Jauna interleikīna (IL) loma fibrozes ārstēšanā
Mar 17, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ⅰ daļa: Kodolenerģijas IL-33 ierobežo agrīnu fibroblastu pārvēršanos par ekstracelulāro matricu izdalošu fenotipu
FrancescaGatti, Sobuj Mia, Clara Hammarström un citi.
Interleikīns(IL)-33 ir citokīns, kas, šķiet, ir starpnieksfibrozesignalizējot caur savu receptoru ST2 (IL(Interleikīns)-33R/ILiRL1). Tomēr tas ir arī proteīns, kas pēc sintēzes tiek sakārtots līdz šūnas kodolam, kur šķiet, ka tas ietekmē hromatīna locīšanu. Šeit mēs aprakstām jaunu lomu kodolenerģijas IL(Interleikīns)-33 fibroblastu fenotipa regulēšanā pelesnieresfibrozeko izraisa vienpusēja urētera obstrukcija. IL transkripcijas profilēšana(Interleikīns)-33-deficīta nieres 24 stundas pēc nosiešanas atklāja pastiprinātu fibrogēno gēnu ekspresiju un gēnu kopu bagātināšanos, kas iesaistītas ekstracelulārās matricas veidošanā un pārveidošanā. Šīs izmaiņas balstījās uz IL intracelulāro iedarbību(Interleikīns)-33 jo tie netika atveidoti, apstrādājot ar neitralizējošu antivielu pret L.33, kas novērš IL(Interleikīns)-33R/ST2L receptoru signalizācija, kā arī netika novērota nierēs ar L-33R/ST2-deficītu. Lai turpinātu pētīt lL-33 intracelulāro funkciju, mēs izveidojām cilvēka fibroblastu transkripcijas profilus, novērojot, ka IL-33 iznīcināšana novirzīja transkripcijas profilu no iekaisuma uz miofibroblastu fenotipu, kas atspoguļojas augstākos COL3Al līmeņos. , COL5A1 un transgelīna proteīnu, kā arī zemāku IL6, CXCL8, CLL7 un CCL8 ekspresijas līmeni. Visbeidzot, mūsu atklājumi liecina, ka kodolenerģijas IL(Interleikīns)-33 fibroblastos slāpē sākotnējo profibrotisko reakciju, līdz pastāvīgi stimuli, ko nodrošina UUO, var ignorēt šo aizsardzības mehānismu.
Interleikīns-33 (IL-33/IL(Interleikīns)1F1l) ir organizācijas loceklisinterleikīns-1 virsģimene, kas ir saņēmusi ievērojamu uzmanību kā iespējamais starpnieksfibrozeattīstību. Liela daļa šīs intereses tika veicināta, novērojot, ka atkārtotas IL injekcijas(Interleikīns)-33, kas darbojas caur transmembrānu receptoru ST2 (IL(Interleikīns)33RJ/IL(Interleikīns)1RL1), ko izraisa ādasfibroze' un ievērojot, ka IL(Interleikīns)-33-deficīts būtiski samazināja oglekļa tetrahlorīda izraisītās aknasfibroze. Patiešām, IL(Interleikīns)-33 var reklamētfibrozeģenerējot profibrotisku IL(Interleikīns)-13 no 2. tipa iedzimtajām limfoīdajām šūnām (ILC2) un T palīglimfocītiem.
Nieru intersticiālsfibrozeun parenhīmas kanāliņu šūnu zudums ir bieži sastopami hronisku nieru slimību galarezultāti un labi slimības progresēšanas prognozētāji. Pašreizējie dati, kas iegūti no diviem dažādiem peles modeļiem, apstiprina hipotēzi, ka IL(Interleikīns)-33 arī veicina nieru patoloģijufibroze: vienpusējas urētera obstrukcijas (UUO) gadījumā Chen et al ziņoja par samazinātu parenhīmas zudumu un pastiprinātu epitēlija proliferāciju abās IL(Interleikīns)-33- un ST2-deficīta pelēm”, kā arī nieru išēmijas-reperfūzijas gadījumā Liang et al. parādīja, ka IL inhibīcija(Interleikīns)-33 signalizācija, ievadot šķīstošo IL(Interleikīns)-33 receptors (sST2) arī samazinātsfibroze.
