[6] Gingerols veicina CXCL8 sekrēciju un ROS veidošanos cilvēka primārajos neitrofilos, mērķējot uz TRPV1 kanālu 1. daļa

1. Ievads

Pēdējos gados arvien lielāku interesi ir izraisījusi pārtikas sastāvdaļu identificēšana ar imūnmodulējošām īpašībām kopā ar to attiecīgajiem molekulārajiem mērķiem. Sakarā ar to lielo ligandu daudzveidību, pārejoša receptoru potenciālā jonu kanālu (TRP kanālu) virsģimene ir ļoti interesanta potenciālo mērķa struktūru klase.

Molekulārais mērķis ir noteikta molekula, uz kuru organismā iedarbojas zāles. Imunitāte attiecas uz ķermeņa spēju pretoties slimībām.

Pastāv cieša saikne starp molekulārajiem mērķiem un imunitāti. Zāļu iedarbība bieži ietekmē ķermeņa imunitāti. Piemēram, noteiktas zāles var ārstēt noteiktas hroniskas slimības, traucējot organisma imūnsistēmas darbību. Turklāt audzēju ārstēšanā bieži izmanto mērķtiecīgu terapiju, tas ir, mērķējot uz noteiktiem molekulāriem mērķiem, lai uzbruktu vēža šūnām, tādējādi uzlabojot imunitātes spēju cīnīties pret vēža šūnām.

Turklāt imunitātes stiprums ietekmēs arī zāļu iedarbību. Cilvēkiem ar novājinātu imūnsistēmu var rasties blakusparādības vai mazāk efektīvas zāles, ja tās lieto, jo imūnsistēma slikti absorbē zāles, kā rezultātā ārstēšana ir mazāk efektīva. Tāpēc veselīgas imūnsistēmas uzturēšana ir ļoti svarīga zāļu terapijai.

Noslēgumā jāsaka, ka pastāv cieša saikne starp molekulārajiem mērķiem un imunitāti, un pilnīgai šo attiecību izpratnei ir liela nozīme racionālā narkotiku lietošanā. Aktīvi jāuzlabo imunitāte, pareizi jālieto zāles pēc ārsta ieteikuma un jāuzlabo imunitāte ar mērķterapijas palīdzību, lai labāk aizsargātu savu veselību. No šī viedokļa mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var būtiski uzlabot imunitāti, jo Cistanche ir arī pretvīrusu un pretvēža iedarbība, kas var stiprināt imūnsistēmas spēju cīnīties un uzlabot organisma imunitāti.

Noklikšķiniet uz cistanche ieguvumiem veselībai

Zīdītāju TRP kanālu virsģimenē ietilpst sešas radniecīgas olbaltumvielu ģimenes, proti, ankirīnu (TRPA), kanonisko (TRPC), melastatīnu (TRPM), mukolipīnu (TRPML), policistīnu (TRPP) un vaniloīdu (TRPV) saimi. tiem visiem parasti ir seši transmembrānas segmenti, kas apvienojas kā tetramēri, veidojot katjonus caurlaidīgas poras ar atšķirīgu katjonu selektivitāti.[1] TRPV1 kanāls līdz šim var būt visintensīvāk pētītais TRP superģimenes loceklis. Sākotnēji TRPV1 tika identificēts kā kapsaicīna, čili piparu asās sastāvdaļas, receptors.[2] Vēlāk tika pierādīts, ka arī asās sastāvdaļas no ingvera, gingerols, aktivizē TRPV1.[3]

TRPV1 bioloģiskā loma neneironālo šūnu tipos joprojām tiek plaši pētīta, tomēr pieejamie rezultāti liecina par funkcijām, kas ir daudz plašākas par sensoro un termisko uztveri. Piemēram, 12-nedēļas iejaukšanās ar dienas devu 0,15 mg TRPV1 agonista nonivamīda, strukturāla kapsaicīna analoga, novērsa uztura izraisītu ķermeņa tauku masas pieaugumu un palielināja serotonīna līmeni plazmā. līmenis veseliem cilvēkiem ar lieko svaru.[4]

