blotēšana tika veikta lieliem C9orf72 paplašinājumiem. Mūsu pētījuma klīniskās precizitātes daļā atkārtotas paplašināšanās, kas tika atklātas ar visa genoma sekvencēšanu pacientiem no 100 000 genomu projekta, tika pārbaudītas ar PCR paraugos, kas tika glabāti NHS ģenētiskajās laboratorijās. Papildu informācija, tostarp primeru secības, ir sniegta pielikumā (2.–3., 25.–26. lpp.).

DNS tika sagatavota visa genoma sekvencēšanai, izmantojot TruSeq DNS PCR-free bibliotēkas sagatavošanu, un 150 bp vai 125 bp pāru galu sekvencēšana tika veikta uz HiSeq 2000 vai HiSeq X platformām Genomics England augstas caurlaidības genomu iekārtā un ICSL. . Genomi tika sekvencēti līdz vidējam dziļumam 35× (31× līdz 37×; pielikums 27. lpp.). Īsā tandēma atkārtojuma genotipēšana tika veikta, izmantojot ExpansionHunter programmatūras pakotnes versiju 3.1.2.25,26 Īsumā, ExpansionHunter pārkārto secības nolasījumus iepriekš noteiktai īsu tandēma atkārtojumu kopai, lai noteiktu indivīda abu alēļu lielumu (pielikums 3. lpp.).

ExpansionHunter izvade ietver aplēses par atkārtojošo elementu skaitu, kopējo izmēru un ticamības ierobežojumu katram novērtētajam lokusam. Medicīnas patoloģijas asociācijas un Amerikas Patologu koledžas vadlīnijas iesaka vizuāli pārbaudīt variantu izsaukumus augstas caurlaidības sekvencēšanas variantu rutīnas novērtēšanas laikā.

Tomēr īsus tandēma atkārtošanas variantus nevar adekvāti vizualizēt ar tādiem parastajiem vizualizācijas rīkiem kā Integrative Genomics Viewer.28 Lai pārbaudītu visu genoma sekvencēšanas datus, kas ir katra genotipa izsaukuma pamatā, tika izmantots grafu vizualizācijas rīks, kas ļauj tieši vizualizēt haplotipus un atbilstošo nolasīšanas kaudzi. of ExpansionHunter genotipu (pielikums 3., 15. lpp.). Pileup grafika vizuāla pārbaude tika veikta visiem visa genoma sekvencēšanas īsajiem tandēma atkārtotajiem izsaukumiem, lai apstiprinātu, ka ExpansionHunter prognoze alēlēm bija pilnībā ietverta katrā lasījumā (ti, atkārtojuma secība bija mazāka par sekvences lasīšanas garumu); lai apstiprinātu monoalēla vai bialēla izplešanās klātbūtni; noteikt iespējamos viltus pozitīvus zvanus; un, lai atklātu viltus negatīvas alēles bialēliskos atkārtotos paplašinājumos, piemēram, FXN (pielikums 4., 16. lpp.).

ExpansionHunter aprēķina atkārtojuma lielumu no visa genoma sekvencēšanas datiem, analizējot secības nolasījumus, kas pilnībā vai daļēji satur īsu tandēma atkārtojumu. Ja īsa tandēma atkārtojuma alēle ir īsāka par lasīšanas garumu, ExpansionHunter prognozē precīzu izmēru; ja īsa tandēma atkārtojuma alēle ir garāka par nolasīšanas garumu, ExpansionHunter novērtē atkārtojuma lielumu CI atkarībā no lokusa secības sastāva, sekvencēšanas dziļuma un sekvencēšanas kvalitātes.

Statistiskā analīze

Mēs klasificējām atkārtojumus kā paplašinātus ar visa genoma sekvencēšanu, ja ExpansionHunter prognozētais izmērs pārsniedz premutācijas robežvērtību, vai nepaplašinātos, ja paredzamais izmērs bija zem robežvērtības (pielikums, 28. lpp.).

