Homozigots Dab1−// ir potenciāls jauns cēlonis autosomāli recesīvām iedzimtām peļu nieru un urīnceļu anomālijām
Feb 28, 2022
Ievads
Yotari mutantu pelēm, kas iegūtas, spontāni iegūstot mutāciju Dab1 gēnā, ir histoloģiskas novirzes centrālajā nervu sistēmā [1,2], kas ir ļoti līdzīgas reeler (reelin//) pelēm, kas liecina, ka reelīns un DAB1 pieder tas pats signalizācijas ceļš [1–4]. Ir ziņots, ka aberācijas reelīna / DAB1 ceļā ir saistītas ar dažādiem psihiskiem traucējumiem [5–7]. Interesanti, ka papildus centrālajai nervu sistēmai DAB1 un reelīna proteīnu klātbūtne ir apstiprināta arī perifērajā nervu sistēmā un dažos ārpusdzemdes audos. DAB1 klātbūtne ir konstatēta peles podocītos [8] un cilvēka auglimnieres[9], savukārt ir ziņots par reelīna ekspresiju peles un cilvēka augļa attīstības laikā, kā arī dažās endotēlija šūnās gar asinsvadiem pieaugušai pelei [9–11]. Kanoniskais reelīna / DAB1 ceļš var izraisīt atšķirīgus pakārtotus proteīnus, tostarp NOTCH2 receptorus, kuriem ir izšķiroša loma šūnu likteņa lēmumos un diferenciācijā.nieresattīstība [12–14]. NOTCH2 receptori ir nepieciešami, lai veidotu proksimālos kanāliņus un podocītus [13], bet, tiklīdz ir sasniegts nefronu nobriešana, šis ceļš lielākoties tiek apklusināts [15]. Akūtos apstākļosnieru slimības,palielināta NOTCH2 ekspresija var potenciāli veicināt reģenerāciju, savukārt ilgstoša ekspresija ir cēloņsakarībā saistīta ar intersticiālu fibrozi un glomerulosklerozi [15]. NOTCH signalizācijas pazemināšana var ievērojami samazināt autofagiju un izraisīt podocītu diferenciācijas traucējumus attīstības laikā [16].
Līdz ar to disfunkcionāliem podocītiem ir izšķiroša nozīme glomerulārās slimībās, īpaši cilvēka idiopātiskā nefrotiskā sindroma gadījumā [17,18] un minimālu izmaiņu nefrotiskā sindromā (MCNS) [19]. Tādējādi autofagija uztur šūnu homeostāzi normālos fizioloģiskos apstākļos, savukārt patoloģiskos apstākļos tā var progresēt līdz autofagiskajai nāvei [20]. Plaši izmantots autofagijas biomarķieris ir LC3B, autofagosomu membrānu strukturāls proteīns [21]. Sarežģīta šķērsruna starp autofagiju un apoptozi arī veicina homeostatiskā līdzsvara saglabāšanu, reaģējot uz šūnas mikrovidi. Ir labi zināms, ka laikā palielinās apoptotisko notikumu skaitsnieresattīstība [22] un ievērojami samazinās, kad nobriešana ir beigusies, izņemot nosacījumusnieru bojājums[23]. Nenoliedzami, apoptoze ir sarežģīts mehānisms, ko regulē vairāku ceļu mijiedarbība, bet lielākoties beidzas ar kaspāzes3 (CASP3) aktivāciju, kuras aktivizēšana ir viens no visbiežāk izmantotajiem marķieriem apoptozes noteikšanai [23].
Šajā ziņojumā mēs centāmies analizēt, kā Dab1 gēnu funkcionālā klusēšana ietekmēnieresreelīna, NOTCH2, LC3B un šķelto CASP3 proteīnu morfoloģija un ekspresija un lokalizācija pēcdzemdību pelēmnieres. Mēs pieņemam, ka šie proteīni tiek ekspresēti pēcdzemdību pelēnieres,un to funkcionālā mijiedarbība veicina to struktūras un funkcijas saglabāšanu. Turklāt, tā kā DAB1 klātbūtne ir apstiprināta cilvēka augļa laikānieresattīstību [9], varētu pieņemt, ka tā inaktivācija var izraisīt traucējumus plašā iedzimtu anomāliju spektrā.nieresun urīnceļi (CAKUT).
