Ⅰ DAĻA: Iekaisuma process modulē WT1 ekspresiju un lokalizāciju podocītos, kas izraisa nieru bojājumus
Mar 23, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Ievads
Vilma audzēja-1 gēns(WTI) ir viens no galvenajiem gēniem, kas iesaistīti podocītu izdzīvošanā un neefektīvā nieru filtrācijā. Iekaisuma procesi noved pienieresneveiksmeun tas, iespējams, var notikt, modulējot WT1 (Vilma audzēja-1 gēns). WT1(Vilma audzēja-1 gēns) kodē transkripcijas faktoru, cinka pirksta proteīnu, kam ir četras galvenās izoformas, izmantojot alternatīvu savienojumu 5. eksonā (17AA±) un 9. eksonā (KTS±) (1). KTS-izoformai ir lielāka afinitāte pret DNS, KTS plus vienlaikus lokalizējas ar spliceosomu proteīniem citoplazmā (2, 3).WT1(Vilma audzēja-1 gēns) spēlē izšķirošu lomu embrioģenēzē, galvenokārt dzimumdziedzeru unnieresattīstība; pieaugušajiem tā izpausme ir ierobežota ar specializētām viscerālajām šūnāmnieres(podocīti) un ir būtiska vairāku gēnu, piemēram, podokaliksīna, nefrīna (NPHS1) un pāru kastes transkripcijas faktora (4-6), uzturēšanai un modulēšanai. Mutācijas vai WTl ekspresijas samazināšanās var izraisīt nefrīna un podokaliksīna ekspresijas samazināšanos un ir saistīta ar nefropātijām, piemēram, glomerulosklerozi (5, 7-10).
Nefrotiskais sindroms ir visizplatītākais nieru sindroms bērnībā, tā histoloģiskā klasifikācija ir minimālas nefrotiskas izmaiņas, fokusa segmentālā glomeruloskleroze un difūzā mezangiālā skleroze, un pēc atbildes reakcijas uz steroīdiem pakāpes tiek klasificēts kā jutīgs un rezistents nefrotiskais sindroms (11). .
cistanche iedarbība: pretiekaisuma iedarbība
WT1(Vilma audzēja-1 gēns) bieži tiek ziņots bērniem ar steroīdu rezistentu nefrotisko sindromu, retu slimību, kas skar 10-15 procentus pacientu ar nefrotisko sindromu (12,13). Apmēram 80 procenti no visiem bērniem ar sporādisku nefrotisko sindromu reaģē uz ārstēšanu ar steroīdiem, tomēr WT1 mutācijas netika atrastas (Vilma audzēja-1 gēns) lielas kohortas pētījumā(14).Seroīdu rezistenta nefrotiskā sindroma ekspresijas samazināšana un mazākā mērā pacientiem ar steroīdiem jutīgu nefrotisku sindromu(15).Lipopolisaharīda (LPS) izraisīta sistēmiskā iekaisuma peles modelī, 24 h pēc LPS ievadīšanas, WT1(Vilma audzēja-1 gēns) tika pārvietots uz citoplazmu un bija saistīts ar nefrīna ekspresijas samazināšanos, kas ir galvenā sastāvdaļa, lai uzturētu spraugas diafragmu podocītos un kas ir būtiska pareizai glomerulārajai filtrācijai, tādējādi parādot WT1 (Vilma audzēja-1 gēns) darbojas kā transkripcijas faktors nefrīna gēna regulēšanai (16).
A459 plaušu vēža šūnās, kas apstrādātas ar audzēja nekrozes faktoru alfa (TNFa), WT1 (Vilma audzēja-1 gēns) ir novērota proteīna pāreja citoplazmā, kas liecina, ka iekaisuma stimuls var mainīt tā intracelulāro lokalizāciju un transkripcijas funkciju (17). Fosforilācijai var būt nozīme WT1 transkripcijas regulējošās aktivitātes modulēšanā (Vilma audzēja-1 gēns), traucējot kodola translokāciju, kā arī inhibējot WT1(Vilma audzēja-1 gēns) DNS saistīšanās (18) ar cAMP atkarīgu proteīnkināzes mediētu Ser-365 un Ser-393 fosforilāciju cinka pirksta domēnā (19).
