Divvērtīgā dzīvā novājināta gripas vīrusa vakcīna aizsargā pret novirzītiem H1N2 un H3N2 klīniskajiem izolātiem cūku 1. daļā

Anotācija:

A gripas vīrusi (IAV) var izraisīt ļoti lipīgu elpceļu slimību daudzām zīdītāju sugām. Cūkām IAV izraisa augstu saslimstību un zemu mirstību uzņēmīgās populācijās, kurām var būt nozīmīga finansiāla un ražošanas ietekme. Tie var arī piedāvāt mutāciju un gēnu pārkārtošanas iespējas, radot gripas celmus ar pandēmijas potenciālu. Tāpēc ir ļoti svarīgi novērst un kontrolēt cūku gripas infekciju, un galvenais veids, kā to izdarīt, ir vakcinācija.

A gripas vīruss ir izplatīta elpceļu infekcijas slimība, kas ir ļoti lipīga un ir uzņēmīga pret plašu cilvēku loku. Īpaši cilvēkiem ar novājinātu imūnsistēmu A gripas vīrusi var izraisīt nopietnākas veselības problēmas. Tāpēc ir ļoti svarīgi saglabāt pietiekamu imunitāti, lai novērstu A gripas vīrusa infekciju.

Mūsu ķermeņa imūnsistēma ir pirmā aizsardzības līnija pret vīrusu un baktēriju iekļūšanu organismā. Imūnsistēmas pamatfunkcija ir pretoties patogēnu invāzijai caur baltajām asins šūnām, limfocītiem un antivielām, lai uzturētu ķermeņa veselību. Tāpēc laba imūnsistēma ir svarīgs aizsardzības pasākums, lai pasargātu mūs no dažādām infekcijas slimībām.

Tajā pašā laikā daži veselīgas dzīves paradumi var arī palīdzēt stiprināt imunitāti. Piemēram, pietiekama miega uzturēšana, mērena fiziskā slodze, sabalansēts uzturs, stresa mazināšana utt. Šie dzīves paradumi var veicināt hormonu un imūnfaktoru veidošanos organismā, padarot mūsu imūnsistēmu stiprāku.

Papildus pozitīvajām darbībām jūs varat arī palielināt ķermeņa imunitāti, vakcinējoties. Šobrīd ir pieejama vakcīna pret A gripas vīrusu, kas var efektīvi novērst gripas vīrusa infekciju un samazināt saslimšanas risku ar vakcinācijas palīdzību. Īpaši jutīgām grupām, piemēram, vecāka gadagājuma cilvēkiem, bērniem un grūtniecēm, lielāka uzmanība jāpievērš vakcinācijai.

Jāņem vērā, ka mūsu ķermeņa imunitāte nav statiska, bet gan mainās atkarībā no tādiem faktoriem kā vecums un vide. Tāpēc mums vienmēr ir jāpievērš uzmanība un jāpielāgo savs dzīvesveids, lai saglabātu labu imunitāti.

Rezumējot, adekvāta imunitāte ir svarīgs līdzeklis, lai novērstu A gripas vīrusa infekciju. Pielāgojot veselības režīmus, piemēram, miegu, vingrinājumus un diētu, kā arī vakcinējot, mēs varam padarīt savu ķermeni veselīgāku un izturīgāku pret vīrusu uzbrukumiem. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var ievērojami uzlabot imunitāti. Gaļā esošie polisaharīdi var regulēt cilvēka imūnsistēmas imūnreakciju, uzlabot imūnsistēmu stresa spēju un pastiprināt imūnšūnu baktericīdo iedarbību.