Jutīgums un CI visa genoma sekvencēšanas atkārtojuma paplašināšanās noteikšanai tika aprēķināti kā alēļu ar paplašinātiem atkārtojumiem proporcija starp iepriekš PCR apstiprinātajām alēlēm ar paplašinātiem atkārtojumiem. Specifiskums tika novērtēts kā nepaplašināto alēļu īpatsvars starp iepriekš pārbaudītajiem nepaplašinātiem atkārtojumiem ar PCR. Pilns statistikas formulu apraksts ir sniegts pielikumā (p 1).

Lai salīdzinātu atkārtojumu izmērus ar PCR ar atkārtojuma lieluma aprēķiniem pēc visa genoma sekvencēšanas, PCR kvantitatīvās alēles tika salīdzinātas ar ExpansionHunter prognozētajiem atkārtojumu izmēriem alēlēm, kas bija īsākas par lasīšanas garumu visos 13 īsajos tandēma atkārtojuma lokusos. Atbilstība tika aprēķināta pēc ExpansionHunter prognozētā atkārtojuma lieluma procentuālā daudzuma, kas saskanēja ar PCR kvantitatīvo izmēru, ņemot vērā PCR kļūdu plus vai mīnus viens atkārtojums. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot R statistikas programmatūras versiju 3.6.3.

Finansējuma avota loma

Pētījuma plānošanu, pacientu uzņemšanu, datu vākšanu un secību vadīja Genomics England darbinieki un akadēmiskie pētnieki. Uzņēmuma Illumina darbinieki veica 150 pacientu paraugu sekvencēšanu kā visa genoma sekvencēšanas diagnostikas precizitātes pētījuma plānoto sastāvdaļu un izstrādāja ExpansionHunter. Genomics England darbinieki, akadēmiskie pētnieki un līdzautori RTH, ED un MAE veica atkārtotu paplašināšanos analīzi un interpretāciju pacientiem, kas tika pieņemti darbā 100 000 Genomes Project. Finansējuma avotiem nebija nozīmes datu interpretācijā vai ziņojuma rakstīšanā.

Rezultāti

Visa genoma sekvencēšanas diagnostiskā precizitāte, lai noteiktu atkārtotu paplašināšanos, tika novērtēta, salīdzinot ar 793 PCR testiem, kas iepriekš tika veikti NHS ietvaros no 404 pacientiem (64 pacientiem tika pārbaudīts vairāk nekā viens atkārtojums; 1. attēls). No šiem testiem 183 tika klasificēti kā ar paplašinātu atkārtojumu un 610 tika klasificēti kā tādi, kuriem nav atkārtota izplešanās ar PCR, kopumā iegūstot 221 paplašinātu un 1321 nepaplašinātu individuālu alēli 13 slimības lokusos (pielikums 24., 28. lpp.). Visa genoma sekvencēšana, salīdzinot ar PCR testa rezultātiem, pareizi klasificēja 215 no 221 paplašinātas alēles un 1316 no 1321 nepaplašinātas alēles (pielikums 27., 29. lpp.), uzrādot sākotnējo jutību 97,3 procenti (95 procenti TI 94,2–99). ·0) un specifiskums 99,6 procenti (99,1–99,9; 1. tabula). Pēc visu zvanu vizuālās korekcijas, pamatojoties uz nolasījumu kvalitāti, jutība palielinājās līdz 99,1 procentiem (96,8–99,9) un specifiskums līdz 100 procentiem (99,7–100; 2.A attēls, 1. tabula). Paplašināto alēļu vizualizācija ļāva atklāt viltus pozitīvus rezultātus un pārklasificēt visas viltus negatīvās alēles FXN, no kurām tikai viena alēle tika pareizi klasificēta kā paplašināta paraugos ar bialēliskiem paplašinājumiem (pielikums 17., 18. lpp.).