Ziņojumi, kas attiecas uz IL fibrogēnajām īpašībām(Interleikīns)-33 parasti tiek veikti un interpretēti, ņemot vērā mehānismu, ar kura palīdzību IL(Interleikīns)-33, kas izdalās no stresa vai bojātām šūnām, saistās ar sava receptora ekstracelulāro domēnu. Turpretim IL šķirošana.(Interleikīns)-33 uz šūnas kodolu pēc sintēzes – un tā spēja ietekmēt no receptoriem neatkarīgu hromatīna locīšanu liecina, ka IL-33 var veikt arī transkripcijas faktoram līdzīgas, no receptoriem neatkarīgas funkcijas, kas ir darbības veids, kam eksperimentāli pievērsta daudz mazāk uzmanības. . Šie apsvērumi ir vēl jo interesantāki, ņemot vērā faktu, ka IL kodola lokalizācija(Interleikīns)-33 ir vitāli svarīgs, kā to atklāj nāvējošs, neatrisināms iekaisums, kad tiek traucēts kodola lokalizācijas signāls.
Galvenais šūnu starpnieksfibrozeir miofibroblasts, kas, aktivizējot, kalpo kā primārā kolagēnu ražojošā un kontraktilā audu atjaunošanas šūna. Miofibroblastus raksturo gludās muskulatūras aktīna (a-SMAACTA2) ekspresija, kas nodrošina to saraušanās funkciju un veicina muskuļu destruktīvo iedarbību.fibrozeMēs jau iepriekš esam pierādījuši, ka kodols I{0}} tiek ātri un spēcīgi inducēts miofibroblastos eksperimentālās brūču dzīšanas laikā, kuņģa čūlas un čūlainā kolīta gadījumā. Patiešām, IL izpausme(Interleikīns)Šķiet, ka -33 ir a-SMA pozitīvo miofibroblastu vispārēja iezīme, jo tas ir atrodams arī aizkuņģa dziedzerīfibrozeun miofibroblastiem līdzīgās aknu zvaigžņu šūnās. Kopumā šie atklājumi padara interesantu jautājumu, vai IL(Interleikīns)-33 varētu būt nozīme miofibroblastu funkcijas un diferenciācijas regulēšanā.
Mēs šeit aprakstām jaunu kodola lL-33 lomu miofibroblastu fenotipa regulēšanā. Ar IL ģenētiskas dzēšanas vai farmakoloģiskās inhibīcijas palīdzību(Interleikīns)-33 UUO modelī, kā arī IL izsīkums(Interleikīns)-33 aktivizētos cilvēka primāri kultivētajos dermas fibroblastos mēs parādām, ka kodola IL(Interleikīns)-33 ierobežo agrīnu pāreju uz pilnvērtīgu miofibroblastisku fenotipu un atbalsta iekaisuma fenotipu. IL izsīkšana(Interleikīns)-33 pastiprināja ekstracelulārās matricas komponentu COL1Al, COL1A2, COL3A1, COL5A1 un transgelīna ekspresiju, bet inhibēja proinflammatoriskā citokīna IL ekspresiju(Interleikīns)-6 un ķīmokīni CXCL8 CCL7 un CCL8. Tāpēc mūsu atklājumi ievieš jaunu skatījumu uz izpratni par IL-33 lomufibrozeattīstība un audu homeostāze.