Click cistanche tubulosa priekšrocības

Visā pasaulē cūkām visizplatītākie IAV apakštipi ir H1N1, H1N2 un H3N2; tomēr šo vīrusu ģenētiskā daudzveidība dažādos reģionos var ievērojami atšķirties. Mēs iepriekš izstrādājām no elastāzes atkarīgu bivalentu dzīvu novājinātu vakcīnu, izmantojot divus Kanādas cūku gripas A vīrusa (swIAV) izolātus A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] un A/Swine/Saskatchewan/SD0069/202. ) [SD69], kas aizsargāja pret homologiem celmiem. Šajā pētījumā mēs parādām, ka šī vakcīna paplašina aizsardzību cūkām līdz aktuālākiem, nehomoloģiskiem H1N2 un H3N2 celmiem, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] un A/Swine/AB/SD0435/. 2019 (H3N2) [SD435].

Vakcīna izraisīja spēcīgu imūnreakciju serumā un plaušās un samazināja vīrusu replikāciju, kā arī plaušu patoloģiju, kas saistīta ar šiem celmiem. Tāpēc šī divvērtīgā vakcīna joprojām ir spēcīgs kandidāts, kas būtu izdevīgs cūku gripas vakcīnu tirgum Ziemeļamerikā.

Atslēgvārdi:

Gripa; vakcīna; cūkas.

1. Ievads

A gripas vīrusi (IAV) ir nozīmīgs patogēns daudzām sugām, tostarp cūkām. Infekcija var izraisīt ļoti lipīgas elpceļu slimības cūkām [1]. Cūku gripas infekcija izraisa vieglu slimību ar ļoti zemu mirstību, bet saslimstības rādītāji ganāmpulkā var sasniegt 100 procentus [2].

Tas rada ekonomiskus zaudējumus lauksaimniekiem, jo ​​samazināts inficēto cūku svara pieaugums, samazināts ražošanas sniegums un sivēnmāšu reproduktīvā neveiksme [3,4].

Gripas vienlaicīga inficēšanās ar citiem cūku elpceļu patogēniem var izraisīt arī cūku elpceļu slimību kompleksa attīstību un līdz ar to palielināt mirstību un ekonomiskus zaudējumus [5].

Turklāt cūkas ir uzņēmīgas pret infekciju ar putnu un cilvēku IAV, kā arī cūku IAV (swIAV), jo to elpceļos ir gan putnu, gan zīdītāju sialskābes galaktozes saites [6].

Tas ļauj veikt atkārtotu sortimentu, ja tie ir vienlaikus inficēti ar vairākiem celmiem, kas var izraisīt jaunu celmu veidošanos ar pandēmijas potenciālu [4,7]. Tā kā cilvēkiem ir līdzīgs sialskābes galaktozes saišu sadalījums visā elpceļā, starp cilvēkiem un cūkām ir iespējama divvirzienu izplatīšanās.

Pirmā zināmā parādība bija 1918. gada gripas pandēmijas laikā, kad IAV tika ievests cūkām no cilvēkiem [8]. Šī izcelsme saglabājās stabila cūku populācijās līdz 90. gadiem, kad cilvēku un putnu H3N2 celmi pārkārtojās ar cirkulējošo H1N1 celmu, lai iegūtu dubultās un trīskāršās H1N1, H1N2 un H3N2 apakštipu reassortantus [8,9].

Jaunizveidotā trīskāršā reassortanta gēna (TRIG) kasete izraisīja strauju IAV dažādošanas periodu Ziemeļamerikas cūkām [10]. Šī TRIG kasete ir ļoti stabila un atvieglo dažādu HA un NA kombināciju aizstāšanu [5].

Kopš 2005. gada daudzi celmi ar šo iekšējo TRIG kaseti, kas savienoti pārī ar cilvēka HA un NA gēniem, ir izplatījušies cūku ganāmpulkos ASV [9]. Nākamais ievērojamais izplatības notikums notika 2009. gadā, kad cūku izcelsmes H1N1 celms (H1N1pdm2009) izplatījās uz cilvēkiem, izraisot 2009. gada gripas pandēmiju [11]. Cilvēka pandēmijas H1N1 IAV (H1pdm) pārnešana no cilvēka uz cūku (reversā zoonoze) tika reģistrēta vairākas reizes Ziemeļamerikas cūkām, kā rezultātā tika izveidota jauna ciltsraksts un jauni reasortanti swIAV [8, 10, 12].
Kopumā Ziemeļamerikas cūkām ir reģistrētas septiņas antigēniski atšķirīgas H1 klades un četras atšķirīgas H3 vīrusu klades [5]. Nesen swIAV uzraudzības programma Āzijā identificēja dominējošo Eirāzijas putnu tipa (EA) reassortant genotipa 4 (G4) vīrusu ar H1pdm un trīskāršiem reassortantiem iekšējiem gēniem.