Atslēgvārdi:yotari; nieru darbība; pēcdzemdību nieru attīstība; imunofluorescences krāsošana; transmisijas elektronu mikroskopija
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
Materiāli un metodes
Paraugu kolekcijaKā Dab1 nulles parastos mutantus mēs izmantojām yotari (Dab1/ ) peles, kuras iepriekš aprakstīja Howell et al. [24]. Peļu genotipēšanai izmantotie PCR primeri bija yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT un CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, Dab1 lokusa savvaļas tipa: GCCCTTCAGCATCACCATGCT un CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. C57BL/6 N peles tika audzētas un grupās izmitinātas standarta polikarbonāta būros (ieskaitot vismaz vienu no katra genotipa) ar ad libitum piekļuvi pārtikai un ūdenim kontrolētā (23 ± 2 ◦C) telpā ar 12 stundu gaismu/ tumšs cikls. 4., 11. un 14. pēcdzemdību dienā (P4, P11 un P14) peles tika dziļi anestēzētas ar pentobarbitālu un 10 minūti transkardiāli perfūzētas ar fosfāta buferšķīdumu (PBS, pH 7,2) un 4% paraformaldehīdu (PFA). ) 0,1 M PBS.Nierestika noņemti un fiksēti ar 4% PFA 0.1 M PBS uz nakti parastajām histoloģiskajām analīzēm (hematoksilīna-eozīna (H&E), imūnhistoķīmiskas un imūnfluorescences krāsošanas) un 2% PFA plus 2,5% glutaraldehīda (GA) maisījumā. pārbaudei ar elektronu mikroskopu. Pēc fiksācijas audi tika sagatavoti turpmākai histoloģiskai izmeklēšanai, kā mēs aprakstījām iepriekš [25, 26].
Imunofluorescences un imūnoperoksidāzes krāsošanaPēc deparafifinēšanas un rehidratācijas sekcijas tika karsētas 20 minūtes 0,01 M citrāta buferšķīdumā (pH 6,0) ūdens tvaicēšanas katlā un pēc tam atdzesētas līdz istabas temperatūrai. Bloķējošs buferis (ab 64226, Abcam, Kembridža, Lielbritānija) tika uzklāts 30 minūtes, lai izslēgtu nespecifisku krāsošanu. Pēc tam sekcijas nakti inkubēja mitruma kamerā ar primārajām antivielām (1. Pēc mazgāšanas PBS vienu stundu tika uzklātas sekundārās antivielas (1. tabula) un vēlreiz mazgātas PBS. Pēc tam kodoli 2 minūtes tika iekrāsoti ar 4060 -diamidino-2-fenilindolu (DAPI), mazgāti PBS un pārklāti ar vāku. Mēs veicām preadsorbcijas testu tā, lai katra primārā antiviela tiktu izmantota ar atbilstošo peptīdu un sekcijām tiktu piemērota to kombinācija. Rezultāti neuzrādīja antivielu iekrāsošanos. Turklāt tika veiktas kontroles, izlaižot primāro antivielu, lai noteiktu sekundāro antivielu nespecifiskās saistīšanās līmeni.
Imūnoperoksidāzes krāsošanai trušu poliklonālo anti-CASP3 (1:100 atšķaidījumi, ab13847, Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) uzklāja kā primāro antivielu vienu stundu mitruma kamerā pēc sekcijas apstrādes ar 0,1 procenti H2O2. Pēc mazgāšanas PBS tika veikta sekundārā noteikšana, izmantojot saiti un streptavidīna peroksidāzi, katru piecpadsmit minūtes (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) un diaminobenzidīnu (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), rūpīgi kontrolējot, lai izvairītos no fona pārslodzes. Kodolus iekrāsoja ar hematoksilīnu, 10 minūtes skaloja krāna ūdenī, īslaicīgi dehidrēja augošā etanola šķīdumu sērijā un pārklāja.
Audu sagatavošana transmisijas elektronu mikroskopam (TEM)Pēc fiksācijas ar 2% PFA un 2,5% GA maisījumu 0,1 M PBS 2 stundas, paraugus mazgā ar PBS un 2 stundas pēcfiksēja 2% osmija tetroksīda ūdens šķīdumā. Visi paraugi tika divreiz mazgāti PBS, dehidrēti augošā etanolā un iestrādāti Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Sērijas sekcijas (70 nm biezumā) tika sagrieztas ar Ultracut UCT ultramikrotomu (Leica Microsystems, Wetzlar, Vācija) un iekrāsotas ar 1% uranilacetātu un svina citrātu.