Atkārtojuma garums tika kvantificēts ar PCR 509 PCR testos, aptaujājot 945 alēles 13 atkārtotos izplešanās lokos. Korelācijas starp ExpansionHunter un PCR atkārtojumu izmēriem, kas ir īsāki un lielāki par secības nolasīšanas garumu (ti, 150 bp), ir parādīti pielikumā (pielikums 19. lpp.). Augsta atbilstība tika novērota atkārtojumiem, kas bija īsāki par nolasīšanas garumu, ar 92,7 procentiem (836 no 902) vienošanos starp PCR un ExpansionHunter. Tika novērota lokusa mainīgums ar augstu ExpansionHunter un PCR atbilstību ATXN2, ATXN7, CACNA1A un HTT, un zemu atbilstību DMPK vai TBP (pielikums 30. lpp.). ExpansionHunter nenovērtēja to alēļu garumus, kas ir lielāki par lasīšanas garumu, kas ietekmēja izsaukšanas precizitāti DMPK, FMR1 un FXN (2.B attēls, pielikums 19., 31. lpp.).

Lai gan ExpansionHunter spēja pareizi identificēt lielas paplašinātas alēles FMR1, DMPK, C9orf72 un FXN (pielikums p 29), prognozētie lieluma aprēķini mēdza būt zemāki nekā tie, kas iegūti ar PCR, jo atkārtojuma lielums palielinājās patogēnu diapazonā, kas ietekmēja spēja atšķirt lielus un mazus paplašinājumus DMPK, C9orf72 un FXN vai pilnus paplašinājumus un permutācijas FMR1 (pielikums 31. lpp.). Piemēram, lokusiem ar PCR novērtēto atkārtojumu garumu, kas pārsniedz 200 atkārtojumus FMR1 un kas klasificēti kā pilna mutācija, ExpansionHunter aprēķinātais vidējais atkārtojuma lielums bija 92,6 (SD 17,8; pielikums p 31).

Lai pārbaudītu atkārtotas paplašināšanās noteikšanas spēju ar visa genoma sekvencēšanu, lai atrisinātu iepriekš pārbaudītu un ģenētiski nediagnosticētu pacientu diagnozi, mēs pārbaudījām 11 631 pacientus ar aizdomām par ģenētisku neiroloģisku traucējumu, kuri tika pieņemti darbā 100 000 genomu projektā (1. attēls). Visa genoma sekvencēšanas dati tika novērtēti, izmantojot četrus dažādus atkārtotas paplašināšanas paneļus atbilstoši pacienta klīniskajām iezīmēm. To pacientu skaits, kuri tika pārbaudīti ar katru no četriem paneļiem, ir parādīti 2. tabulā.

Kopumā mēs atklājām un vizuāli apstiprinājām atkārtotu izplešanos paraugos no 105 pacientiem (2. tabula, pielikums, 2. lpp.0, 33). No tiem 81 paraugs bija pieejams apstiprinošai pārbaudei ar PCR, un 68 paraugiem tika apstiprināta atkārtota izplešanās (0·6 procentu iznākums): 45 (1,2 procenti) no 3692 panelī A, astoņi ({ {18}}·3 procenti ) no 2743 panelī B, pieci (0,6 procenti ) no 860 panelī C un desmit (0,1 procenti ) no 6731 panelī D. Trīspadsmit no 81 paplašināšanas zvana netika apstiprināti kā patogēni atkārtotas izplešanās (16% viltus atklāšanas rādītājs). No tām divas bija nepaplašinātas alēles ATXN1 un ATXN2, četras bija FMR1 vidēja izmēra izsaukumi (pielikums p 21), un septiņas bija FMR1 permutācijas.

Klīniskā informācija par 68 pacientiem ar atkārtotu paplašināšanos, kas apstiprināta ar PCR, tostarp to klīniskās prezentācijas, identificētā atkārtotā paplašināšanās un atkārtotas paplašināšanās ietekme uz pacienta klīniskajām iezīmēm, ir sniegta 3. tabulā; HPO noteikumi, ExpansionHunter aprēķinātais atkārtojuma lielums un tas, vai ir izdots diagnostikas ziņojums, ir uzskaitīti pielikumā (33. lpp.).