Cistanchetubulosanovēršnieresslimība, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu
Rezultāti
Miofibroblasti ir dominējošā IL(Interleikīns)-33-izsaka šūnas peles UUO.Nesenais Chen un kolēģu pētījums ziņoja par paaugstinātu IL izpausmi(Interleikīns)-33 un ST2 4. dienā pēc vienpusējas urētera obstrukcijas. Mēs tuvojāmies viņu eksperimentam, savācot nieres 1, 7 un 21 dienā pēc UUO C57BL/6J pelēm, novērojot vienmērīgu IL pieaugumu.(Interleikīns)33 mRNS transkripti (1.A att.) un palielināts šūnu skaits, kas ekspresē kodola IL(Interleikīns)-33(1. B att.). Mēs arī novērojām I tipa kolagēna transkripciju un proteīnu ekspresiju, kas atspoguļoja attīstībufibroze(IC, D att.). Pēc tam mēs analizējām IL fenotipu(Interleikīns)-33-izsaka šūnas. Tāpat kā Chen et al., mēs novērojām, ka IL(Interleikīns)-33-2. dienā novērotā šūnu apakškopa, kas ekspresēja, galvenokārt sastāvēja no a-SMA pozitīviem miofibroblastiem, tomēr mēs neatradām signālu par IL(Interleikīns)-33 CD31-pozitīvās endotēlija šūnās, ne CD45-pozitīvos leikocītos (IE un S1 attēls). Mēs arī novērojām IL(Interleikīns)-33 izkaisītos pericītos (sarkans bultiņas gals 1. A attēlā, 21. dienas panelis). PDGFRB, cita miofibroblastu un pericītu marķiera, imūnkrāsošana pārī atklāja plašu kolokalizāciju (IE attēls). Turklāt mēs novērtējām, vai IL(Interleikīns)33 tika kolokalizēts ar zināmiem fibroblastu aktivācijas marķieriem, atklājot, ka S100A4 (pazīstams arī kā fibroblastu specifiskais proteīns, FSP-1) ekspresija drīzāk tika ekspresēta kapilāru endotēlija šūnās un vidēja izmēra asinsvados (IE attēls). . Tāpat VIM/vimentīns tika konstatēts arī galvenokārt endotēlija šūnās, jo īpaši glomerulos un vidēja izmēra asinsvados, un IL nebija atklātas koekspresijas.(Interleikīns).33-pozitīvās šūnas (1. E attēls). Turpmāka IL analīze(Interleikīns)-33-izpaužot miofibroblastus 7. dienā, atklājās, ka tie galvenokārt bija lokalizēti garozā un kortikomedulārajā savienojumā. un mazāk sastopams smadzenēs un papillas (1.F att.).
1. attēls. Vienpusēja urētera obstrukcija izraisa IL(Interleikīns)-33 izteiksme peles nierēs.
(A, C) 33 un Collal relatīvā ekspresija nierēs no veselām kontroles pelēm (n=2) vai pelēm, kas pakļautas fiktīvai operācijai (n=1) vai UUO pēc 1, 7 vai 21 dienas (n=3 katrā laika punktā). Transkripcijas līmeņi tika kvantificēti, kā aprakstīts sadaļā Materiāli un metodes, izmantojot qRT-PCR. Datu punkti attēlo atsevišķas peles. (B, DF) Reprezentatīvas mikrofotogrāfijas ar audu sekcijām, kas iekrāsotas IL(Interleikīns)-33 [brūns signāls (B) un (F), brūns vai zils signāls (E)], COL1 (brūns signāls panelī D), Asma (sarkans, E, F), CD31 (purpursarkans, E ), PDGFRB (krīklis, E), vimentīns (krīklis, E) un S100A4 (purpursarkans, E) nierēs no veselām kontroles pelēm vai pelēm, kas pakļautas UUO2 dienām (E), 7 dienām (B, D, F) vai 21 dienai (B,D)iepriekš. Panelis (F) parāda dažādus nieres apgabalus, kā norādīts uz etiķetes. Mēroga joslas=20 μm.
I-33 ģenētiskai dzēšanai ir niecīga ietekme uz fibrozes progresēšanu UUO, taču tā veicina agrīnu kolagēna sintēzes pastiprināšanos.Pēc tam mēs novērtējām IL iespējamo lomu(Interleikīns)-33, salīdzinot reakciju uz nieru obstrukciju IL(Interleikīns)-33 un savvaļas tipa pelēm. Pretstatā Čenam un kolēģiem, kuri ziņoja par samazinājumufibrozeattīstība IL(Interleikīns)-33-deficīta pelēm, kas pakļautas UUO, mēs nenovērojām nekādu atšķirību starp IL(Interleikīns)33--un WT'pelēm fibrozes attīstībā 7. vai 21. dienā pēc UUO, izmantojot I tipa kolagēna imūnhistoķīmisko analīzi (2.A, B att.). Tomēr, sadalot fibrotisko reakciju transkripcijas līmenī, novērtējot kolagēna transkriptus, mēs novērojām agrīnu, nozīmīgu Collal transkriptu līmeņa paaugstināšanos līdz divreiz augstākam līmenim un tendenci palielināt Col3al, salīdzinot IL.(Interleikīns)-33-deficīta un savvaļas tipa nieres 1. dienā (2. C, D att.). Tāpēc mēs nolēmām atkārtot Chen et al eksperimentālo dizainu. analizējot arī paraugus 4. dienā pēc UOO un iekļaujot ST2-deficīta peles, salīdzinot tos ar IL(Interleikīns)-33-deficīta un WT peles. Šīs analīzes atklāja ievērojamu Colla2 pieaugumu IL(Interleikīns)33-nieres ar deficītu, salīdzinot ar savvaļas tipa nierēm 4. dienā, bet nav atbilstoša ST-2-deficīta nieru skaita pieauguma (2. E attēls). Nebija acīmredzamu atšķirību Collar un Col3al transkripta līmeņos starp genotipiem 4. dienā, kas liecina, ka ietekme uz šiem gēniem ir īslaicīgāka (dati nav parādīti un 2. Fig.).
