Jauns netrīns{0}}atvasināts peptīds uzlabo aizsardzību pret neironu nāvi un mazina intracerebrālo asiņošanu pelēm, 2. daļa

Turklāt mēs atklājām, ka peptīds E1 īpaši aktivizēja FAK un SFK signalizācijas ceļus. Tāpēc peptīdam E1 var būt ļoti specifiska iedarbība un tas var būt efektīvs atveseļošanās procesā pēc ICH.

Pastāv saistība starp augstu specifiku un atmiņu. Augsta specifika attiecas uz spēcīgāku aktivitāti noteiktos smadzeņu apgabalos, kad cilvēki veic uzdevumu. Atmiņa attiecas uz cilvēku spēju mācīties un atcerēties informāciju. Kad mēs iemācīsimies izmantot augstu specifiku, lai veiktu uzdevumu, palielināsies arī mūsu atmiņa.

Pētījumi liecina, ka, ja mums ir īpašas prasmes un pieredze kādā uzdevumā, smadzenes pakāpeniski veidos specializētas neironu ķēdes un atmiņas modeļus. Šīm shēmām un modeļiem būs īpaša ietekme uz atbildi uz uzdevumu, tādējādi uzlabojot uzdevuma efektivitāti. Tajā pašā laikā, veicot līdzīgus uzdevumus nākotnē, šīs shēmas un modeļi tiks aktivizēti, lai palīdzētu mums labāk atcerēties un veikt uzdevumu.

Uzdevumi ar augstu specifiku ietver mūziku, valodu, sportu utt., un šo prasmju apgūšana var uzlabot mūsu atmiņu. Piemēram, kad pianists praktizē spēli, smadzenes apgūs specifiskās klavieru prasmes un turpinās stiprināt šīs ķēdes prakses laikā. Šo ķēžu izveide un nostiprināšana uzlabos arī pianista izpratni un atmiņu par mūziku.

Tāpēc pastāv pozitīva saistība starp augstu specifiku un atmiņu. Īpašu prasmju un pieredzes apgūšana var ne tikai uzlabot mūsu izpildes efektivitāti, bet arī stiprināt atmiņu, palīdzot mums labāk apgūt un atcerēties dažādu informāciju. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo tai ir antioksidanta, pretiekaisuma un pretnovecošanās iedarbība, kas var palīdzēt samazināt oksidācijas un iekaisuma reakcijas smadzenēs, tādējādi aizsargājot cilvēka veselību. nervu sistēma. Turklāt Cistanche var arī veicināt nervu šūnu augšanu un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot neironu tīklu savienojamību un darbību. Šie efekti var palīdzēt uzlabot atmiņu, mācīšanās spējas un domāšanas ātrumu, kā arī var novērst kognitīvo disfunkciju un neirodeģeneratīvo slimību rašanos.

Noklikšķiniet uz zināt papildinājumus, lai uzlabotu atmiņu

Atšķirībā no peptīda E1, peptīds E2 var aktivizēt ERK signālu pārraidi, kas veicina neironu nāvi. To var izraisīt Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G motīvs E2, kas var aktivizēt ERK signalizācijas ceļu [28].

Tas norāda, ka dažādi Netrin-1-atvasinātie peptīdi pilda dažādas funkcijas. Galvenie Netrin-1 receptori ir DCC un UNC5 ģimenes locekļi [50]. DCC un UNC5H2 loma ICH joprojām ir pretrunīga [51, 52].

Mūsu identificētā Netrin-1 secība ir būtiska Netrin-1 mijiedarbībai ar DCC [19]. Šie rezultāti liecina, ka DCC var piedalīties Netrin-1-izraisītā funkcionālā atjaunošanā pēc ICH.

Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai izpētītu šo procesu pamatā esošos mehānismus un saistītos signalizācijas ceļus. Turpmākajos eksperimentos mēs novērtēsim peptīda E1 bioloģiskās īpašības, lai izpētītu tā toksicitāti un pussabrukšanas periodu klīniskai lietošanai.

4. Materiāli un metodes

4.1. Dzīvnieki

Laboratorija bija specifiska no patogēniem brīva (SPF) laboratorija. Visas peles tika izmitinātas 12-h gaismas-tumsas ciklā ar apgaismojumu ieslēgtu no pulksten 6:00 līdz 18:00, un tām tika nodrošināta piekļuve pārtikai ad libitum. DCC+/− peles tika izveidotas, kā aprakstīts iepriekš [53].

Kortikālo neironu kultūrai tika izmantoti DCC+/− peles embrios. Genotipēšana tika veikta ar polimerāzes ķēdes reakciju (PCR), kā aprakstīts iepriekš [53]. C57BL/6J peles tika iegādātas no Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Pekina, Ķīna).