Paplašināšanās tika novērota pacientiem, kuriem bija dažādas pārklājošas klīniskās izpausmes, kas pārbaudītas ar paneli A (3. tabula, pielikums, p 22), tostarp ATXN2 atkārtošanās paplašināšanās pacientam ar agrīnu Parkinsona slimību, kas reaģē uz levodopu un kam anamnēzē ir progresējoša smadzenīšu ataksija. , un AR paplašināšanās četriem pacientiem, kuriem klīniski diagnosticēta Charcot-Marie-Tooth slimība, tostarp vienam ar ģenētiski apstiprinātu demielinizējošu neiropātiju (ti, Charcot-Marie-Tooth slimības 1. tips, pacients 42; pielikums 33. lpp.). Pacientiem ar patogēnu atkārtotu paplašināšanos tika novērots plašs iepriekšējo klīnisko diagnožu klāsts.

Piemēram, septiņiem pacientiem ar amiotrofisku laterālo sklerozi vai citu motoro neironu slimību tika konstatēta AR (n=4) un C9orf72 (n=3) palielināšanās. Pacientiem, kuriem ir aizdomas par iedzimtu ataksiju, mēs identificējām lokusu paplašināšanos, kas nebija novērtēta kā daļa no ikdienas diagnostikas NHS darbā pieņemšanas laikā, tostarp ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP un ​​HTT ( 3. tabula). Mēs arī konstatējām atkārtotu paplašināšanos pacientiem ar klīniskām pazīmēm, kas atbilst alternatīviem atkārtotas ekspansijas traucējumiem, tostarp C9orf72 paplašināšanos agrīnas un ģimenes Parkinsona slimības gadījumā (24. pacients, 3. tabula) un atkārtotu paplašināšanos HTT samazinātā iespiešanās diapazonā (38 atkārtojumi). divās māsās ar kustību traucējumiem, demenci, depresiju un runas grūtībām (pacientiem 44 un 45), uzsverot diagnostisko izaicinājumu, ko rada šie atkārtotie paplašināšanās traucējumi.

Tika konstatēts, ka astoņiem bērniem, kas tika pārbaudīti ar paneli B, bija lieli CAG atkārtojumi (3. attēls), no kuriem septiņi pilnībā izskaidro pacienta klīniskās pazīmes. Sešiem pacientiem nebija informatīvas ģimenes anamnēzes, un viņiem netika piedāvāta atkārtota paplašināšanās pārbaude kā daļa no viņu klīniskā novērtējuma vervēšanas laikā (pacienti 48–53; 3. tabula, pielikums, 33. lpp.). Diviem no šiem bērniem bija lieli HTT paplašinājumi (90–100 CAG atkārtojumi). Jāatzīmē, ka viens bērns bija mantojis atkārtojumu no neskarta vecāka, kura ģimenes anamnēzē nav bijusi Hantingtona slimība. Ģimenes pārbaude turpinās, taču paplašinātajā ģimenē ir konstatēta samazināta iespiešanās alēle, kas norāda, ka atkārtojums ir paplašinājies par vairāk nekā 60 atkārtotām vienībām vienā paaudzē (52. pacients). Rakstīšanas laikā nevienam ģimenē nebija nekādu Hantingtona slimības pazīmju, un vecākiem turpinās ģenētiskās konsultācijas un testēšana. Diviem bērniem, kas jaunāki par 5 gadiem, bija liels atkārtots ATXN7 paplašinājums, un viņiem bija sarežģīta daudzsistēmu slimība. Vienam no šiem bērniem (50. pacientam) viņu vecākiem bija gaitas problēmas 2 gadus pēc uzņemšanas 100 000 genomu projektā. Līdzīgi tika konstatēts, ka meitenei 10 gadus vecai ar intelektuālās attīstības traucējumiem 99-atkārtota ATXN2 paplašināšanās, neskatoties uz to, ka abi vecāki tika uzskatīti par neskartiem, un 18 gadus vecai meitenei ar demenci tika konstatēts { {19}}atkārtot paplašināšanu ATN1 (pielikums 33. lpp.).