2. attēls. Kolagēna ekspresija IL(Interleikīns)-33-/un savvaļas tipa nieres UUO laikā.
(A, B) Reprezentatīvi fotomikrogrāfi audu sekcijām, kas iekrāsotas COL1(brūnā) nierēs no I-33--un WT pelēm 7 un 21 dienu pēc UUO.(C,D) Laika gaita, salīdzinot Collal un Col3al mRNS transkripciju IL(Interleikīns)-33--un WT peles, kurās redzamas veselas kontroles peles (n=2), fiktīvi operētas peles (n=1) un peles, kas pakļautas UUO1, 7 vai 21 dienu iepriekš (n{{ 7}} katrā laika punktā un katram genotipam).(E,F) Collal un Col3al transkripcijas salīdzinājums nierēs no IL(Interleikīns)-33-,ST2-un WT peles 4 dienas pēc fiktīvas operācijas (n=5 pēc genotipa) vai UUO (n=10katram genotipam). Transkripcijas līmeņi tika kvantificēti ar mRNS qRT-PCR. Datu punkti attēlo atsevišķas peles, joslas parāda vidējās vērtības.* lpp<><><>
IL(Interleikīns)-33 mazina profibrotisko gēnu ekspresiju UUO agrīnā fāzē.Collar un Col31 palielināta ekspresija 1. dienā (1. att. CD) un Colla2 4. dienā (2. att. E) IL(Interleikīns).33-deficīta peles norādīja uz IL lomu(Interleikīns)-33 agrīnā atbildē uz traumu. Mēs izpētījām šo iespēju, iekļaujot vairāk dzīvnieku paplašinātā eksperimentā, novērojot paaugstinātu Collar, Colla2 un Col3al transkripta līmeni IL.(Interleikīns).-33-deficīta pelēm 1. dienā (3.A–C. att.).
Ievērojot, ka IL(Interleikīns)-33 nieru audos no pelēm, kas pakļautas UUO, kas lokalizēts šūnu kodolos, mēs pēc tam jautājām, vai izmainītā gēnu ekspresija novērota IL(Interleikīns)-33-deficīta pelēm 1. dienā pēc UUO radās iespaidīgas kodola IL-33 atbrīvošanās vai ārpusšūnu IL trūkuma dēļ.(Interleikīns)-33. Mēs izmantojām pēdējo iespēju, ievadot neitralizējošu antivielu, kuras mērķis ir IL(Interleikīns)-33 savvaļas tipa pelēm pirms UUO (3. D attēls). Šī ārstēšana neatveidoja IL fibrogēno fenotipu(Interleikīns)33 mutanti, nostiprinot hipotēzi, ka profibrotiskā gēnu ekspresijas pieaugums novērots, ja nav IL(Interleikīns)-33 radās kodola, nevis ārpusšūnu IL trūkuma dēļ(Interleikīns)-33.
Attēls 3.IL(Interleikīns)-33 mazina kolagēnu ekspresiju UUO agrīnā fāzē.