Šis G4 vīruss tika izmērīts 10,4 procentiem pārbaudīto cūku strādnieku, un tas uzrāda pandēmijas potenciāla marķierus ar spēju pārnest uz cilvēkiem un atšķirīgu antigenitāti nekā pašlaik cirkulējošie cilvēka vīrusi [7]. Tāpēc ir ļoti svarīgi novērst un kontrolēt gripas infekciju cūkām gan no cūkkopības nozares, gan sabiedrības veselības viedokļa, un galvenais veids, kā to izdarīt, ir vakcinācija [4].

ASV visizplatītākais vakcīnas veids ir visa inaktivētais vīruss (WIV), bet ir apstiprināta arī RNS vektora vakcīna, kas ekspresē HA, un NS1-atīsināta dzīvā novājināta gripas vīrusa vakcīna (LAIV) [4] . Visā pasaulē, tostarp Ziemeļamerikā, cūkām visizplatītākie IAV apakštipi ir H1N1, H1N2 un H3N2 [13].

Tomēr šo vīrusu ģenētiskā daudzveidība var ievērojami atšķirties atkarībā no reģiona, un Kanādā un ASV pastāv atšķirības swIAV ģenētiskajā evolūcijā, īpaši H1 apakštipa vīrusos [12]. Novērošana Kanādā laikā no 2009. līdz 2016. gadam liecināja, ka H1 ģenētiskās klades, kas dominēja ASV, H1g (1A.3.3.3) un H1d-1 (1B.2.2), Kanādā netika atklātas, un H1 vīrusi Kanādā ļoti atšķīrās no ASV vīrusiem [12].

Kanādā tika identificēta jauna H1 klade (H1a-3), kas sākās Manitobā un piedzīvoja strauju izaugsmi, pirms izplatījās visā valstī un ASV. Attiecībā uz H3 vīrusiem sešas H3 līnijas tika dokumentētas Amerikas cūkām (IV-A līdz IV-F), un trīs no tām tika konstatētas Kanādas cūkām (IV-B, IV-C un IV-E) [12]. ].

Tas uzsver reģionālās uzraudzības un izpratnes par cirkulējošo celmu nozīmi, lai informētu par efektīvām vakcīnu programmām, un norāda, ka vakcīnas, kas izstrādātas, pamatojoties uz IAV, kas cirkulē Amerikas cūkās, var neaizsargāt Kanādas cūkas [12].

Iepriekš bivalentā vakcīna tika izveidota, izmantojot divus Kanādas swIAV izolātus A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] un A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), kas ir H{{ pārstāvji. 9}} antigēnu grupa un jauna H3 antigēnu grupa no Rietumkanādas (cūku kopa IV-E), attiecīgi [14]. Šī jaunā vakcīna ir dzīva novājināta vīrusa vakcīna, kas izgatavota, izmantojot no elastāzes atkarīgās SD191 un SD69, SD191−R342V un SD69-K345V formas. Pētījumi parādīja, ka tas aizsargā gan pret SD191, gan SD69, kā arī pret heterologu H1N2 celmu A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2), kas arī tika izolēts no Rietumkanādas [14].

