Jauns netrīns{0}}atvasināts peptīds uzlabo aizsardzību pret neironu nāvi un mazina intracerebrālo asiņošanu pelēm 3. daļa
Aug 19, 2024
Ārstēšanas grupas ar fizioloģisko šķīdumu, TAT vai TE1 (izšķīdinātu fizioloģiskā šķīdumā) tika ievadītas pelēm 2 pēc ICH un katru dienu 5 dienas ar intraperitoneālu injekciju ar kopējo tilpumu 0,1 ml uz vienu dzīvnieku. Peptīdi tika ievadīti aklā veidā devā 12 mg/kg.
Fizioloģiskais šķīdums ir plaši izmantots fizioloģiskais buferšķīdums, ko plaši izmanto medicīniskos un bioloģiskos eksperimentos. Bet vai tu zināji? Fizioloģiskais šķīdums var arī uzlabot mūsu atmiņu!
Pirmkārt, fizioloģiskajam šķīdumam ir svarīga loma normālā šūnu darbībā. Tas var uzturēt normālu šūnu osmotisko spiedienu un uzturēt normālu šūnu morfoloģiju un funkciju. Smadzenēs lielam skaitam nervu šūnu fizioloģiskais šķīdums ir nepieciešams kā pamatviela, un fizioloģiskā šķīduma piedeva var veicināt smadzeņu šūnu normālu darbību, nodrošināt smadzenēm pietiekamu skābekļa un barības vielu daudzumu, kā arī padarīt smadzenes veselīgākas.
Otrkārt, fizioloģiskais šķīdums var veicināt signālu pārraidi starp smadzeņu neironiem un uzlabot smadzeņu mācīšanās spējas. Pētījumi liecina, ka uzdevumu apguves procesā fizioloģiskā šķīduma injekcija var būtiski uzlabot izglītojamo mācīšanās efektu, un uzlabot izglītojamo emocionālo stāvokli, mazināt mācīšanās trauksmi un stresu. Tajā pašā laikā fizioloģiskais šķīdums var arī palielināt neironu skaitu un neironu sarežģītību hipokampā, kas veicina atmiņas veidošanos un uzturēšanu.
Turklāt fizioloģiskais šķīdums var uzlabot smadzeņu vielmaiņas vidi un samazināt dažādu kaitīgo ietekmi uz smadzenēm, piemēram, bojājumus, bojājumus, išēmiju un hipoksiju. Tie ir faktori, kas var kaitēt smadzenēm, un fizioloģiskā fizioloģiskā šķīduma injekcija var uzlabot smadzeņu spēju tikt galā ar to un samazināt bojājumus, tādējādi uzlabojot smadzeņu atmiņu un domāšanas spēju.
Kopumā sāls šķīdums ir ideāla viela atmiņas uzlabošanai. Tam var būt vairākas pozitīvas ietekmes uz smadzenēm, tostarp palielinot neironu skaitu un sarežģītību, uzlabojot vielmaiņas vidi un veicinot signālu pārraidi starp neironiem. Tāpēc, ja mums ir jāuzlabo atmiņa, mēs varētu arī apsvērt fizioloģiskā šķīduma injicēšanu, lai nodrošinātu labāku aizsardzību un atbalstu mūsu smadzenēm. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot mūsu atmiņu, jo tā var arī regulēt neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni, kas ir ļoti svarīgi atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekamu uzturu un enerģiju, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.
Noklikšķiniet uz Zināt veidus, kā uzlabot atmiņu
4.13. ICH kolagenāzes izraisīts peles modelis
Kolagenāzes injekciju parasti izmanto, lai izraisītu ICH [60]. C57BL/6 peļu tēviņi (vecumā no 8 līdz 12 nedēļām) tika anestēzēti ar izoflurānu (2 līdz 5%) un novietoti uz stereotaksiskā rāmja.