3T3-L1 adipocītos TRPV1 aktivācija ar nonivamīdu samazināja lipīdu uzkrāšanos diferenciācijas un nobriešanas laikā, nomācot PPAR𝛾 ekspresiju.[5] Makrofāgos kapsaicīns un nonivamīds no TRPV{10}}atkarīgā veidā mazināja LPS izraisītu pro-iekaisuma citokīnu, piemēram, IL6, CXCL8 un TNF-alfa, izdalīšanos.[6] Tomēr TRPV1 īpašās funkcijas cilvēka asins leikocītos joprojām ir neskaidras. Cilvēka NK šūnās 10 un 50 μM kapsaicīns izraisīja intracelulārā Ca2 plus koncentrācijas paaugstināšanos, norādot uz funkcionālu TRPV1 kanālu.[7]

Tomēr slāpētās NK šūnu efektoru funkcijas, piemēram, citotoksiskā degranulācija un citokīnu sekrēcija, ko izraisīja šūnu iepriekšēja apstrāde ar kapsaicīnu 1 stundu koncentrāciju diapazonā no 10–100 μM, lielā mērā bija neatkarīgas no TRPV1.[7] ] T šūnās tika dokumentēts, ka TRPV1 ir iesaistīts T šūnu receptoru signalizācijas, T šūnu proliferācijas un diferenciācijas procesos, kā arī citokīnu ražošanā.[8] Iepriekšējais mūsu grupas darbs arī parādīja TRPV1 funkcionālo ekspresiju cilvēka primārajās T šūnās.[9] Turklāt devas-atbildes analīzes koncentrācijās no 0,03 līdz 300 μmol L-1 atklāja, ka [6]-gingerols inhibē primāro cilvēka leikocītu citokīnu sekrēciju ar IC50 vērtību 82,2 μmol L-1.

Tomēr, kvantitatīvi nosakot [6]-gingerola plazmas paraugos veseliem indivīdiem, vidējā maksimālā koncentrācija plazmā bija tikai 42.0 ± 16,3 nmol L-1 pēc 1 l ingvera tējas uzņemšanas. Tā kā iepriekšējos pētījumos šīm [6] gingerola koncentrācijām nebija būtiskas ietekmes uz citokīnu sekrēciju,[9] nav skaidrs, vai pēc 1 l ingvera lietošanas asins plazmā tiek sasniegta ar uzturu saistītā koncentrācija 50 nmol L-1. tēja, ir pietiekama, lai modulētu šūnu imūnās atbildes reakcijas citos cilvēka primārajos leikocītos.

Cilvēka neitrofiliem zināšanas par TRPV1 funkcionālo lomu ir ierobežotas. Kamēr Köse un Nazıroglu˘ [10] uzrādīja Ca2 plus plūsmas neitrofilos, reaģējot uz 10 μM kapsaicīnu, ko samazina TRPV1 antagonists kapsazepīns, citi rezultāti neuzrādīja, ka kapsaicīns izraisītu Ca2 plus pieplūdumu, testējot koncentrācijas diapazonā 1 –100 μM, neskatoties uz nosakāmu TRPV1 RNS ekspresiju.[11]

Neitrofīli ir visizplatītākie leikocīti cilvēka asinīs, kas veido 60–70 procentus no visām cirkulējošajām baltajām asins šūnām. Tās ir pirmās imūnās šūnas, kas tiek pieņemtas darbā infekcijas vietās; tādēļ tās bieži dēvē par pirmo aizsardzības līniju[12]. Neitrofilu veidošanos, cita starpā, izraisa baktēriju vai mitohondriju atvasinātais peptīds N-formilmetionīna-leicil-fenilalanīns (fMLF) vai kemokīni, piemēram, CXCL8 (IL-8).[13]

Neitrofilu aizsardzības mehānismi ietver fagocitozi[14], pretmikrobu enzīmu izdalīšanos degranulācijas ceļā,[15] reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos[16] un neitrofilu ārpusšūnu slazdu veidošanos[17]. Papildus šiem tiešajiem aizsardzības mehānismiem neitrofīli vēl vairāk veicina turpmākās imūnās atbildes, izdalot dažādus citokīnus un kemokīnus.[18] Turklāt neitrofīli var tikt pakļauti sagatavošanas procesam, kas ļauj tiem spēcīgāk reaģēt uz turpmāku pilnīgu aktivāciju.[16b]