Kopš tā laika cirkulējošie swIAV celmi ir turpinājuši dreifēt. Jaunākie klīniskie izolāti no cūkām Rietumu Kanādā tika savākti un izolēti no lauka paraugiem Rietumu veterinārmedicīnas koledžā, Saskačevanas Universitātē, Saskatūnā, SK, Kanādā. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] ir H -3 antigēnu grupas loceklis, bet tajā ir piecas aminoskābju aizstāšanas no 54 galvenajām H1 antigēnu vietām, salīdzinot ar SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] ir IV-E klastera loceklis, taču ir novirzījies, iekļaujot divas aminoskābju aizvietošanas no sešām galvenajām H3 antigēnu vietām [17].

Šajā pētījumā mēs novērtējām, vai divvērtīgais elastāzes atkarīgais LAIV izturēsies pret jauniem klīniskiem izolātiem, un varam ziņot, ka tas aizsargāja cūkas, kad tās tika pakļautas pašlaik cirkulējošajiem swIAV celmiem SD467 (H1N2) un SD435 (H3N2).
2. Materiāli un metodes

2.1. Šūnas un vīrusi

Madin-Darby suņu nieres (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) šūnas tika uzturētas minimālajā būtiskajā barotnē (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, Sentluisa, MO, ASV), kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma. (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Otava, ON, Kanāda 16000-044), un tika turēti mitrinātā 5% CO2 inkubatorā 37 ◦C temperatūrā. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] un A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV tika izolēti no lauka paraugiem Rietumu veterinārmedicīnas koledžā, Saskačevanas Universitātē, Saskatūnā. , SK, Kanāda.

Vakcīnas vīrusi SD191-R342V un SD69- K345V tika izglābti, kā aprakstīts iepriekš [14]. Visi vīrusi tika audzēti MDCK šūnās 0,2 procentu liellopu seruma albumīna (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) klātbūtnē ar vai nu 1 µg/ml L-[(toluola{) {11}}sulfonamīds)-2-fenil]etilhlormetilketons (TPCK)-tripsīns (WT vīrusi) vai 0,5 µg/ml cilvēka neitrofilo elastāzes (no elastāzes atkarīgi vīrusi) (Sigma-Aldrich, E8140).

2.2. Dzīvnieku izmēģinājumu dizains

Divdesmit četras četras nedēļas vecas swIAV negatīvas cūkas tika iegūtas no Prairie Swine Center Inc. (Saskatoon, SK, Kanāda). Šīs cūkas tika nejauši atlasītas un sadalītas četrās grupās ar septiņām cūkām katrā vakcinētajā grupā un piecām cūkām katrā imitācijas vakcinētajā grupā.

Grupas piešķiršana ir aprakstīta 1.A attēlā.

Šīs grupas tika izmitinātas atsevišķās telpās, pamatojoties uz vakcinācijas grupām (grupas A plus B un C un D tika izmitinātas kopā), un tām ļāva aklimatizēties septiņas dienas pirms inficēšanās. Piecu nedēļu vecumā (diena 0), kā arī astoņu nedēļu vecumā (21. diena) A un B grupas cūkas tika intratraheāli vakcinētas ar 4 ml MEM, savukārt C un D grupas cūkas tika vakcinētas. ar bivalentu vakcīnu, kas satur 1 × 106 PFU katra SD191-R342V un SD69-K345V 4 ml MEM.

Desmit dienas vēlāk (31. diena) cūkas tika inficētas ar MEM (izspēles) vai 1 × 106 PFU SD435-WT (H3N2) vai SD467-WT (H1N2). Cūkas tika uzraudzītas piecas dienas pēc inficēšanās, katru dienu mērot rektālo temperatūru un 1., 3. un 5. dienā no abām nāsīm paņēma deguna uztriepes. Serums tika savākts pēc pirmās (20. diena) un otrās (30. diena) vakcinācijas. seruma vīrusa neitralizācijas (SVN) tests un ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests (ELISA).

5. dienā pēc inficēšanās visas cūkas tika humāni eitanāzijas, plaušas tika ekstrahētas un novērtētas, vai tajās nav swIAV raksturīgu rupju bojājumu. Tika savākti arī plaušu audu paraugi vīrusa izolācijai (1.B attēls).