Sepse ir sistēmiskas iekaisuma reakcijas rezultāts, un to raksturo infekcijas izraisīta pro- un pretiekaisuma citokīnu izdalīšanās. Akūts nieru bojājums ir izplatīts kritiski slimiem pacientiem akūta iekaisuma klātbūtnē, un tam ir cieša saikne ar hroniska nieru bojājuma progresēšanu (20, 21). Ir pierādījumi, ka iekaisumam ir liela nozīme dažādu orgānu bojājumos, tostarpnieres(22).Šajā darbā mēs novērtējām pro-iekaisuma citokīnu ietekmi uz WT1 modulāciju.Vilma audzēja-1 gēns) ekspresiju un tās pārvietošanos uz citoplazmu.
cistanche tubulosa ieguvums: pretvēža un pretvēžaaudzējs
Materiāli un metodes
Dzīvnieku modelis. BALB/c peļu mātītes (8-10 nedēļas vecas) tika iegūtas no Hārlendas Meksikas (Mehiko, Meksika). Peles tika ievietotas būros kontrolētā istabas temperatūrā, mitrumā un gaismā (12/12 h gaismas-tumsas cikls) ar ūdeni un pārtiku ad libitum.LPS no Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mehiko, Meksika) un vienu LPS injekcija tika ievadīta intraperitoneāli 8 mg/kg devā (16); sāls šķīdums tika izmantots kontroles, neapstrādātām pelēm. Peles tika nogalinātas ar intraperitoneālu injekciju 200 mg/kg nātrija pentobarbitāla šķīduma 12, 24, 36, 48 un 72 stundās ar n=5 katrā laika punktā, un pēc tamnierestika savākti audi un asinis. Urīns tika savākts pirms dzīvnieku upurēšanas.
Divas peles parniereseksplanti tika injicēti ar 1 mg/kg LPS ik pēc 2 dienām, lai izraisītu hroniskunieres ievainojumskā pozitīvu kontroli (21). Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar Bioloģijas zinātņu fakultātes Institucionālās dzīvnieku kopšanas un lietošanas komitejas (CEIBA-2016-034) iepriekšēju apstiprinājumu.
Niereseksplanti. NonieresBALB/c pelēm audu šķēles 250-300 um biezas tika sagatavotas ar Krumdieck audu griezēju (Alabama Research and Development, Munford, AL, ASV) 4 grādu temperatūrā ar pastāvīgu Krebsa Henseleita bikarbonāta (KB) bufera plūsmu. kas tika aerēts ar 5 procentiem CO2. Šķēles tika novāktas KB buferšķīdumā 4 grādu temperatūrā.Niereseksplanti tika izklāti 12-iedobju plāksnēs ar Dulbecco modificēto Eagle barotni/F12 barotni, kas papildināta ar 10% liellopa augļa serumu un 5% antibiotiku-pretsēnīšu līdzekli, un inkubēja 37 °C temperatūrā ar 5% CO un maisot 25 °C temperatūrā. apgr./min. Eksplantus apstrādāja ar 10 ng/ml TNFa (R&D Systems, Mineapolisa, MN, ASV), 20 ng/ml interleikīna 1 (IL1; R&D Systems) un 100 ng/ml LPS un analizēja 6., 12. un 24h vēlāk.
Urīna proteīns. Urīna paraugi tika savākti katrā iepriekšminētajā laika punktā. Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta, izmantojot DC Protein Assay komplektu (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV), un albumīnūrija tika novērtēta, izmantojot nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pamatojoties uz liellopu seruma albumīna joslas izmēru (16).
Pro-iekaisuma citokīni. IL6, IL1 un TNFa līmeņi tika mērīti, izmantojot sviestmaižu enzīmu saistītus imūnsorbcijas testu komplektus (PeproTech, Mehiko, Meksika).
Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (qPCR). Kopējā RNS tika izolēta no nieru audiem, izmantojot Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Vienpavediena cDNS tika sintezēta ar reverso transkripciju, izmantojot augstas kapacitātes cDNS reversās transkripcijas komplektu (Applied Biosystems, Foster City, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Reāllaika PCR tika veikta, izmantojot 7500 reālā laika PCR sistēmu (Applied Biosystems) ar TaqMan gēnu ekspresijas testiem. Katram paraugam trīs eksemplāros tika veikti salīdzinošie reālā laika PCR testi. WT1(Vilma audzēja-1 gēns) tika nosūtīti:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; reverss:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';un zonde FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;protokols tika veikts 95 grādos 10 minūtes un 40 ciklus 94 grādos 30 s un 64 grādi C 30. gadiem. WT1(Vilma audzēja-1 gēns) gēns tika aprēķināts, izmantojot vienādojumu 2-AACT(23) ar gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāzes (GAPDH) gēnu (Applied Biosystems), ko izmantoja normalizēšanai.
ārstē nieru slimību cistanche ekstraktu
Nefrīna mRNS ekspresija tika noteikta ar 3 ug cDNS un šādiem primeriem: uz priekšu: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3' un reverss: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3' 94 grādos 30 s, 60 grādu grāds 30 s un 72 grāds 30 s 30 cikliem (372 bp) (16). GAPDH izteiksmei izmantotie primeri: Forward:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',reverse:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', ar šādiem reakcijas apstākļiem: 94 grādi 40 s, 60 grādi 30 s un 72 grādi 40 s 35 cikliem (452 bp). WT1(Vilma audzēja-1 gēns):Uz priekšu 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', atpakaļgaitā 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3' 94 grādi 40 s, 64 grādos 30 s un 72 grādi 30 s, 35 bp (1600). WT1(Vilma audzēja-1 gēns) izoformas KTS± un 17 AA± (F2-R2 praimeri, lai noteiktu 17 AA plus /- un F3-R3, lai noteiktu KTS plus /-splicēšanas izoformas) tika veiktas ar parasto PCR saskaņā ar Oji et .al.(24). Aktīna ekspresijas noteikšana tika veikta saskaņā ar Lauxet al. (25). Produkti tika novēroti, izmantojot 10% poliakrilamīda gēla elektroforēzi KTS±izoformai un 2% agarozes gēlu 17AA±izoformai.
Imunofluorescence. Thenieresno pelēm, kas apstrādātas ar LPS, un kontroles tika fiksētas 10 procentu formalīnā un apstrādātas hematoksilīna un eozīna krāsošanai, imūnhistoķīmijai un imunofluorescencei.
Lai noteiktu WT1(Vilma audzēja-1 gēns) pelēm, kas tika ārstētas ar LPS, tika izmantotas {{0}}mm biezas nieru audu daļas, kas piestiprinātas mikroskopa priekšmetstikliņiem. Paraugi tika atsvaidzināti, caurlaidīgi ar Triton X-100 [0,1% Triton ar 1% nātrija citrātu fosfātu buferšķīdumā (PBS)] un trīs reizes mazgāti ar PBS. Audi tika bloķēti ar 20% liellopu augļa serumu PBS 30 minūtes un inkubēti 4 grādu temperatūrā nakti ar monoklonālu antivielu pret WT1 (Vilma audzēja-1 gēns) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santakrusa, Kalifornija, ASV)atšķaidīts 1:100 ar 10 procentiem liellopu augļa serumu PBS. Pēc mazgāšanas ar PBS saistīto antivielu klātbūtne tika identificēta, krāsojot ar kazas anti-peles IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology). Priekšmetstikliņi tika iekrāsoti ar 4',6-diamidino-2-fenilindolu. Visbeidzot, priekšmetstikliņi tika uzstādīti un kvalitatīvi pārbaudīti, izmantojot Olympus BX61W1 konfokālo mikroskopu ar 40 × ūdens iegremdēšanas objektīvu un Fluoview 4.0a programmatūru (Olympus, Tokija, Japāna).