Pēdējos gados ir pieaudzis pierādījums tam, ka pārtikas un/vai ārstniecības augu sastāvdaļas var mainīt vienu vai vairākas no minētajām cilvēka neitrofilu aizsardzības reakcijām. Šīs modifikācijas ietver palielinātu fagocitotisko aktivitāti[19] un ROS veidošanos[20], pastiprinātu ķemotaksi pret fMLF[21] un neitrofilu ekstracelulāro slazdu veidošanos[20]. Tomēr aktīvais(-ie) savienojums(-i) netika identificēti. Ferula akitschkensis sastāvdaļas (𝛽-pinēns, sabinēns, 𝛾-terpinēns, geranilacetons un izobornilacetāts) desensibilizēja neitrofilus pret fMLF- un CXCL8- izraisītu Ca2 plus pieplūdumu un inhibēja fMLF, kur acetīns izraisīja ģeranilaksi. inducētos efektus izraisīja TRPV1.[22]

Pamatojoties uz pieejamajiem datiem, mēs izvirzījām hipotēzi, ka ligandu izraisīta TRPV1 aktivācija ar [6]-gingerolu var ietekmēt vispārējās neitrofilu funkcijas vai nu tieši, vai pastiprinot to reakciju uz aktivizējošiem stimuliem. Šīs hipotēzes ietvaros mēs īpaši centāmies noskaidrot, vai pārbaudīta uzturvērtības koncentrācija ir pietiekama, lai modulētu šūnu imūnās atbildes cilvēka primārajos neitrofilos, kas ir daļa no leikocītu populācijas. '

Turklāt mēs centāmies salīdzināt visu zīdītāju TRP superģimenes locekļu RNS ekspresijas līmeņus piecos no redzamākajiem šūnu tipiem cilvēka asinīs, lai iegūtu kvalitatīvi un kvantitatīvi visaptverošu pārskatu par TRP kanālu ekspresiju cilvēka leikocītos.

2. Rezultāti

2.1. TRP kanālu pārpilnība un relatīvie transkripta līmeņi cilvēka leikocītos

Lai novērtētu TRP kanāla RNS ekspresiju asins leikocītos, no veselu donoru asinīm tika izolēti pieci no redzamākajiem leikocītu šūnu tipiem, un TRP kanālu RNS ekspresija tika analizēta, izmantojot kvantitatīvu RT-PCR (1. attēls).

Konkrēti TRPV, kā arī TRPM saimes transkripti tika atklāti ar augstu frekvenci 75–100 procenti visos analizētajos šūnu veidos. Vidējais kopējais biežums, ņemot vērā visus šūnu tipus, bija 96 procenti TRPV saimei un 98 procenti TRPM saimei. TRPC specifiskie transkripti bija daudz mazāk izplatīti, sākot no 0 procentiem monocītos, NK šūnās, T šūnās un B šūnās līdz 100 procentiem NK šūnās un T šūnās ar kopējo vidējo biežumu tikai 53 procenti (1.A attēls). TRPC5-specifiskais transkripts tika konstatēts tikai neitrofilos ar biežumu 70 procenti.

Turklāt TRPA{0}}specifiskais transkripts kopumā atklāja diezgan zemu analizēto šūnu veidu skaitu ar 100 procentiem neitrofiliem, 25 procentiem monocītiem, 80 procentiem NK šūnām, 100 procentiem T šūnām un 60 procentiem. procenti B šūnās. Tāpat TRPML3-specifiskais transkripts uzrādīja zemu biežumu neitrofilos (50 procenti), monocītos (25 procenti), NK šūnās (40 procenti) un B šūnās (20 procenti), bet 100 procenti T šūnas. TRPV1-specifiskais transkripts tika atklāts visos šūnu veidos, uzrādot 100 procentu biežumu monocītos, NK šūnās un T šūnās un 90 procentu biežumu neitrofilos un 80 procentus B šūnās.

Attiecībā uz relatīvo RNS ekspresiju, salīdzinot ar attiecīgajām frekvencēm, TRP kanāli atklāja šūnu tipam raksturīgāku ekspresijas modeli, par ko liecina attiecīgo Δct vērtību salīdzinājums dažādos analizētajos šūnu tipos (1.B attēls). Piemēram, TRPP3 tika atklāts ar 100 procentu biežumu visos šūnu veidos, bet atklāja augstāko ekspresijas līmeni monocītos.