Procedūras laikā katra dzīvnieka ķermeņa temperatūra tika uzturēta 37 ◦C ar homeotermisko segu. Izmantojot stereotaksisku instrumentu (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Ķīna) un šļirci (Hamilton Company, Reno, NV, ASV), tika iegūta 0,3 µLof kolagenāze (0).{12 }}45 SV Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) tika ievadīts taisnajā triatumā (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) ar plūsmas ātrumu 0,1 µL/min.
Kopā kontroles dzīvniekiem tika ievadīts 0,3 µL fizioloģiskā šķīduma. Visas ķirurģiskās procedūras tika veiktas aseptiskos apstākļos. Šajā pētījumā tika izmantoti vairāk nekā 66 peļu tēviņi, un dzīvnieki pirms katra eksperimenta tika nejauši iedalīti grupās [57].
4.14. Uzvedības analīze
Peļu neiroloģiskās uzvedības analīze pēc smadzeņu hematomas veidošanās tika noteikta ar līmlentes noņemšanas testu [61] un cilindru testu [60]. Līmējošās konusveida noņemšanas tests tika veikts, uzliekot līmlenti uz katras peles priekšķepas (labās un kreisās) stādīšanas zonas.
Katra pele tika ievietota jaunā būrī.
Laiks no lentes uzlikšanas līdz brīdim, kad pele to veiksmīgi noņēma, tika reģistrēts katrai ķepai. Katrai ķepai bija atļauts ne vairāk kā 300 s. Eksperimentu starplaikos dzīvnieki tika izmitināti savos mājas būros no patogēniem brīvā vietā.
Cilindra tests tika veikts, ievietojot peli caurspīdīgā akrila stikla cilindrā (diametrs: 8 cm; augstums: 25 cm) 2 spoguļu un kameras priekšā uz 5 minūtēm. Kamera tika novietota centrā 2 spoguļu un cilindra priekšā, lai iegūtu optimālu video.
Lai novērtētu neatkarīgu priekšējo kāju izmantošanu, tika novērtēta (1) peles spēja saskarties ar cilindra sieniņu ar vienu priekšējo kāju pilnas audzēšanas laikā un (2) peļu spēja piezemēties tikai ar vienu priekšējo kāju uz grīdas pēc pilnīgas audzēšanas. Izmantojot lēnu kustību, tika saskaitīti vismaz 20 kontaktpunkti katrai priekškājai.
Sākotnējās analīzes veikšanai pirms operācijas tests tika veikts divas reizes katrai pelei ar 1 h pārtraukumu starp izmēģinājumiem. Priekškājas tiek izteiktas kā labās un kreisās puses neatkarīgas priekškājas lietošanas attiecība.
4.15. Hematomas apjoma analīze
Lai noteiktu, vai ārstēšana samazināja hematomas apjomu, peles tika nogalinātas 5 dienas pēc ICH; smadzenes tika izņemtas un ātri sasaldētas AZT. Koronālās sekcijas tika sagrieztas 30 µm biezumā un novietotas tieši uz stikla priekšmetstikliņiem. Lai kvantitatīvi noteiktu hematomas tilpumu, sekcijas tika digitalizētas standartizētos koronālos līmeņos.
Akls lietotājs katrā sadaļā izmērīja kontūras un hematomu kreisajā un labajā puslodē. Hematomas tilpums un pietūkums tika mērīts un aprēķināts, izmantojot ImageJ (NIH).
Vismaz 5 smadzenēm katrā grupā tika veikti hematomas mērījumi, un hematoma tilpums tika mērīts visā smadzenēs.
4.16. Fluoro-Jade C krāsošana
Neirodeģenerācija pelēm pēc kolagenāzes izraisītas ICH tika novērtēta, krāsojot ar Fluoro-jade C Ready-to-Dilute krāsošanas komplektu (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Austrālija) saskaņā ar ražotāja protokolu [62].