Imūnhistoķīmija. Lai noteiktu fosforilēto (p)-WT1(Vilma audzēja-1 gēns) podocītos no pelēm, kas ārstētas ar LPS, poliklonālās antivielas pret p-WT1(Vilma audzēja-1 gēns) tika izmantots serīns 393,sc-12933 un 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dalasa, Teksasa, ASV). Priekšmetstikliņi, kuros bija 4-μm nieru audu sekcijas, tika atvaskots un caurlaidīgs. . Imūnhistoķīmija tika veikta, izmantojot Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu. Priekšmetstikliņi tika pārbaudīti, izmantojot gaismas mikroskopu ar 100 × eļļas imersijas objektīvu (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Vācija) .
Western blot. Kopējais proteīns tika izolēts ar 200 ul līzes buferšķīduma (1 procents Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,6), un koncentrācija tika mērīta, izmantojot DC Protein Assay komplektu (Bio-Rad). Olbaltumvielas (50 ug) tika atdalītas, izmantojot 12% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un analizētas ar Western blot metodi ar WT1 (Vilma audzēja-1 gēns) [F6] antivielu sc-7585(Santakrusas biotehnoloģija). Paraugi tika normalizēti, izmantojot anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, ASV). Olbaltumvielas tika vizualizētas, izmantojot Lumi-Light Western Blotting sistēmu sc{5}}(Santa Cruz Biotechnology).
cistanche ieguvums: aizsargājiet nieres
Rezultāti
Indukcija nonieresbojājumuBALB/c pelēm ar LPS. Ir labi pierādīts, ka podocītu bojājumi ir saistīti ar palielinātu proteīnūriju. Albumīns un kopējais proteīns urīnā tika noteikts ar nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un DC Protein Assay komplektu (Bio-Rad). Ievērojams urīna albumīna pieaugums (p=0.001) tika novērots 12 stundas pēc LPS terapijas ar maksimālo pieaugumu pēc 24 stundām (215,87±1,41 ug/ml), salīdzinot ar kontroli (15,53). ±5,0 ug/ml) (1.A attēls). Kopējā urīna proteīna koncentrācija sasniedza maksimumu pēc 36 stundām (26,02±2,43 mg/ml), un tā bija ievērojami augstāka, salīdzinot ar kontroli (p=0,01). LPS izraisītais nieru bojājums tika analizēts ar histoloģiju.24 stundas pēc ārstēšanas nieru audos tika novērots fokālais glomerulonefrīts, vislielākais bojājums tika konstatēts pēc 36 stundām, palielinoties glomerula izmēram, ar mezangiālu. 48 stundas pēc tam tika novērota pakāpeniska glomerula atjaunošanās līdz 72 stundām, kā parādīts 1C attēlā.
1. attēls. Sistēmiskā iekaisuma ietekme uz nierēm.Urīna albumīna (A) un urīna proteīna (B) koncentrācija kā nieru bojājumu marķieri pelēm, kas ārstētas ar lipopolisaharīdu. C: reprezentatīvs peles nieru histoloģijas attēls (krāsošanās ar hematoksilīnu un eozīnu) dažādos laikos (12, 24, 36, 48 un 72 h) pēc lipopolisaharīda injekcijas, salīdzinot ar hroniska iekaisuma modeli, palielinājums 100x. Būtiski atšķiras pie: *n<><0,0]><0.00>
Pro-iekaisuma citokīnu TNFa un IL1 ražošana serumā no LPS ārstētām pelēm. Lai apstiprinātu, ka LPS izraisīja nieru bojājumus, ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu noteica iekaisuma citokīnu līmeni. TNFa un I1 palielināšanās tika novērota pēc 12 stundām (3,6±0,9 ng/ml, 11,9±5 ng/ml) un līdz 36 stundām (4,44±0,1 ng/ml,18). ±0.9 ng/ml) ārstēšanas ar LPS, kas pēc tam sāk samazināties (2.A un B attēls). IL6 ekspresija palielinājās 12 h (49,5 ng/ml) un 36 h (23,5 ng/ml) pēc apstrādes, kas ir ievērojami augstāka nekā kontrolei (2.C attēls).
2. attēls. Pro-iekaisuma citokīnu līmeņa audzēja nekrozes faktors-alfa (TNFa) laika gaita.(A), interleikīns 1 (LL1 )(B) un IL6(C) serumā no pelēm pēc lipopolisaharīda intraperitoneālas ievadīšanas. Būtiski atšķiras: *p Mazāks vai vienāds ar 0.05,**p Mazāks vai vienāds ar 0.01 un ***p Mazāks vai vienāds ar 0,001 .