Datu iegūšana un analīzeAnalīze tika veikta ar epifluorescences mikroskopu (Olympus BX51, Tokija, Japāna), kas aprīkots ar DP71 digitālo kameru (Olympus), JEM 1400 transmisijas elektronu mikroskopu (JEOL, Tokija, Japāna), kas darbojās ar 80 kV un fotografēja ar JEOL lādiņu. savienotās ierīces (CCD) kameru sistēma (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, ASV) un, visbeidzot, spilgta lauka mikroskops (BX40, Olympus, Tokija, Japāna). Visi analizētie attēli tika apstrādāti ar ImageJ programmatūru un Adobe Photoshop (Adobe, Sanhosē, CA, ASV). Katrā pārbaudītajā grupā mēs izmantojām trīs līdz četrus dzīvniekus. Visi savāktinierestika sagriezti 5 µm biezās daļās un maksimālinieres length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, kas norāda uz izcilu vienošanos [27].
Statistiskā analīzeTika veikts divpusējs t tests, lai analizētu atšķirības starp savvaļas tipa un yotari dzīvnieku PCT, DCT un G vidējo diametru. Diametrs tika parādīts kā vidējā ± standarta novirze (SD). Nozīmīguma līmenis tika iestatīts uz p < 0.05.="" lai="" pārbaudītu="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālās="" atšķirības="" starp="" pct,="" dct="" un="" glomeruliem="" visos="" laika="" punktos,="" tika="" izmantots="" divvirzienu="" anova="" tests,="" kam="" sekoja="" tukey="" vairāku="" salīdzināšanas="" tests.="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" tika="" izteikts="" kā="" vidējā="" ±="" vidējā="" standarta="" kļūda="" (sem).="" nozīmīguma="" līmenis="" tika="" noteikts="" uz="" p="">< 0,05.="" analīze="" tika="" veikta="" graphpad="" programmatūrā="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Rezultāti
Hematoksilīna-eozīna krāsošana (H&E) un nieru diametra mērīšanaH&E krāsojums vidussagitālajām sekcijāmnieresvisos pārbaudītajos laika punktos izceļ mazonieresyotari peļu fenotips salīdzinājumā ar savvaļas tipu (1.a attēls). Pie 4P vidējaisnieresyotari dzīvnieku diametrs bija aptuveni 55 µm nekā aptuveni 75 µm. Turklāt šī atšķirība bija pamanāma vēlākos laika punktos lēnākas izaugsmes dēļnieresyotari, salīdzinot ar progresīvo izaugsminieressavvaļas dzīvniekiem. Lai noteiktu, vai samazinājums kopumānieresizmēru izraisīja nefrona segmenta izmēra samazināšanās, mēs aprēķinājām PCT, DCT un G vidējo diametru katrai grupai. Patiešām, yotari grupā bija samazinājies vidējais diametrs G, PCT un DCT, salīdzinot ar savvaļas tipu (1.b attēls, p < 0,05).="" turklāt="" h&e="" krāsošana="" atklāja="" plānāku="" garozu="">nieruiegurņa pagarinājums yotari dzīvniekiem un nedaudz difūzi paplašināts DCT pie 14P. Glomerulārās nobriešanas pamatstruktūra un modelis ir vienāds abās pārbaudītajās dzīvnieku grupās.
Aprakstošā histoloģiskā analīze, pamatojoties uz TEM mikrofotogrāfijāmUz mikrofotogrāfijām iegūti ar TEM, savvaļas tipa peļu glomerulos bija tipisks visu fifiltrācijas barjeras daļu izskats, kas parasti bija attīstītas un atpazīstamas (2.a attēls). Podocīti, podocītu pēdas procesi un pedikuli, fifiltrācijas spraugas, glomerulārās bazālās membrānas un kapilāra lūmenis ar fenestrēto endotēliju bija viegli atšķirami (2.a attēls). No otras puses, yotari peļu glomerulos varēja novērot progresējošus podocītu bojājumus ar pēdas procesa izsvīdumu un fifiltrācijas spraugu trūkumu (2.b – d attēls). Šīs ultrastrukturālās izmaiņas tika novērotas visāsnieresizmeklēja un iesaistīja lielāko daļu izmeklēto glomerulu. Yotari peļu PCT vai DCT netika pamanītas nekādas novirzes nekā savvaļas tipa dzīvniekiem (2.e – h attēls). PCT šūnu saskarnes tika definētas slikti, jo bija neregulāras šūnu membrānas un šūnu mijiedarbība ar kaimiņiem. Citoplazma bija bagātīga, tajā bija labi atšķirami kodoli, iegareni mitohondriji, bazālās ieloces un daudzas cauruļveida bedrītes starp mikrovillītēm, kas veidoja suku robežu apikālajā membrānā. Lielāks palielinājums atklāja PCT epitēlija šūnu apikālo virsmu, kas satur garus mikrovillus, veidojot suku robežu un ciešus savienojumus starp blakus esošo cauruļveida epitēlija šūnu luminālo šūnu robežām (2.e, f attēls). No otras puses, DCT epitēlija šūnu apikālajā virsmā bija daži īsi mikrovilli un daudzi pūslīši (attēls 2g, h).