2.3. Ētikas paziņojums

Visas dzīvnieku procedūras apstiprināja Saskačevanas Universitātes Universitātes dzīvnieku kopšanas komiteja (UACC) un Dzīvnieku pētniecības ētikas padome (AREB). Šis protokols tika apstiprināts 2021. gada 12. novembrī (Dzīvnieku lietošanas protokols Nr. 20190064). Visas procedūras tika veiktas saskaņā ar standartiem, ko pieprasa Kanādas Dzīvnieku aprūpes padome (CCAC) Vakcīnu un infekcijas slimību organizācijā (VIDO), Saskačevanas Universitātē, Saskatūnā, SK, Kanādā.

2.4. Paraugu ņemšana

Deguna uztriepes no katras nāsis tika ievietotas 1 ml MEM, kas satur 1x antibiotiku pretsēnīšu līdzekli (Thermo Fisher Scientific, Otava, ON, Kanāda, 15240-062) un sasaldēja -80 ◦ C temperatūrā, līdz tika veikta qRT-PCR. Visas cūkas humāni eitanāzēja, intravenozi ievadot etanolu (240 mg/ml nātrija pentobarbitāla; 2 ml uz 4,5 kg). Pēc eitanāzijas plaušas tika izņemtas kopumā, lai noteiktu purpursarkano, stingru bojājumu procentuālo daudzumu, kā arī pneimoniju.

Procenti tika noteikti, pamatojoties uz plaušu daivas svaru, kā arī visu plaušu tilpumu [18]. Vīrusu titrēšanai tika ņemti arī plaušu paraugi no labās apikālās, sirds un diafragmas daivas. Šie plaušu paraugi titrēšanai tika sajaukti vienādos tilpumos 10% w/v MEM, kas satur 1x antibiotiku-pretsēnīšu līdzekli.

1. attēls. Cūku grupēšana un izmēģinājuma plāns, lai novērtētu divvērtīgā LAIV aizsardzības efektivitāti pret jauniem klīniskiem izolātiem. Cūkas (n=5 MEM/MEM grupām un n=7 divvērtīgām/divvērtīgām grupām) tika intratraheāli vakcinētas ar 4 ml MEM vai divvērtīgo vakcīnu, kas sastāv no 1 × 106 PFU. no katra SD191−R342V un SD69-K345V 0. un 21. dienā.

31. dienā cūkas tika intratraheāli inficētas ar MEM vai 1 × 106 PFU SD435 (H3N2) vai SD467 (H1N2). (A) Imunizācijas, provokācijas un paraugu ņemšanas grafiks šim izmēģinājumam ar dzīvniekiem. Divdesmit četrām četras nedēļas vecām swIAV negatīvām cūkām tika atļauts aklimatizēties septiņas dienas pirms inficēšanās. Piecu nedēļu vecumā (0. diena), kā arī astoņu nedēļu vecumā (21. diena) A un B grupas cūkas intratraheāli tika vakcinētas ar 4 ml MEM, savukārt C un D grupas cūkas tika vakcinētas ar divvērtīgo vakcīnu. kas satur 1 × 106 PFU katra SD191−R342V un SD69-K345V 4 ml MEM.

Desmit dienas vēlāk (31. diena) cūkas tika inficētas ar MEM (izspēles) vai 1 × 106 PFU SD435-WT (H3N2) vai SD467-WT (H1N2). Cūkas tika uzraudzītas piecas dienas pēc inficēšanās, katru dienu mērot rektālo temperatūru un 1., 3. un 5. dienā no abām nāsīm paņēma deguna uztriepes.

Serums tika savākts pēc pirmās (20. diena) un otrās (30. diena) vakcinācijas. 5. dienā pēc inficēšanās (36. diena) visas cūkas tika humāni eitanāzētas, un plaušas tika ekstrahētas novērtēšanai. (B) Izveidots ar BioRender.com.

For more information:1950477648nn@gmail.com