Tika konstatēti pieci DMPK paplašināšanās (C panelis), tostarp bērnam un mātei ar klīnisku muskuļu distrofijas diagnozi, diviem brāļiem un māsām ar aizdomām par distālo miopātiju un pusaudzim ar iedzimtu miopātiju (54–58 pacienti). FMR1 paplašinājumi (D panelis) tika atklāti deviņiem zēniem un vienai meitenei, un trauslā X sindroma diagnoze pilnībā vai daļēji izskaidroja esošās klīniskās pazīmes (pacienti no 59 līdz 68).

Diskusija

Atkārtotu paplašināšanās traucējumu diagnoze veselības aprūpē ir sarežģīta neviendabīgu un pārklājošu klīnisko pazīmju un nespecifisku klīnisko atklājumu dēļ, kas var palielināties līdz ar vecumu un katrā nākamajā paaudzē. Atkārtotas paplašināšanās traucējumi ir vieni no biežākajiem iedzimto neiroloģisko slimību cēloņiem.4 Tomēr pacienti var būt nepietiekami diagnosticēti vai nu tāpēc, ka nav veikta pietiekama ģenētiskā pārbaude, vai arī tāpēc, ka vēl nav atklāti to izraisītie ģenētiskie varianti. Testēšanas pieejas pašlaik ir sadrumstalotas, un pacientiem var tikt pārbaudīts nepareizs atkārtotas izplešanās lokuss29 vai arī viņi var saņemt molekulāro testu citai variantu klasei, jo klīniskās pazīmes pārklājas ar citiem neiroloģiskiem ģenētiskiem traucējumiem.

Visa genoma sekvencēšana ir izmantota vairākos iestatījumos kā pirmās rindas diagnostikas tests retu neiroloģisku traucējumu gadījumā, taču iepriekš tika uzskatīts, ka tai ir zema spēja noteikt atkārtotus paplašinājumus.16 Ir izstrādāti vairāki rīki, lai identificētu atkārtotus paplašinājumus no visa genoma. sekvencēšana pētniecības vidē,31 taču neviena no šīm pieejām nav piemērota visa genoma sekvencēšanas datiem, kas savākti no liela skaita pacientu vienā veselības aprūpes dienestā. Mēs sniedzam pierādījumus tam, ka algoritms, kas izstrādāts, lai noteiktu atkārtotu paplašināšanos no visa genoma sekvencēšanas, var ticami novērtēt visbiežāk sastopamās slimības izraisošās atkārtotās paplašināšanās un atrisināt iepriekš ģenētiski nediagnosticētus gadījumus lielā pacientu grupā ar neiroloģiskiem traucējumiem. Mūsu rezultāti liecina, ka visa genoma sekvencēšana var atšķirt nepaplašinātas un paplašinātas alēles ar augstu jutību un specifiskumu 13 atkārtotos izplešanās lokusos (ko var vēl vairāk uzlabot, veicot vizuālu pārbaudi), var precīzi aprēķināt alēļu izmērus, kas ir mazāki par lasīšanas garumu. , un varētu nenovērtēt FMR1, DMPK, FXN un C9orf72 lielo paplašinājumu apjomu.