2. attēls. Savvaļas tipa un yotari mikrofotogrāfijas ar transmisijas elektronu mikroskopu (TEM)nieresSavvaļas tipa dzīvnieku glomeruliem (a) bija normāli attīstīta fifiltrācijas barjera ar kapilāra (C) endotēliju (E), bazālo membrānu (BM), podocītiem (P) ar kātiņiem (PE) un fifiltrācijas spraugām (FS). ). Iekšnieresyotari dzīvniekiem varēja pamanīt kātiņu izdzīšanu un fifiltrācijas spraugu trūkumu (zvaigznītes, b–d). Jotari peļu proksimālajos izliektajos kanāliņos (PCT) vai distālajās vītņotajās kanāliņos (DCT) netika novērotas nekādas novirzes, salīdzinot ar savvaļas tipa dzīvniekiem (e – h). PCT citoplazmā bija daudz, un tajā bija labi atšķirami kodoli (N), iegareni mitohondriji (M), bazālās ieloces (BI) un daudzas cauruļveida bedrītes (TP) starp mikrovillītēm, kas veidoja otas robežu (BB) apikālā membrāna (e, f). Lielāks palielinājums atklāja PCT epitēlija šūnu apikālo virsmu, kas satur garus mikrovilliņus, veidojot suku robežu un ciešus savienojumus (TJ) starp blakus esošo cauruļveida epitēlija šūnu luminālo šūnu robežām (e, f). No otras puses, DCT epitēlija šūnu apikālā virsma, kurā ir daži īsi mikrovilli un daudzi pūslīši (g, h). Mēroga josla attēlos (a–d) un ielaidumos (e–h) ir 1 µm; mēroga josla attēlos (e–h) ir 2 µm.
Reelīna un DAB1 lokalizācija un kolokalizācijaReelīns bija vāji izteikts ar vieglu vai mērenu reaktivitāti (2. tabula) visu pārbaudīto dzīvnieku glomerulos un DCT visos novērotajos laika punktos (p < 0.05,="" 3.a="" attēls).="" tikai="" yotari="" peļu="" pct="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" savvaļas="" tipa="" dzīvniekiem="" (p="">< 0,05,="" 3.a="" attēls).="" glomerulārajās="" šūnās="" krāsošanas="" lokalizācija="" bija="" perinukleāra,="" savukārt="" pct="" un="" dct="" tā="" bija="" izkliedēta="" visā="" citoplazmā="" (attēls="" a,="">
igure 4. Postnatālā yotari imunofluorescences krāsošananieresar reelīna marķieri (a) un pēcdzemdību savvaļas tipa dubultu imunofluorescences krāsošanunieresar DAB1 un spoles marķieriem (b). ( a, b ) Kodola DNS DAPI krāsošana apvienota ar DAB1, un paralēli tiek parādīta reelīna imunofluorescence (apvienošana). Novērotie laika punkti bija P4, P11, P14. Pārbaudīto marķieru ekspresija glomerulos (G), proksimālajos vītņotajos kanāliņos (PCT) un distālās vītņotajās kanāliņos (DCT) ir atzīmēta ar bultiņām, savukārt zvaigznītes norāda uz spoles ekspresiju ekstracelulārajā matricā (a). Ieliktņi parāda attēla redzamāko izteiksmi. DAPI kodolkrāsošana atklāja sliktu DAB1 un reelīna kolokalizāciju, galvenokārt DCT (bultas galviņā). Mēroga josla ir 20 µm un attiecas uz visiem attēliem.