Īsumā, kontroles peles un ICH peles (± ip peptīds) tika nogalinātas 5 dienas pēc modelēšanas, un smadzenes tika apstrādātas saskaņā ar protokolu, ko izmantoja imūncitoķīmijas eksperimentā.
Peldošās smadzeņu sekcijas uz 5 minūtēm tika iegremdētas 1% nātrija hidroksīda šķīdumā, 2 minūtes skalotas 70% etanolā un pēc tam 2 minūtes skalotas destilētā ūdenī. Pēc tam peldošās sekcijas tika iegremdētas 0, 06% kālija permanganāta šķīdumā (KMnO4 destilētā ūdenī) 10 minūtes.
Sekcijas tika mazgātas ar ddH2O, pirms tās 20 minūtes iegremdēja 0,0001% Fluoro-jade krāsošanas šķīdumā (Fluoro-jade C destilētā ūdenī), viegli kratot tumsā.
Sekcijas tika mazgātas ar ddH2O, uzstādītas uz pārklātiem priekšmetstikliņiem un žāvētas istabas temperatūrā nakti tumsā. Fluoro-Jade C krāsošana perihematomālajā reģionā tika pārbaudīta, izmantojot Zeiss LSM 880 konfokālo mikroskopu. Fluoro-jade Cstaining kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot ImageJ programmatūru.
4.17. Audu imunofluorescence
Audu imunofluorescences krāsošana tika veikta, izmantojot virkni 30-µm biezumu. Sekcijas tika inkubētas ar šādām primārajām antivielām: peles antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, ASV) vai peles anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, ASV) antivielām pie 4 ◦C nakti. Pēc mazgāšanas ar PBS sekcijas tika inkubētas ar Alexa Fluor 488-konjugētu ēzeļa anti-peles (1:1000; Invitrogen, A21202, Karlsbāda, Kalifornija, ASV) antivielu.
4.18. TUNEL tests
Lai identificētu apoptotiskas šūnas ar kodola DNS fragmentāciju smadzeņu perihematomālajā reģionā, tika izmantots terminālais dezoksinukleotidiltransferāzes mediētais dezoksiuridīna trifosfāta (dUTP) nick beigu marķēšanas (TUNEL) tests.
Krāsošana tika veikta, izmantojot komerciālu vienpakāpju TUNEL apoptozes testa komplektu (Beyotime, C1090, Nanjing, Ķīna), un tika veikta saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc audu imunofluorescences tika veikta TUNEL reakcija.
Smadzeņu sekcijas tika inkubētas ar TUNEL reakcijas maisījumu (1 h 37 ◦C), un pēc tam sekcijas tika mazgātas ar PBS un pretkrāsotas ar DAPI. NeuN-TUNEL krāsošanas līdzās lokalizācija tika pārbaudīta, izmantojot Zeiss LSM 880 konfokālo mikroskopu.
TUNEL pozitīvie neironi (NeuN pozitīvi) perihematomālajā reģionā striatuma iekšpusē tika kvantificēti, izmantojot ImageJ programmatūru, uz trim dažādiem attēliem uz vienu peli, kas uzņemti ar 20X objektīvu. GFAP-TUNEL krāsošanas kolokalizācija bija līdzīga NeuN-TUNEL krāsošanai.
4.19. In vivo asins-smadzeņu barjeras caurlaidības tests
In vivo asins-smadzeņu barjeras caurlaidības testi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš [63–65]. Īsumā, kontroles pelēm un ICH pelēm (±ip peptīds) intraperitoneāli injicēja ar FITC iezīmētu 4 kDa dekstrānu (100 µL 2 mM izejvielas PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, Sentluisa, MO, ASV). pēc modelēšanas 5 dienas, kam seko anestēzija 5 minūtes vēlāk.