WTI gēna ekspresija nieru audos no LPS ārstētām pelēm. Lai atbildētu uz mūsu galveno jautājumu par to, vai WT1(Vilma audzēja-1 gēns) modulēja iekaisuma process, un tam bija ietekme uz nierēm, kopējā WT1(Vilma audzēja-1 gēns) gēns tika noteikts nieru paraugos no pelēm ar sistēmisku iekaisumu dažādos iekaisuma procesa laikos. WT1(Vilma audzēja-1 gēns) mRNS visu laiku bija zemāka, salīdzinot ar kontroli, ar viszemāko relatīvo ekspresiju 36 h un augstāko 12 h pēc sistēmiska iekaisuma ierosināšanas, kā parādīts 3.A attēlā. Turklāt tika noteikts, vai ārstēšana ar LP izraisīja izoformas eksona5 (17 AA±) un KTS± WTI ekspresijas modifikāciju ar PCR. Dati parādīja, ka šo izoformu ekspresija netika atcelta, jo visā LPS izraisītā sistēmiskā iekaisuma procesā tika novērota tāda pati uzvedība kā kontroles grupai bez ārstēšanas (3.B attēls). Tika parādīts, ka WT1 proteīns ar Western blotēšanu samazinās visā iekaisuma procesā, ar nelielu atveseļošanos 36 stundas pēc ārstēšanas, tomēr WT1 daudzums bija mazāks nekā neapstrādātajā kontrolē (3.C un D attēls).
3. attēls. Lipopolisaharīda (LPS) ietekme uz Vilmsa audzēja I (WT1) gēna ekspresiju nieru audos no pelēm ar sistēmisku iekaisumu.A: WTI mRNS relatīvā ekspresija.B: WT1 izoformu KTS±un 17IAA± relatīvā ekspresija.C: WTI proteīna līmeņi ar imūnblotēšanu pēc ārstēšanas ar LPS un D: WT1 imūnblotēšanas blīvums. Būtiski atšķiras:**p Mazāk par vai vienāds ar 0.01 un ***p Mazāks vai vienāds ar 0,001,
WTI fosforilēšana un lokalizācija ar LPS ārstētu peļu nieru biopsijās. Svarīgs notikums WTI proteīna pēctranslācijas modulācijā ir aminoskābes 393 fosforilēšana, kas izraisa proteīna pārvietošanu uz citoplazmu. Tika noteikta WT1 fosforilācija un lokalizācija nieru paraugos no pelēm, kas ārstētas ar LPS. WT1 fosforilācija tika analizēta ar histoķīmiju, norādot uz fosforilētā WT1 klātbūtni šūnu citoplazmā nieru audu sekcijās, sākot 12 stundas pēc sistēmiska iekaisuma ierosināšanas un saglabājoties līdz 72 stundām. WT1 tika fosforilēts pie aminoskābēm 3633 un 3633 kā parādīts 4.A attēlā. WT1 proteīna atrašanās vieta tika analizēta ar imunofluorescenci. WT1 atrašanās vieta podocītos nieru paraugos no pelēm, kas ārstētas ar LPS, galvenokārt bija citoplazmatiska, turpretim kontroles paraugu podocītos atrašanās vieta bija neskaidra (4.B attēls).
4. attēls. Vilmsa audzēja I (WTI) fosforilēšana un lokalizācija nieru paraugos no pelēm, kas apstrādātas ar lipopolisaharīdu.A: Fosforilētā (p)-WTI imūnhistoķīmiskā krāsošana, kas liecina par fosforilētā skaita palielināšanos serīnā 393 un 363, sākot 12 stundas pēc LPS ievadīšanas (palielinājums 100x gaismas mikroskopā). B: WTI lokalizācija ar imunofluorescenci nierēs; piemēri, kas parāda nelielu WT1(kvadrātiņu) lokalizāciju kodolā 36 h pēc lipopolisaharīda ievadīšanas (palielinājums 40x konfokālajā mikroskopā).DAP1:4,6-diamidino-2-fenilindols.