(AC) Collal, Colla2 un Col3al transkripcija nierēs no IL(Interleikīns)-33-/un WT peles l dienu pēc fiktīvas operācijas (n=5 uz genotipu) vai UUO (n=10katram genotipam). (D) Col3al transkripcija nierēs no WT pelēm, kas ārstētas ar anti-IL(Interleikīns)-33, izotipa kontroles antivielas vai nesējs pirms UUO. Nieres tika ievāktas 24 stundas pēc UUO(n=10 katrā ārstēšanas grupā) vai fiktīvas operācijas(n=5). Transkripcijas līmeņi tika kvantificēti ar qRT-PCR. Datu punkti attēlo atsevišķas peles, joslas parāda vidējās vērtības.** lpp<><>
IL transkripta analīze(Interleikīns)-33-nieru trūkums atklāj ārpusšūnu matricas reorganizācijas un kolagēna veidošanās profilu.Lai detalizētāk izpētītu agrīno reakciju uz UUO, izmantojot transkripcijas profilēšanu, RNS tika iegūta no IL nierēm.(Interleikīns)-33-deficīta un savvaļas tipa peles 24 h pēc UUO. Pāru Fišera lineārais diskriminants24 tika izmantots, lai identificētu 5 procentus (200 gēnus) atšķirīgi izteiktos gēnus starp WT un IL.(Interleikīns)-33-deficīts nierēs, kas atklāj skaidru genotipu atšķirību galveno komponentu analīzē (4.A attēls). Nestingra pieeja (lpp<0.05,><0.25, and="" fold="" change="">1.3) identificēja 134 pazeminātas un 46 paaugstinātas regulēšanas zondes kontrasta IL(Interleikīns)33−/− (n=5) pret WT (n=4) (papild. tabula S1), starp pēdējiem īpaši Col1a1, Col1a12 un Col3a1, kā arī ar miofibroblastiem saistīto Acta2 (4.B att.) . Turklāt diferenciāli ekspresētu gēnu gēnu ontoloģijas analīze, izmantojot DAVID anotācijas klasterizāciju (S2 tabula), atklāja pozitīvu GO terminu bagātināšanu, kas saistīti ar kolagēniem un proteāzes inhibitoriem, kā arī PDGF saistīšanos un ECM-receptoru mijiedarbību, kā arī negatīvu GO- bagātināšanu. termini, kas saistīti ar oksidoreduktāzes aktivitāti un no nātrija neatkarīgiem anjonu transportētājiem.
4. attēls. Kopsavilkums par transkripcijas atšķirībām starp IL(Interleikīns)-33-deficīta un savvaļas tipa peles 24 h pēc UUO.
(A) 3D izkliedes diagramma parāda paraugu sadalījumu, pamatojoties uz 200 gēnu galveno komponentu analīzi. (B) Augstāko diferencēti izteikto gēnu siltuma karte.
Fibroblastu IL.33 izsīkšana veicina gēna parakstu, kas atbilst palielinātai ārpusšūnu matricas nogulsnēšanai.Izpētīt IL funkciju(Interleikīns)-33dominējošā IL(Interleikīns)-33-izpaužot aizsprostoto nieru šūnu populāciju, mēs novirzījām kultivētos cilvēka fibroblastus pret miofibroblastu fenotipu, pakļaujot tos IFN-y un TGF- 24 h² pēc siRNS izraisītas I-33 notriekšanas. Efektīva notriekšana tika pārbaudīta gan proteīna, gan transkripta līmenī (5.A att.), un to papildināja profibrotiskā COL3A1, COL5A1 un TAGLN mRNS un proteīna līmeņa paaugstināšanās (5.B-D att.). Sākotnējās analīzes liecināja par TGF iesaistīšanos un mudināja mūs transkripcijas veidā profilēt apvienotus, kultivētus cilvēka fibroblastus, kas apstrādāti ar siRNS uz IL(Interleikīns)-33 un aktivizē IFN-y(lai izraisītu IL(Interleikīns)-33 ekspresija) vai ar IFN-y un TGF-B kombināciju 24 stundas. Šī analīze identificēja 64 atšķirīgi ekspresētus gēnus, kas saistīti ar IL izsīkumu.