Pēc 10 minūšu cirkulācijas laika marķieram dzīvnieki tika sagatavoti transkardiālai perfūzijai, un no krūškurvja dobuma tika savākti ~ 300 µl asiņu tūlīt pēc priekškambaru punkcijas, kam sekoja perfūzija 3 minūtes ar PBS. Pussmadzenes (bez ožas daivām, smadzenītēm un aizmugurējām smadzenēm) un viena niera tika savāktas un nekavējoties sasaldētas nešķidrā slāpeklī un uzglabātas –80 ◦C.
Fluorescences mērīšanai paraugus atkausēja ledū, nosvēra un homogenizēja PBS (400 µL pussloksnei un 600 µL nierēm), kam sekoja centrifugēšana 20 minūtes 4 ◦ C temperatūrā un 15, 000 × g.
Supernatanti (100 µL), kā arī vienādi tilpumi seruma (1/5 atšķaidījums PBS) tika ievietoti 96-iedobes melnajā plāksnē, un tika mērīta fluorescence pie atbilstošās ierosmes (490 nm)/emisijas (520 nm). ) plākšņu lasītājā (Tecan, Männedorf, Šveice). Autofluorescences vērtību atņemšanai tika izmantoti viltus dzīvnieki (bez tracerinjekcijas). Caurlaidības indekss (mL/g) tika aprēķināts kā audu RFU/g audu svara attiecība pret seruma RFU/ml seruma.
4.20. Fluorescējoša lektīna krāsošana
Lai vizualizētu smadzeņu mikrovaskulārus, mēs izmantojām ar fluoresceīnu konjugētu Lycopersicon esculentum lektīnu (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, ASV), lai 1 stundu iegremdētu sekcijas.
Sekcijas tika attēlotas ar Zeiss LSM 880 konfokālo mikroskopu ar 20 × objektīvu, un attēli tika apstrādāti ar 1, 3 gamma iestatījumu. Trīs attēli tika uzņemti no 3 iepriekš noteiktiem apgabaliem koronālo smadzeņu perihematomālajā reģionā. Akls pētnieks katrā smadzenēs kvantitatīvi noteica asinsvadu atzaru punktus. Atzarojuma punkts tika definēts kā viens ar fluoresceīnu iezīmēts asinsvads, kas manāmi atdalās 2 atšķirīgos un atsevišķos asinsvadu sliežu ceļus [66].
4.21. Statistiskā analīze
Visas eksperimentālās procedūras tika veiktas aklās un tika veiktas 3 reizes neatkarīgi, kā aprakstīts iepriekš [67]. Dati tiek parādīti kā vidējais ± SEM. Statistikas analīze tika veikta, izmantojot vienvirziena ANOVA, divvirzienu ANOVA un Studenta testu, izmantojot GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., Sandjego, CA, ASV). ) un SPSS programmatūras versija 20.0 (SPSS, Inc., Čikāga, IL, ASV).
Statistiskos parametrus var atrast attiecīgo attēlu leģendās. Statistiskā nozīmība tika iestatīta uz *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]
5. Secinājumi
Netrin-1 EGF3 domēnam ir izšķiroša nozīme Netrin-1 mijiedarbībā ar DCC, un tas var aktivizēt dažādus signalizācijas ceļus. Netrin-1 saīsinātais peptīds E1 (atlikumi 407–422) mijiedarbojas ar DCC, lai aizsargātu neironus no hemīna izraisītas toksicitātes.
Peptīda E1 pielietošana uzlabo funkcionālo atjaunošanos ICH eksperimentālajā modelī. Turklāt peptīds E1 var aizsargāt neironus no deģenerācijas un apoptozes pēc ICH.
Autora ieguldījums: konceptualizācija, LL, Z.-XH un X.-JZ; metodika, LL, K.-JL unJ.-BC; validācija H.-LY un X.-XH; izmeklēšana, X.-JZ; datu apkopošana, JY; resursi LL unZ.-XH; rakstot LL, Z.-XH un X.-JZ; uzraudzība, Z.-XH, X.-JZ; finansējuma iegūšana, Z.-XHand X.-JZ Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.