Kad atkārtotu paplašināšanos noteikšana ar visa genoma sekvencēšanu tika novērtēta pret pozitīviem un negatīviem rezultātiem, kas iepriekš iegūti klīniskās diagnostikas genoma laboratorijās, izmantojot zelta standarta metodes, mēs konstatējām vismaz 97,3 procentu jutīgumu un 99,6 procentu specifiskumu. Turklāt mēs parādījām, ka gan specifiku, gan jutīgumu var uzlabot, manuāli pārvaldot nolasīšanas kaudzi, ļaujot noteikt viltus pozitīvus rezultātus un pārklasificēt viltus negatīvās alēles paraugos ar bialēlisku izplešanos. No 6731 pacienta, kuram tika pārbaudīts FMR1 (D panelis), tika prognozēts, ka 124 izsaukumi tiks paplašināti. Mēs varējām izslēgt 97, veicot vizuālu pārbaudi, kā iespējamus viltus pozitīvus rezultātus. Tas norāda, ka 1 no 54 visa genoma sekvencēšanas testiem būtu FMR1 izsaukums, kas būtu vizuāli jāpārbauda, ​​lai atmestu iespējamo viltus pozitīvu izsaukumu. Turpinās darbs, lai uzlabotu ExpansionHunter genotipēšanas metodi, lai samazinātu FMR1 viltus pozitīvu izsaukumu skaitu.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 atkārtojumi) izraisa smagāku slimību un 36. tipa spinocerebellāro ataksiju (NOP56), kuras gadījumā izplešanās, kas lielākas par 650 atkārtojumiem, tiek uzskatītas par patogēnām, un atkārtojumu lielums 15–650 tiek uzskatīts par starpposmu un nenoteiktas nozīmes variantiem.

Ir identificēti vairāk nekā 40 atkārtotu izplešanās lokusu; daudzi no šiem lokusiem ir identificēti tikai nesen, un tagad tie ir saistīti ar iepriekš neizskaidrotiem stāvokļiem, tostarp smadzenīšu ataksiju ar neiropātiju un vestibulārās arefleksijas sindromu (RFC1) 32 un mioklonisko epilepsiju (SAMD12).33 Visizplatītākie neiroloģiskās slimības izraisošie atkārtotas ekspansijas loki bija atlasīti mūsu pētījumam, pamatojoties uz pozitīvo un negatīvo kontroles paraugu pieejamību.

Šeit sniegtie atklājumi liecina, ka ExpansionHunter jāspēj precīzi klasificēt neizvērstās un paplašinātās alēles jebkurā atkārtotas paplašināšanās lokusā, ja nepaplašinātās alēles ir mazākas par nolasīšanas garumu (ti, 150 bp). Lai gan lielākajai daļai atkārtotu izplešanās lokusu ir alēles, kas ir mazākas par 150 bp, ja tie nav paplašināti, dažiem lokusiem, kuru nepaplašinātās alēles izmērs ir tuvu 150 bp (piemēram, NOTCH2NLC)34, genotipēšana, izmantojot šo pieeju, varētu būt grūtāka. Lokusiem, kur paplašinātais atkārtojums ir ievērojami lielāks par lasīšanas garumu, visa genoma sekvencēšana var noteikt patogēnos izplešanos (piemēram, NOP56, 35 RFC120, 32). Jaunās ilgi lasāmās sekvencēšanas tehnoloģijas varētu piedāvāt papildu pieejas, nosakot lielus paplašinājumus.36

Novērtējot atkārtotu paplašināšanos, izmantojot visa genoma sekvencēšanu 11 631 nediagnosticētiem pacientiem, kuri tika pieņemti darbā 100 000 genomu projektā, tika iegūti 68 pacienti ar skaidrojošiem atklājumiem. Pacienti tika pieņemti darbā 100 000 genomu projektā pēc standarta aprūpes ģenētiskās pārbaudes; tāpēc šajā kohortā konstatētā atkārtoto izplešanās proporcija atspoguļo standarta NHS testēšanas diagnostikas rezultātu pieaugumu, kas ietver lokusa specifisku testēšanu atkārtotas paplašināšanās traucējumiem, piemēram, FXN vai DMPK. Jāatzīmē, ka par dažām diagnozēm nebija aizdomas, pamatojoties uz pacienta klīniskajām pazīmēm, tostarp sešiem pediatriskiem pacientiem, kuriem nebija zināma atkārtota paplašināšanās traucējumu ģimenes anamnēze. Vidējais atkārtotā paplašināšanās lielums, ko paredz visa genoma sekvencēšana šajā pētījumā aprakstītajiem pediatrijas pacientiem, ir ievērojami lielāki nekā vidēji pieaugušajiem, kas atbilst sagaidāmajam, ka lielāka paplašināšanās ir saistīta ar agrāku un smagāku sākumu, pat bērniem. Ir nepieciešams turpmāks darbs, taču šis atklājums liecina, ka no vecuma atkarīgs un no atkārtota lieluma atkarīgs patogenitātes novērtējums varētu atbalstīt pediatrijas diagnozi, samazinot iespējamo risku identificēt pieaugušo riska alēles, kā rezultātā tiek veikta nevēlama prognozēšana bērniem.