Savvaļas tipa dzīvnieku glomerulos un PCT gandrīz nebija DAB1 imūnreaktivitātes pie P4, savukārt pozitīvo šūnu procentuālais daudzums ar vieglu reaktivitāti (2. tabula) ievērojami palielinājās pie P11 un P14 (p < 0.05,="" 3.b="" attēls).="" dct="" dab1="" tika="" ekspresēts="" galvenokārt="" šūnu="" membrānu="" apikālajās="" un="" sānu="" daļās="" (4.b="" attēls)="" ar="" spēcīgu="" reaktivitāti="" (2.="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" iepriekšējās="" struktūrās,="" aptuveni="" 60="" procenti="" (3.b="" attēls),="" īpaši="" makula="" densa="" (4.b="" attēls).="" dab1="" un="" reelīna="" kolokalizācija="" gandrīz="" nenotika,="" izņemot="" savvaļas="" tipa="" dzīvnieku="" dct="" pie="" p14="" (bultiņas="" galviņa,="" 4.b="" attēls).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" 4.="" attēls.="" pēcdzemdību="" yotari="" imunofluorescences="">nieresar reelīna marķieri (a) un pēcdzemdību savvaļas tipa dubultu imunofluorescences krāsošanunieresar DAB1 un spoles marķieriem (b). ( a, b ) Kodola DNS DAPI krāsošana apvienota ar DAB1, un paralēli tiek parādīta reelīna imunofluorescence (sapludināšana). Novērotie laika punkti bija P4, P11, P14. Pārbaudīto marķieru ekspresija glomerulos (G), proksimālajos vītņotajos kanāliņos (PCT) un distālās vītņotajās kanāliņos (DCT) ir atzīmēta ar bultiņām, savukārt zvaigznītes norāda uz spoles ekspresiju ekstracelulārajā matricā (a). Ieliktņi parāda attēla redzamāko izteiksmi. DAPI kodolkrāsošana atklāja sliktu DAB1 un reelīna kolokalizāciju, galvenokārt DCT (bultas galviņā). Mēroga josla ir 20 µm, un tā attiecas uz visiem attēliem. Savvaļas tipa dzīvnieku glomerulos un PCT pie P4 gandrīz nebija DAB1 imūnreaktivitātes, savukārt pozitīvo šūnu procentuālais daudzums ar vieglu reaktivitāti (2. tabula) ievērojami palielinājās pie P11 un P14 (p < 0,05,="" 3.b="" attēls).="" dct="" dab1="" tika="" ekspresēts="" galvenokārt="" šūnu="" membrānu="" apikālajās="" un="" sānu="" daļās="" (4.b="" attēls)="" ar="" spēcīgu="" reaktivitāti="" (2.="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" iepriekšējās="" struktūrās,="" aptuveni="" 60="" procenti="" (3.b="" attēls),="" īpaši="" makula="" densa="" (4.b="" attēls).="" dab1="" un="" reelīna="" kolokalizācija="" gandrīz="" nenotika,="" izņemot="" savvaļas="" tipa="" dzīvnieku="" dct="" pie="" p14="" (bultiņas="" galviņa,="" 4.b="">
NOTCH2 un LC3B telpiskās un laika izteiksmes modeļiNOTCH{{0}}pozitīvo šūnu procentuālais daudzums abu dzīvnieku genotipu glomerulos bija mazāks par 20 procentiem visos novērotajos laika punktos. Tikai pie P14 pozitīvo šūnu procentuālais daudzums yotari dzīvnieku glomerulos bija ievērojami augstāks nekā savvaļas tipa dzīvniekiem (p < 0,05,="" 3.c="" attēls).="" krāsošanas="" intensitāte="" bija="" viegla="" vai="" mērena="" (2.="" tabula),="" galvenokārt="" perinukleāri="" (5.a–f="" attēls).="" abu="" dzīvnieku="" genotipu="" pct="" un="" dct="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" laika="" gaitā="" palielinājās.="" pie="" p14="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" yotari="" dzīvnieku="" pct="" un="" dct="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" savvaļas="" tipa="" dzīvnieku="" pct="" un="" dct="" (p="">< 0,05,="" 3.c="" attēls).="" signāla="" intensitāte="" visos="" novērotajos="" laika="" punktos="" bija="" viegla="" vai="" mērena="" (2.="" tabula)="" un="" izkliedēta="" visā="" citoplazmā="" (5.a–f="" attēls).="" 5.="" attēls.