Finansējums: šo pētījumu finansēja Ķīnas Nacionālais dabaszinātņu fonds (31671065 un 32071018), Jilinas provinces Zinātnes un tehnoloģiju attīstības plāns (202520YY01017404).
Institucionālās pārskata padomes paziņojums: visas procedūras apstiprināja Ziemeļaustrumu Normālās universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (NENU/IACUC, AP2016200299). Ķīnas Tautas Republikas nacionālie standarti (GB/T 35892–2018), laboratorijas dzīvnieku vadlīnijas dzīvnieku labturības ētiskajam pārskatam, bija mūsu dzīvnieku aprūpes un protokolu vadlīnijas.
Paziņojums par informētu piekrišanu: Nav piemērojams.
Pateicības: Šo darbu atbalstīja Ķīnas Nacionālais dabaszinātņu fonds (31671065 un 32071018) un Dzjilinas provinces Zinātnes un tehnoloģiju attīstības plāns (202520YY01017404).
Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta. Finansētājiem nebija nekādas nozīmes pētījuma izstrādē; datu vākšanā, analīzē vai interpretācijā; rokraksta rakstīšanā vai lēmumā par rezultātu publicēšanu.
Atsauces
1. Kirshner, HS Intracerebrālās asiņošanas medicīniskā vadība: atpakaļ uz pamatiem. Int. Dž.Klins. Prakse. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]
2. Andersons, CS; Hīlijs, E.; Huangs, Y.; Van, Dž.; Stafs, C.; Delkūrs, K.; Lindlijs, R.; Robinsons, T.; Lavadoss, P.; Nīls, B.; et al. Strauja asinsspiediena pazemināšanās pacientiem ar akūtu intracerebrālu asiņošanu. N. Engl. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]
3. Qureshi, AI; Mendelovs, AD; Hanley, DF Intracerebrāla asiņošana. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]
4. Saglabāt, RF; Hua, Y.; Xi, G. Intracerebrālā asiņošana: traumu mehānismi un terapeitiskie mērķi. Lancet Neirol. 2012, 11 720–731. [CrossRef]
5. Šrāgs, M.; Kirshner, H. Intracerebrālās hemorāģijas vadība: JACC fokusa seminārs. J. Am. Coll. Kardiols. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]
6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Intracerebrālās asiņošanas ķirurģija. Neirovaskulārā ķirurģija Surgical Approaches for Neurovaskulārās slimības; jūlijs, J., Wahjoepramono, EJ, Eds.; Springer: Singapūra, 2019; 201.–210.7.lpp. Broughton,
7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Apoptotiskie mehānismi pēc smadzeņu išēmijas. Insults 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]
8. Kristiansens, M.; Grāversens, JH; Džeikobsens, C.; Sonne, O.; Hofmans, HJ; Likums, SK; Moestrup, SK Hemoglobīna uztvērēja receptora identifikācija. Daba 2001, 409, 198–201. [CrossRef]
9. Madangarli, N.; Bonsaks, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Intracerebrālā asiņošana: asins komponenti un neirotoksicitāte. Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]
10. Deiners, MS; Kenedijs, TE; Fāzeli, A.; Serafini, T.; Tesjē-Lavinja, M.; Sretavan, DW Netrin-1 un DCC mediē aksonu lokāli pie redzes diska: funkcijas zudums izraisa redzes nerva hipoplāziju. Neuron 1997, 19, 575–589. [CrossRef]
11. Kenedijs, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrins ir difūzie chemotropic faktori commissural axonsin embrionālo muguras smadzenēs. Cell 1994, 78, 425–435. [CrossRef]
12. Flores, C. Netrīna-1 loma mezokortikolimbiskās dopamīna sistēmas organizācijā un darbībā. J. Psychiatry Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