Mūsu atklājumi ļauj izveidot klīniskās diagnostikas darbplūsmu visa genoma sekvencēšanai (pielikums 23. lpp.). Mēs ierosinām vizuālu pārbaudi veikt visiem izsaukumiem, kas klasificēti kā paplašināti, lai noteiktu viltus pozitīvus rezultātus, un bialēliskajiem izplešanās gadījumiem, kuriem ir konstatēta tikai viena paplašināta alēle (piemēram, FXN). Mēs iesakām laboratorijām izmantot ExpansionHunter, lai novērtētu izplešanās esamību, neievērojot lieluma novērtējumu, un veiktu apstiprinošu PCR testēšanu kā testēšanas darbplūsmas standarta sastāvdaļu.

Retas iedzimtas slimības ietver plašu klīnisko pazīmju klāstu, padarot lokusa specifisko genoma testēšanu neefektīvu, grūtu un dārgu. Mēs sniedzam pierādījumus tam, ka klīniskas pakāpes visa genoma sekvencēšanu ar potenciālu diagnosticēt virkni retu neiroloģisko slimību, kas parasti izpaužas ar vienu bāzes, indel vai kopiju skaita variantiem, tagad varētu tikt paplašināta līdz atkārtotai paplašināšanai. Tā kā visa genoma sekvencēšana nodrošina vienu testu, kas var identificēt visbiežāk sastopamos atkārtotus paplašinājumus, kā arī ļauj vienlaikus pārbaudīt punktu mutācijas un kopiju skaita variantus gēnos, kas saistīti ar šiem stāvokļiem, tā piedāvā iespēju identificēt lielāko daļu pacientu ar šiem neviendabīgajiem traucējumiem. kuri nav diagnosticēti, izmantojot lokusa specifisku testēšanu. Šo traucējumu jauno terapiju laikmetā agrīna atklāšana varētu kļūt izšķiroša.37 Šie rezultāti atbalsta visa genoma sekvencēšanas ieviešanu, lai klīniskās diagnostikas laboratorijās noteiktu atkārtotu izplešanos. Šī pieeja jau ir iekļauta NHS Anglijas nacionālajā genomikā. Testu katalogs,38 nediagnosticētu retu neiroloģisku slimību izmeklēšanai.

Atsauces

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H u.c. Diagnostikas griesti eksomu sekvencēšanai smadzenīšu ataksijas un ar to saistīto neiroloģisku traucējumu gadījumā. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A u.c. Iedzimta spastiskā paraplēģija Grieķijā: iepriekš neizpētītas populācijas raksturojums, izmantojot nākamās paaudzes sekvencēšanu. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F u.c. Diagnostikas iznākums mērķtiecīgam nākamās paaudzes sekvencēšanas gēnu paneļam bērnu kustību traucējumiem: 3-gadu kohortas pētījums. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulsons H. Atkārtotas paplašināšanās slimības. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporal demence un/vai amiotrofiskā laterālā skleroze. Sietla, Vašingtona: Vašingtonas Universitāte, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellāra ataksija. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klīniskā neiroģenētika: autosomāli dominējoša spinocerebellāra ataksija. Neirol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Mugurkaula un sīpola muskuļu atrofija. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Sietla, Vašingtona: Vašingtonas Universitāte, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R u.c. Spinocerebellārās ataksijas 7. tipa letāla forma ar agrīnu sākumu bērnībā. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A u.c. Ataksīna-7 agregācija un ubikvitinācija infantilā SCA7 ar 180 CAG atkārtojumiem. Ann Neirol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. 2. tipa spinocerebellārā ataksija, kas bērnībā izpaužas ar kognitīvu regresiju. J Child Neirol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Bērnībā sākusies spinocerebellārā ataksija 3: mēles distonija kā agrīna izpausme. Tremor Cits hiperkinētisks Mov 2019; publicēts tiešsaistē 13. septembrī.