="" pēcdzemdību="" savvaļas="" tipa="" un="" yotari="" imūnfluorescences="">nieresar NOTCH2 un LC3B marķieriem un imūnoperoksidāzes krāsošanu ar šķelto kaspāzes3 (CASP3) marķieri. ( a – f ) Kodola DNS DAPI krāsošana tiek apvienota ar NOTCH2 un LC3B. Novērotie laika punkti bija P4, P11, P14. NOTCH2 un LC3B marķieru ekspresija glomerulos (G), proksimālajos izliektajos kanāliņos (PCT) un distālās izliektajās kanāliņos (DCT) ir atzīmēta ar bultiņām. Īpaši spēcīga LC3B reaktivitāte ir novērojama bojājošos glomerulos Boumena kapsulā (zvaigznīte, e). Ieliktņi parāda attēla redzamāko izteiksmi. CASP3 bija slikti izteikts visos novērotajos laika punktos. Vienīgā nozīmīgā izpausme bija yotari peļu glomerulos uz P14 (bultiņas). Mēroga josla ir 20 µm un attiecas uz visiem attēliem. Biomolekulas 2021, 11, 609 9 no 14 3.4. NOTCH2 un LC3B telpiskās un laika izteiksmes modeļi NOTCH2-pozitīvo šūnu procentuālais daudzums abu dzīvnieku genotipu glomerulos visos novērotajos laika punktos bija mazāks par 20%. Tikai pie P14 pozitīvo šūnu procentuālais daudzums yotari dzīvnieku glomerulos bija ievērojami augstāks nekā savvaļas tipa dzīvniekiem (p < 0,05,="" 3.c="" attēls).="" krāsošanas="" intensitāte="" bija="" viegla="" vai="" mērena="" (2.="" tabula),="" galvenokārt="" perinukleāri="" (5.a–f="" attēls).="" abu="" dzīvnieku="" genotipu="" pct="" un="" dct="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" laika="" gaitā="" palielinājās.="" pie="" p14="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" yotari="" dzīvnieku="" pct="" un="" dct="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" savvaļas="" tipa="" dzīvnieku="" pct="" un="" dct="" (p="">< 0,05,="" 3.c="" attēls).="" signāla="" intensitāte="" visos="" novērotajos="" laika="" punktos="" bija="" viegla="" vai="" mērena="" (2.="" tabula)="" un="" izkliedēta="" visā="" citoplazmā="" (5.a–f="">
5. attēls. Pēcdzemdību savvaļas tipa un yotari imunofluorescences krāsošananieresar NOTCH2 un LC3B marķieriem un imūnoperoksidāzes krāsošanu ar šķelto kaspāzes3 (CASP3) marķieri. ( a – f ) Kodola DNS DAPI krāsošana tiek apvienota ar NOTCH2 un LC3B. Novērotie laika punkti bija P4, P11, P14. NOTCH2 un LC3B marķieru ekspresija glomerulos (G), proksimālajos izliektajos kanāliņos (PCT) un distālās izliektajās kanāliņos (DCT) ir atzīmēta ar bultiņām. Īpaši spēcīga LC3B reaktivitāte ir novērojama bojājošos glomerulos Boumena kapsulā (zvaigznīte, e). Ieliktņi parāda attēla redzamāko izteiksmi. CASP3 bija slikti izteikts visos novērotajos laika punktos. Vienīgā nozīmīgā izpausme bija yotari peļu glomerulos uz P14 (bultiņas). Mēroga josla ir 20 µm un attiecas uz visiem attēliem.
Abu dzīvnieku genotipu glomerulos un DCT LC3B pozitīvo šūnu procentuālais daudzums laika gaitā palielinājās (p < 0.05,="" 3.d="" attēls).="" pie="" p11="" un="" p14="" pozitīvo="" šūnu="" procentuālais="" daudzums="" yotari="" dzīvnieku="" glomerulos="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" savvaļas="" tipa="" dzīvnieku="" glomerulos="" (p="">< 0,05,="" 3.d="" attēls).="" jotari="" dzīvnieku="" glomerulos="" krāsošanās="" intensitāte="" lielākoties="" bija="" mērena="" līdz="" spēcīga="" (2.="" tabula),="" kas="" atrodas="" perinukleārajā="" un="" kodoltelpā="" (5.a–f="" attēls),="" visos="" novērotajos="" laika="" punktos,="" savukārt="" savvaļas="" tipa="" peļu="" glomerulos="" intensitāte="" bija="" pārsvarā="" mēreni="" (2.="" tabula).="" yotari="" un="" savvaļas="" tipa="" dzīvnieku="" pct="" saturēja="" aptuveni="" 20="" procentus="" pozitīvo="" šūnu="" visos="" novērotajos="" laika="" punktos="" (p="">< 0,05,="" 3.d="">
Sadalīta CASP-3 izteiksmeAktivētā CASP-3 gandrīz nebijanieressavvaļas tipa dzīvniekiem visos novērotajos laika punktos. Yotari peļu PCT un DCT vairākas atsevišķas šūnas bija CASP-3-pozitīvas (3.e attēls). Tikai Yotari nieru glomerulos pie P14 (5.e attēls) pozitīvo šūnu procentuālais daudzums ievērojami palielinājās salīdzinājumā arnieressavvaļas tipa pelēm (p < 0,05, 3.e attēls).