4.2. Konstrukcijas

Ekspresijas konstrukcijas, kas kodē cilvēka DCC (HGNC: 2701), cilvēka Netrin-1 (HGNC: 8029) un cilvēka UNC5A (HGNC: 12567), tika izveidotas mūsu laboratorijā [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His tika ģenerēts, izmantojot Seamless AssemblyCloning Kit (Clone Smarter, C5891, ASV). hNetrin-1 (∆407–443) cDNS secība bija redzama S2 papildu tabulā.

cDNS sekvences, kas atbilst DCC FN5 domēnam un Netrin-1 407.–443. aminoskābēm, tika konstruētas, ligējot pGEX-5x-1 vektorā, lai iegūtu GST saplūšanas proteīnus.

4.3. Netrin-1 kondicionētās vides kolekcija

Netrin-1-kondicionētā barotne tika savākta un apstiprināta, kā aprakstīts mūsu iepriekšējā ziņojumā [13,14]. Īsumā, ar Myc-His iezīmēto cilvēka Netrin-1 tika izteikts HEK293T šūnās.

Pēc 24 stundām šūnas 3 reizes mazgāja ar Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, ASV) un pēc tam trīs dienas inkubēja Opti-MEM bez seruma.

Barotne tika bagātināta ar centrbēdzes filtrēšanu (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, ASV) un uzglabāta –80 ◦C. Bagātinātajam Netrin-1 tika imūnblotēts ar anti-His un kvantitatīvi noteikts, salīdzinot ar BSA kā slodzes kontroli.

Pēc tam Netrin{{0}} iedarbība tika novērtēta pēc FAK fosforilēšanas. Parasti 0,1 mg/ml Netrin-1 efektīvi izraisīja FAK fosforilēšanos, un šī koncentrācija tika izmantota mūsu pētījumos. Netrin-1stimulācijas ilgums visos eksperimentos bija 20 minūtes, ja vien nav norādīts citādi.

4.4. Western Blot analīze

Western blotēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [54]. Paraugi tika izšķīdināti līzes buferšķīdumā (1% Nonidet P-40, 0.5% nātrija deoksiholāts, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10% glicerīns, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadāts un proteāzes inhibitori), lai lizētu šūnas un svaigus smadzeņu audus.

Primārās izmantotās antivielas bija: peles anti-DCC (1:500, #554223, BD, Sanhosē, CA, ASV), peles anti-His (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Pekina, Ķīna ), peles anti-myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, Ķīna), peles anti-Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, Ņujorka, ASV), pele pretkarogs (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, Sentluisa, MO, ASV), trušu anti-fosfo-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, Sentluisa, MO, ASV), trušu anti-FAK (1:200, sc-557, Santakrusa, Santakrusa, CA, ASV), trušu anti-fosfoSRC (Tyr418) (1:1000, Invitrogen, Karlsbāda, CA, ASV) , trušu anti-SRC ģimene (1:1000, #2123, CST, Danvers, MA, ASV), peles anti-GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Pekina, Ķīna), peles anti-beta aktīns (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, Sentluisa, MO, ASV), trušu anti-fosfo-ERK (Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, ASV), rabbitanti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, ASV), HRP konjugētas sekundārās antivielas pret peli, kazu vai trusi tika iegādātas no Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, ASV).

4.5. Šūnu virsmas saistīšana

HEK293 šūnas, kas uzklātas uz segstikliņiem, tika transficētas ar Flag-DCC plazmīdām, izmantojot kalcija fosfāta metodi, kā aprakstīts iepriekš [55]. Aptuveni 40 h pēc transfekcijas šūnas tika inkubētas ar 100 µg/mL myc-Netrin-1 vai myc-Netrin-1 (∆407–443) 30 min pirms mazgāšanas 5 minūtes ar HBHA (20 mM HEPES, pH 7,0 un 0,5 mg/mLBSA HBSS), noskalo ar 1x PBS un secīgi fiksē ar 4% paraformaldehīdu PBS 10 minūtes. Primārās izmantotās antivielas bija trušu anti-myc (1:200, Abcam,ab9106, Kembridža, MA, ASV) un peles anti-flag (1:100, Sigma Aldrich, F3165) antivielas.

Sekundārās izmantotās antivielas bija Alexa Fluor 488-konjugētās ēzeļa anti-truša (1:1000; Invitrogen, A21206) un Alexa Fluor 546-konjugētās kazas anti-peles (1:1000; Invitrogen, A10036) antivielas. . Kodoli tika iekrāsoti ar 40,6-diamino-2-fenilindolu (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, ASV). Visi attēli tika iegūti ar Zeiss LSM 880 konfokālo mikroskopu.

4.6. GST nolaižams

GST-DCC saplūšanas proteīns tika attīrīts ar glutationa-SepharoseTM 4B lodītēm (GE Healthcare, Little Chalfont, Bakingemšīra, Apvienotā Karaliste) saskaņā ar ražotāja protokolu.