(Interleikīns)-33(pielāgo. lpp<0.05 and="" fold="" change="">1.5., 5. E. att.), no kurām 35 bija kopīgas abām citokīnu apstrādēm (5. E un F att.). Turklāt lielākajai daļai gēnu bija līdzīgas tendences abos apstākļos, pat ja tie sasniedza izvēlēto diferenciālās ekspresijas slieksni tikai vienā no tiem (5. att. F), kas apstiprina pieņēmumu, ka IL inhibējošs efekts.(Interleikīns)-33 bija līdzīgs abos apstākļos. Tāpēc gēnu ontoloģijas analīzei mēs ņēmām vērā gēnus, kurus IL atšķirīgi ekspresēja(Interleikīns)-33 izsīkums vismaz vienā stāvoklī un veikta anotāciju klasterēšana (S3 tabula). Saskaņā ar mūsu konstatējumu UUO-eksponētā, IL(Interleikīns)-33-trūkst nierēm, mēs atklājām, ka IL inhibīcija(Interleikīns)-33 fibroblastos izraisīja pastiprinātu gēnu ekspresiju, kas bagātināti ar GO terminiem, kas saistīti ar kolagēnu un ārpusšūnu matricas komponentiem. Turklāt gēni, kurus nomāca I-33 samazināšanās, tika bagātināti ar GO terminiem, kas saistīti ar reakciju uz iekaisuma stimulāciju. Kopā mūsu dati liecina, ka IL(Interleikīns)-33 ekspresija fibroblastos kalpo, lai mazinātu transkriptu regulēšanu, kas saistīti ar ārpusšūnu matricas nogulsnēšanos un miofibroblastu aktivāciju, savukārt iekaisuma transkriptus zināmā mērā atbalsta IL(Interleikīns)-33.
5. attēls. Fibroblastu IL izsīkšana(Interleikīns)-33nodrošina gēna parakstu, kas atbilst palielinātai ekstracelulārās matricas nogulsnēšanai.
IL izpausme(Interleikīns)33(A), COL5A1(B), FIBL5(C) un TGLN(D) ekspresija cilvēka fibroblastos, kas ārstēti ar IL(Interleikīns)-33-specifiskā un kodētā siRNS tika mērīta ar gRT-PCR (augšējie paneļi) un Western blot (apakšējie paneļi). Joslas parāda 4 neatkarīgu eksperimentu vidējās vērtības,* lpp<0.05.(e)venn diagram="" comparing="" differential="" expression="" of="" transcripts="" in="" response="" to="" the="" silencing="" of="">(Interleikīns)33 starp kontroles un aktivizētajām šūnām.
(F) Siltuma karte, kurā parādīti atšķirīgi izteikti transkripti, reaģējot uz IL siRNS klusēšanu(Interleikīns)-33 kontroles un aktivizētajās šūnās.
IL izsīkšana(Interleikīns)-33 aktivētos fibroblastos dod priekšroku miofibroblastam, nevis iekaisuma fenotipam.Pamatojoties uz mūsu novērojumiem, ka I{0}} ietekme, šķiet, saglabājas un laika gaitā kļūst pamanāmāka, lai gan IL(Interleikīns)-33 izteiksme samazinās (S2A, B attēls), mēs pēc tam jautājām, vai IL galvenā kodolfunkcija(Interleikīns)-33 varētu būt fibroblastu diferenciācijas regulēšana, nevis tieša profibrotisko efektoru regulēšana. Stimulējot, miera stāvoklī esošie fibroblasti un citas mezenhimālās šūnas attīsta iekaisuma un/vai kontrakcijas funkcijas. Spektrs starp iekaisuma fibroblastiem un kontraktiliem miofibroblastiem joprojām ir slikti definēts un, iespējams, ir slīdoša pāreja, nevis divi atšķirīgi fenotipi. Tomēr nesenā Ohlunda et al.23 publikācijā ar vēzi saistītie fibroblasti (CAF) ir salīdzināti ar miera stāvoklī esošām aizkuņģa dziedzera zvaigžņu šūnām, identificējot iekaisuma fenotipu, ko sauc par iCAF (kopā kultivēti Transvelsā ar citokīnus izdalošiem audzēja organoīdiem un kas ekspresē augstu un zemu līmeni IL(Interleikīns)6 un SMA, attiecīgi [IL(Interleikīns).dPa-SMAl]) un