Turpretim TRPV2 kanāls tika atklāts visos pētītajos šūnu tipos ar salīdzinoši augstu RNS ekspresijas līmeni, kā arī augstu frekvenci. Tāpat TRPV1 transkripta līmeņi bija līdzīgi visos pārbaudītajos šūnu tipos (1B attēls).

2.2. TRPV1 virsmas ekspresija uz neitrofiliem

Pašreizējās zināšanas par TRPV1 funkciju cilvēka neitrofilos joprojām ir neskaidras. Lai turpinātu izpētīt TRPV1 lomu cilvēka neitrofilos, mēs pēc tam pētījām, vai TRPV1 kanāls tiek ekspresēts uz primāro cilvēka neitrofilu virsmas, izmantojot dzīvu šūnu plūsmas citometriju (2. attēls).

Izolētie neitrofīli tika iekrāsoti CD15 kā neitrofilu virsmas marķieris (2.A, B attēls) un vienlaikus tika iekrāsoti ar antivielu, kas radīta pret epitopu TRPV1 proteīna pirmajā ekstracelulārajā cilpā (2.B attēls), vai ar attiecīgo izotipa kontroli, pēdējais kalpo kā surogāts nespecifiskās saistīšanās mērīšanai (2.A attēls). CD15 plus populācijā tika analizēta FITC fluorescences intensitāte. Neitrofilu iekrāsošana ar TRPV1 antivielu radīja atšķirīgu fluorescences signālu salīdzinājumā ar izotipa kontroli, tādējādi apstiprinot TRPV1 virsmas ekspresiju primārajos cilvēka neitrofilos (2.C attēls). Analizējot neitrofilus no četriem atsevišķiem donoriem, atklājās salīdzināma TRPV1 virsmas ekspresija (attēls 2D).

2.3. [6] - Gingerola izraisīts intracelulārā Ca2 plus pieaugums

Tā kā ligandu izraisīta TRPV1 aktivācija izraisīs Ca2 plus pieplūdumu, [23] intracelulārā Ca2 plus neitrofilu koncentrācija tika noteikta, izmantojot Ca2 plus jutīgo krāsvielu Fura-2. Pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem atklājumiem,[9] tika izvēlēta labi zināmā TRPV1 liganda [6]-gingerola koncentrācija 50 nM un inkubācijas laiks 2 stundas. Analīzes parādīja, ka neitrofilu inkubācija ar 50 nM [6]-gingerolu palielināja intracelulāro Ca2 plus koncentrāciju, kas bija vidēji 18,4 procenti ± 1,0 procenti no maksimālās vērtības, kas noteikta, izmantojot 1 μM jonofora jonomicīna. DMSO izraisītais pieaugums bija 4,7 procenti ± 1,2 procenti (3. attēls).

2.4. [6]-Gingerol ietekme uz TRPV1 ekspresiju

Tālāk mēs centāmies analizēt TRPV1 stimulācijas ietekmi ar [6]-gingerolu uz TRPV1 ekspresiju transkripta līmenī, izmantojot q-RTPCR, kā arī virsmas proteīna līmenī, izmantojot dzīvu šūnu krāsošanu. Šim nolūkam cilvēka neitrofīli tika inkubēti ar 50 nM [6]-gingerolu 2 stundas, un attiecīgie ekspresijas līmeņi tika kvantificēti.

Šī 2 stundu inkubācija neietekmēja ne TRPV1 transkripta, ne proteīna līmeni (4. attēls), kā arī nemainījās, izņemot IL6, IL17A, IL24, C5 un GDF5, pētīto parasto citokīnu un ķemokīnu gēnu RNS ekspresiju (S1 attēls, tabula). S2, papildinformācija).

2.5. [6]-Gingerol ietekme uz neitrofilu virsmas marķieru ekspresiju

Šajā eksperimentu komplektā mēs jautājām, vai [6]-gingerolam ir ietekme uz kopējo neitrofilu virsmas marķieru ekspresiju. Mēs atklājām, ka marķieru CD11b un CD66b ekspresija palielinājās pēc 2 stundu inkubācijas perioda ar [6]-gingerolu, salīdzinot ar šķīdinātāja kontroli, turpretim CD62L netika ietekmēta (5. attēls). Turklāt fMLF receptora FPR1 virsmas ekspresija bija ievērojami paaugstināta pēc šūnu apstrādes ar 50 nM [6]-gingerolu, salīdzinot ar šķīdinātāja kontroli.

For more information:1950477648nn@gmail.com