Diskusija
Nieresmorfoģenēze un attīstība ir sarežģīti procesi, ko precīzi koordinē daudzu gēnu mijiedarbība. Iedzimtas anomālijasnieresun urīnceļi (CAKUT) ir visizplatītākais iedzimtais defekts, kas veido 23 procentus no visiem šādiem defektiem un ir galvenais beigu stadijas cēlonis.nieru slimībabērniem [28,29]. Viena gēna traucējumi var būt galvenais CAKUT avots, un līdz šim vairāk nekā 20 gēnu mutācija ir identificēta kā CAKUT cēlonis [30]. Tā kā mūsu iepriekšējais darbs parādīja lielisku DAB1 izpausmi normāla cilvēka augļa laikānieresattīstību [9], mēs pieņēmām, ka DAB1 varētu būt nozīmīga loma zīdītāju laikānieresattīstību. Lai pierādītu savu hipotēzi, mēs izpētījāmnieresreelīna, NOTCH2, LC3B un aktivēto CASP3 proteīnu morfoloģija un ekspresijas modeļi Dab1 knockout pelēm.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIERES SĀPES
Sadalīšana caur yotari pelēmnieresatklāja plānāku garozu un ievērojami mazāku vidējonieresun PCT, DCT un G diametri, salīdzinot ar savvaļas tipa dzīvniekiem. SamazinājumsnieresLielums, ko izraisa nepietiekams nefronu daudzums, ir pazīstams kānieruhipoplāzija, viens no visizplatītākajiem CAKUT traucējumiem, kas predisponē pieaugušo hipertensiju un hronisku nieru slimību [31]. Turklāt mikrofotogrāfijas, kas uzņemtas ar TEM, atklāja, ka yotari pelēm bija ievērojami podocītu bojājumi ar pēdas procesa izsvīdumu un fifiltrācijas spraugu trūkumu. Pēc traumas podocīti tiek pakļauti izdzīšanas procesam, kurā tie zaudē savu struktūru, kā rezultātā samazinās to fifiltrācijas barjeras funkcija [32]. Visām nefrotiskā sindroma formām, kā arī fokālajai segmentālajai glomerulosklerozei (FSGS) raksturīgi podocītu struktūras vai funkcijas defekti [33].
Mūsu pašreizējais pētījums parādīja visaugstāko DAB1 ekspresiju DCT šūnu membrānu apikālajās un sānu daļās, savukārt REELIN lielākoties bija izkaisīts visā PCT citoplazmā. Pētītajos laika punktos Yotari peļu kanāliņos morfoloģiskas izmaiņas netika novērotas, taču ir nepieciešama turpmāka izmeklēšana, lai noskaidrotu DAB1 lomu tubulointersticiālajos nodalījumos. Neregulāra DAB1 un REELIN proteīnu kolokalizācija, galvenokārt DCT. Šie atklājumi seko mūsu iepriekšējam darbam par šo divu proteīnu ekspresiju cilvēka augļa laikānieresattīstība [9]. Tas var likt domāt, ka DAB1 un reelīnam ir līdzīga loma cilvēkiem un pelēmnieresaktivizējot dažus pakārtotos ceļus, piemēram, Crk, MAPK un PI3K/Akt/mTOR signalizācijas kaskādes [34–36]. Mūsu dati atklāja arī palielinātu reelīna ekspresiju Yotari peļu glomerulos. Interesanti, ka iepriekšējais pētījums ir parādījis, ka DAB1 fosforilācija un palielināta reelīna ekspresija glomerulos ir saistīta ar hipertensiju, proteīnūriju un podocītu bojājumiem žurkām, kas ievadītas ar Ang II [10].