saraušanās miofibroblastiskais fenotips, myCAF (IL)(Interleikīns)6"a-SMA-, kultivēts blīvos monoslāņos), iCAF un mvCAF transkripcijas profilēšana un salīdzināšana identificēja raksturīgus transkripcijas profilus. Lai gan fibroblasti ar iekaisuma fenotipu (iCAF) pastiprināja savuinterleikīniun kemokīniem, tiem, kuriem ir miofibroblastisks fenotips (myCAF), bija raksturīga pastiprināta TGF reakcijas gēnu ekspresija un ārpusšūnu matricas komponenti, tostarp kolagēni3. Mēs izmantojām šo datu kopu, lai izveidotu parakstu sarakstus, kas sastāv no labākajiem atšķirīgi regulētajiem gēniem starp fenotipiem un veikto gēnu kopas bagātināšanas analīzi GSEA programmatūrā. Rezultāti liecināja, ka I-33 inhibēšana atbalstīja kontraktilo miofibroblastisko fenotipu (myFBL) un inhibēja iekaisuma fenotipu (iFBL) cilvēka fibroblastos (6.A, B att., S4 tabula), tādējādi piekrītot mūsu gēnu ontoloģijas analīzes rezultātiem. . Šajā brīdī mēs pievērsām uzmanību IL(Interleikīns)6 un CXCL8, citokīni, kas ir ierosināti kā iCAF marķieri, atklājot, ka, lai gan šie gēni neatbilda diferenciālās ekspresijas kritērijiem mūsu transkriptu analīzē, to ekspresijas līmeņa samazināšanos var noteikt ar qRT-PCR pēc IL izsīkuma.(Interleikīns)-33(6. C att., D). Starp iekaisuma mediatoriem, kas mūsu transkripta analīzē tika atklāti samazināti (5. att. F), mēs arī apstiprinājām CCL7 un CCL8 ekspresijas samazināšanos šūnās, kas apstrādātas ar anti-IL.(Interleikīns)-33 siRNS (6. E, F att.).
Šie novērojumi pamudināja mūs izpētīt, vai mūsu atklājumus varētu pārvērst peles UUO modelī 1. dienā. Imūnhistoķīmiskā analīze (Fg.6G) un kvantitatīva noteikšana (6.H attēls) atklāja IL indukciju.(Interleikīns)6-izsaka šūnas savvaļas tipa nierēs, līdzīgi Chen et al4 novērojumiem transkripta līmenī. Turpretī mēs novērojām ievērojami samazinātu IL skaitu(Interleikīns)-6-pozitīvās šūnas IL(Interleikīns)-33- peles, labi saskan ar mūsu in vitro ģenerētajiem cilvēka fibroblastu datiem.
6. attēls. IL izsīkšana(Interleikīns)-33 novirza fibroblastus pret miofibroblastisku fenotipu.
(A, B) Gēnu komplekta bagātināšanas analīze parādīja, ka šūnas tika apstrādātas ar IL(Interleikīns)-33-specifiskas siRNS tika pozitīvi bagātinātas ar miofibroblastu (myFBL) pret iekaisuma fibroblastu (iFBL) parakstu un negatīvi bagātinātas ar iekaisīgu un mierīgu fibroblastu parakstu. (CF) IL transkripcija(Interleikīns)6(C), IL(Interleikīns)8(D), CCL7(E) un CCL8(F) cilvēka fibroblastos, kas apstrādāti ar IL(Interleikīns)33-specifiskā vai kodētā siRNS tika mērīta ar gRT-PCR. Katrs datu punkts parāda neatkarīgu eksperimentu tehnisko trīs eksemplāru vidējās vērtības. (G) Reprezentatīvas nieru sekciju mikrofotogrāfijas, kas iegūtas 4 dienas pēc fiktīvas vai UUO operācijas no WT un IL(Interleikīns)-33-/- peles un imūnkrāsotas pret IL(Interleikīns)-6(brūns signāls). Mēroga joslas=100 um.(H)Signāla aklā kvantitatīvā noteikšana, uzskaitot vidējo pozitīvo šūnu skaitu lielas jaudas redzes laukā. Atsevišķi datu punkti parāda vidējo pozitīvo šūnu skaitu vienā pelē, saskaitot 3 lieljaudas laukus vislielākā blīvuma apgabalos. *lpp<>