13 Bird TD. 1. tipa miotoniskā distrofija. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Sietla, Vašingtona: Vašingtonas Universitāte, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS un C9orf72 atkārtošanās paplašināšanās biežums SCA pacientiem, kas negatīvi attiecībā uz visbiežāk sastopamajiem SCA apakštipiem. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K u.c. Reto slimību pacientu visa genoma sekvencēšana valsts veselības sistēmā. Daba 2020; 583: 96–102.

16 Ešlija EA. Ceļā uz precīzo medicīnu. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY u.c. Visa genoma sekvencēšanas diagnostiskā un klīniskā lietderība nediagnosticētu ķīniešu ģimeņu grupā ar retām slimībām. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genome-wide landscape of tandem repeat expansions. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detecting expansions of tandēma atkārtojumus kohortās, kas sekvencētas ar īsi nolasāmiem secības datiem. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF u.c. Uz bioinformātiku balstīta paplašinātu atkārtojumu identifikācija: neatsauces introniskā pentamēra izplešanās RFC1 izraisa CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V u.c. Kopiju skaita varianti klīniskā genoma sekvencēšanā: izvietošana un interpretācija retu un nediagnosticētu slimību gadījumā. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM u.c. Genoma mēroga tandēma DNS atkārtojumu noteikšana, kas ir paplašināti autisma gadījumā. Daba 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Cilvēka fenotipa ontoloģija: rīks cilvēka iedzimtas slimības anotēšanai un analīzei. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomika Anglijā. Reto slimību stāvokļu klīnisko datu modeļi. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (aplūkots 2021. gada 4. augustā).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ u.c. Ilgu atkārtotu paplašināšanos noteikšana no visa genoma sekvences datiem, kas nesatur PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: uz secību diagrammu balstīts rīks, lai analizētu variācijas īsos tandēma atkārtošanās reģionos. Bioinformātika 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A u.c. Standarti un vadlīnijas nākamās paaudzes sekvencēšanas bioinformātikas cauruļvadu apstiprināšanai: Molekulārās patoloģijas asociācijas un Amerikas Patologu koledžas kopīgs ieteikums. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W u.c. Integratīvais genomikas skatītājs. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD u.c. Hantingtona slimībai līdzīgās prezentācijas fenotipiskā viendabība SCA17 ģimenē. Neiroloģija 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Hantingtona slimība, Hantingtona slimības līdzība un labdabīga iedzimta horeja: kas jauns? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Nesenie sasniegumi atkārtotu paplašinājumu noteikšanā ar īsu nākamās paaudzes secību. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sallivan R u.c. Introniskā atkārtojuma bialēliskā paplašināšanās RFC1 ir izplatīts vēlīnās ataksijas cēlonis. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J u.c. Introniskā TTTCA un TTTTA atkārtojumu paplašināšanās labdabīgas pieaugušo ģimenes miokloniskās epilepsijas gadījumā. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J u.c. Nekodēta CGG atkārtota paplašināšanās neironu intranukleārās iekļaušanas slimības, okulofaringodistālās miopātijas un pārklāšanās slimības gadījumā. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, DJ Szmulewicz, Pope K u.c. Ātra spinocerebellārās ataksijas 36 diagnostika trīs paaudžu ģimenē, izmantojot īsi nolasītus visa genoma sekvences datus. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-read sekvencēšana, kas parādās medicīnas ģenētikā. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Atkārtoti izplešanās traucējumi: mehānismi un terapija. Neiroterapija 2019; 16: 924–27.

38 Nacionālā veselības sistēma. Nacionālais genoma testu direktorijs: retu un iedzimtu slimību testēšanas kritēriji. 2021. gada oktobris.