Turklāt imunofluorescences krāsošana atklāja palielinātu NOTCH2 receptoru ekspresiju P14 yotari peļu glomerulos. Ir labi zināms, ka NOTCH2 ekspresija tiek samazināta, kad ir sasniegta nefrona nobriešana, izņemot nosacījumusnieru traumas,piemēram, diabētiskā nefropātija un FSGS [15,37]. Pelēm ar adriamicīna izraisītu nefrotisko sindromu bija arī paaugstināta aktivētā NOTCH2 ekspresija, kas uzlabo fibrozi [38]. Izpētītajos laika punktos mēs nepamanījām pastiprinātu fibrozi, taču atliek noskaidrot precīzu izteiktā NOTCH2 lomu pēcdzemdību yotari.nieres.Būtu nepieciešami turpmāki novērojumi par to, vai vēlākos posmos notiek fifibrotiskas izmaiņas. Tomēr jau ir daži atklājumi, kas liecina, ka palielinātas NOTCH2 aktivācijas īstermiņa ietekme ir saistīta ar spēcīgu ievainoto podocītu izdzīvošanas ieguvumu, kas tiek zaudēts ilgtermiņa modeļos, piemēram, diabētiskā nefropātija [39].
Augstāka LC3B ekspresija P11 un P14 yotari peļu glomerulos, iespējams, atspoguļoja autofagosomu uzkrāšanos podocītos. Lai skaidri parādītu, ka autofagija tika paātrināta. Nepieciešams analizēt LC3-II un LC3-I proteīna ekspresiju attiecību. Normālos apstākļos autofagija ir nepieciešama normālai darbībainieru darbība[40], īpaši podocītos. Tā kā tām ir ierobežota šūnu dalīšanās un aizstāšanas spēja, tām ir augsts autofagijas bāzes līmenis [41]. Neraugoties uz šiem konstatējumiem, vairākās glomerulārās slimībās ir ziņots par LC3B ekspresijas paaugstināšanos [42–44], galvenokārt saistībā ar pēdas procesa izzušanu un nefrotiskā sindroma attīstību, kā tas novērots prorenīna receptoru nosacīta nokauta pelēm [45,46]. Visi šie pētījumi liecina par pastiprinātas autofagijas aizsargājošu lomu patoloģiskos apstākļos, ko vēl vairāk apstiprina adriamicīna izraisītas nefropātijas atklājumi, kad autofagija tiek aktivizēta, lai aizsargātu pret podocītu bojājumiem [43], kā arī no vecuma atkarīgās glomerulārās slimības gadījumā, kad tā aizkavējas. progresējoša funkcionālā samazināšanāsnieru darbība[40]. Cilvēka analīzenieresbiopsijas arī parādīja pierādījumus par palielinātu autofagiju saistībā ar pēdas procesa izsīkumu vairākās glomerulārās slimībās, tostarp ar minimālu izmaiņu nefrotisko sindromu (MCNS), kas ir viens no biežākajiem idiopātiskā nefrotiskā sindroma cēloņiem [19]. Diabētiskās nefropātijas un lipopolisaharīdu izraisītas akūtas apstākļosnieru traumas,autofagijas uzlabošana ar dažiem terapeitiskiem līdzekļiem, inhibējot PI3K / AKT / mTOR ceļu, uzlabo nieru darbību [47, 48]. Visi šie atklājumi liecina, ka autofagijai ir neaizstājama citoprotektīva loma stresa adaptācijānieru traumas, un tā modulācija varētu būt daudzsološa terapeitiskā stratēģija, lai gan dažos apstākļos autofagija var būt arī kaitīga un progresēt līdz šūnu nāvei.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru mazspēju
Izņemot autofagijas paaugstināšanos, paaugstinātu apoptozes līmeni varēja novērot arī P14 yotari peļu glomerulos. Autofagija parasti novērš apoptozi, bet īpašos patoloģiskos apstākļos tai var būt arī pretēja ietekme uz šūnu izdzīvošanu, uzlabojot un veicinot apoptozi [42]. Pēc piedzimšanas apoptoze innieresir ievērojami samazināts, izņemot nosacījumusnieru traumas,piemēram, idiopātisks nefrotiskais sindroms, kas veicina slimības attīstību [23]. potenciāls jauns autosomāli recesīvu iedzimtu anomāliju cēlonisnieresun urīnceļu. Tomēr galvenā loma DAB1 laikānieresattīstība joprojām ir neskaidra. Turklāt šīm pelēm bija pēdas procesa anomālijas un paaugstināts reelīna, NOTCH2, LC3B un šķelto CASP3 proteīnu līmenis glomerulos, kas var izraisīt glomerulāru bojājumus, piemēram, nefrotisko sindromu, kas saistībā ar hipoplāziju var būt potenciāls nāves cēlonis. šo dzīvnieku atšķiršanas periodā. Lai apstiprinātu šo hipotēzi, ir jāsniedz papildu informācija par asinsspiedienu un citiem klīnikas-laboratorijas parametriem, piemēram, kreatinīna, albumīna un proteīnu līmeni serumā.