Aptuveni 500 µg šūnu lizāta no HEK293T šūnām, kas transficētas ar norādītajām plazmīdām, nakti inkubēja ar 2–5 µg GST-DCC-FN5 saplūsmes proteīna RIPA buferšķīdumā 4 ◦ C temperatūrā. Glutathi-one-SepharoseTM 4B lodītes tika izmantotas, lai uztvertu GST-DCC-FN5 saplūšanas proteīnu un ar to mijiedarbojošos proteīnus. Saistītie proteīni tika atbrīvoti proteīna iekraušanas buferšķīdumā ar karstuma denaturāciju.

4.7. Primārā kortikālā neirona kultūra

Primārie kortikālie neironi tika kultivēti, kā aprakstīts iepriekš [56]. Īsumā, embriji (E17) tika izņemti no anestēzētām grūsnām pelēm. Smadzeņu garozas tika atdalītas un sasmalcinātas mazos gabaliņos.

Pēc inkubācijas {{0}}.125% Trypsin Plus ar 0,05% DNāzi HBSS 37 ◦C temperatūrā 20 minūtes, šūnas tika sasmalcinātas ar uguns pulēta stikla Pastēra pipetēm un filtrētas ar 40 µm filtru.

Disociētās šūnas tika suspendētas DMEM ar 10% FBS un uzklātas uz poli-D-lizīna pārklātiem traukiem vai stikla pārklājumiem 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 atmosfērā. Pēc 4 stundām barotne tika aizstāta ar neirobazālo barotni, kas papildināta ar B27 un GlutaMAX.

4.8. NLT šūnu kultūras un ārstēšanas protokoli

Peles GnRH ekspresējošās neironu šūnas (NLT) uzturēja mūsu laboratorija. NLTšūnas tika audzētas DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, ASV), kas satur 10% FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Izraēla) un 1% penicilīna/streptomicīna (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, ASV) 37 ◦C temperatūrā. mitrināta atmosfēra, kurā ir 95% gaisa un 5% CO2.

Lai noteiktu hemīna neirotoksicitāti, NLT šūnām tika pievienotas dažādas hemīna (Sigma-Aldrich) koncentrācijas (0, 10, 30, 60, 90 un 120 µM) un apstrādātas 6 stundas. No šīm koncentrācijām tika izvēlēta 60 µM (LD50) un izmantota turpmākajos eksperimentos.

Kontroles grupas tika ārstētas tikai ar nesēju (DMSO). Šūnu dzīvotspēja un dzīvā / mirušā krāsošana tika veikta 6 stundas pēc apstrādes. Katrai grupai tika izmantotas trīs iedobes. Eksperimenti tika atkārtoti vismaz 3 reizes.

4.9. Hemīna izraisītas šūnu nāves in vitro modelis

Šūnu nāve tika izraisīta primārajos garozas neironos un NLT šūnās, apstrādājot attiecīgi ar 50µM un 60 µM heminu, kā aprakstīts iepriekš [57,58]. Hemīns tika izšķīdināts 0, 1 M NaOH, lai iegūtu izejas šķīdumu. Neiroprotekcijas pētījumos šūnas tika apstrādātas ar hemīnu 6 stundas noteiktu līdzekļu klātbūtnē vai nātrija selenīta šķīdināta dubultdestilēta ūdens klātbūtnē.

4.10. CCK-8 Tests

Šūnu dzīvotspēja tika noteikta ar CCK-8 testu (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japāna), kā aprakstīts iepriekš [59]. Īsāk sakot, Neuronāli tika iesēti 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 6000 šūnas/iedobē 100 µL barotnē un pa nakti tika ievadīti inkubatorā.

Šūnas tika apstrādātas ar Hemin 6 stundas. Neironu šūnas tika mazgātas iepriekš uzsildītā PBS (37 ◦C) un CCK-8 reaģentā (10 µL uz 100 µL barotnes) katrā iedobē.

Pēc tam mēs inkubējām plāksnes 2 stundas 5% CO atmosfērā, un absorbcija pie 450 nm tika mērīta, izmantojot amikroplākšņu lasītāju. Šūnu dzīvotspēja tika attēlota procentos no kontroles (neapstrādātas šūnas).

4.11. Dzīva/mirusi krāsošana

CCK-8 testa spēja izmērīt dzīvotspēju tika pārbaudīta, krāsojot ar kalceīnuAM/PI PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Krāsošanas šķīdums sastāvēja no 2 µM kalceīna AM reaģenta un 8 µM PI reaģenta, kas sajaukts ar PBS. Paraugus inkubēja 30 minūtes un attēloja, izmantojot fluorescences mikroskopa 20x objektīvu (Olympus FSX100, Tokija, Japāna). Hemīna izraisītas šūnu nāves in vitro modelim tika izmantotas vismaz 3 neatkarīgas šūnu kultūras.

4.12. Peptīdu sintēze un ievadīšana

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2), TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC iezīme — TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC (NH{{ EGF3) {7 GGS-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2) un karodziņš Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) peptīdus ar 99% tīrību iegādājās uzņēmums Shanghai GL Biochem (Šanhaja, Ķīna) un uzņēmums Wuhan Bioyeargene Biosciences (Uhaņa, Ķīna).

For more information:1950477648nn@gmail.com