WTI un nefrīna ekspresijas modulēšana nierēs no pelēm, kas ārstētas ar LPS. WT1 atrašanās šūnā ietekmē tās bioloģisko aktivitāti. Ir ziņots, ka citoplazmas WT1 neizraisa transkripcijas aktivitāti; šī iemesla dēļ WT1 un nefrīna mRNS ekspresija tika analizēta ar PCR nieru paraugos no pelēm, kas ārstētas ar LPS (5.A attēls). PCR liecināja par nefrīna mRNS samazināšanos no 24 līdz 48 stundām, palielinoties pēc 72 stundām (5.B attēls). ), savukārt WTI mRNS ekspresija palielinājās pēc 12 stundām un pēc tam samazinājās iekaisuma un nieru bojājumu kritiskajās stundās (24 un 36 stundas) un (5.B attēls).
5. attēls. Nefrīna (NPHS1) un Vilmsa audzēja 1 (WT1) mRNS ekspresijas analīze.A: Analizējot mRNS ekspresiju, NPHSI un WTI samazinājās 24, 36 un 48 stundas pēc sistēmiska iekaisuma ierosināšanas, izmantojot lipopolisaharīdu. B: joslu kvantitatīvā noteikšana, kas parādīta A, izmantojot densitometriju un normalizēta pēc ekspresijas ar gliceraldehīda 3-fosfāta dehidrogenāzi.
Nieru eksplanti, kas apstrādāti ar TNFa un IL1, modulē WTI un nefrīna ekspresiju. Lai noteiktu, vai citokīni modulē WT1 ekspresiju, nieru eksplanti tika kultivēti un apstrādāti ar citokīniem TNFa un IL1 6, 12 un 24 stundas, lai analizētu WT1 un nefrīna ekspresiju ar PCR. Nefrīna mRNS ekspresija samazinājās un WTI mRNS ekspresija palielinājās 24 stundās nieru eksplantātos, kas apstrādāti ar TNFa un ILlb (6. attēls).
6. attēls. Nefrīna (NPHS1) un Vilmsa audzēja 1 (WT1) mRNS ekspresijas analīze nieru eksplantātos.A: NPHSi un WTI mRNS ekspresijas līmeņi dažādos laikos nieru eksplantātos, kas pakļauti 10 ng/ml audzēja nekrozes faktora-alfa (TNF ) un 20 nglml interleikīna 16 (IL16) B: relatīvā ekspresija iegūta, izmantojot densitometrisko analīzi. signāla produkts. Joslas tika kvantitatīvi noteiktas, normalizējot gliceraldehīda 3-fosfāta dehidrogenāzi.
WTI lokalizācija nieru eksplantātos ar imunofluorescenci. Lai noteiktu, vai TNFa un IL bija atbildīgi par WT1 proteīna lokalizācijas izmaiņām, peles nieru eksplantus 24 stundas apstrādāja ar TNFa un L1 un LPS. Eksplantātos, kas apstrādāti ar ILlb un LPS, bija redzama WTl proteīna lokalizācija kodolā/citoplazmā, un ar TNFa apstrādātajos eksplantātos tika novērota WT1 proteīna citoplazmas lokalizācija; tikmēr neapstrādātajās kontrolēs tika novērota galvenokārt WT1 lokalizācija kodolā (7. attēls).
7. attēls. Vilmsa audzēja 1 (WTI) proteīna lokalizācija ar imunofluorescenci, izmantojot sarkano TX (WT1) un 4',6-diamidino-2-fenilindolu (DAPI) (kodolu) podocītos no apstrādātiem nieru eksplantātiem ar l0 ng/ml audzēja nekrozes faktora-alfa (TNFa), 20 ng/ml interleikīna 16(L1B) un lipopolisaharīda (LPS).Samazināta WTs kodola lokalizācija, kas parādīta ar TNFa apstrādātajos eksplantos, salīdzinot ar WTI kodolieroču/citoplazmas lokalizāciju IL1 un LPS ārstēšanā. Palielinājums, 40×.