1. daļa Akteozīds nomāc RANKL mediētu osteooklastoģenēzi, kavējot C-Fos indukciju un NF-kB ceļu un vājinot ROS veidošanos

1. daļa Kā akteozīdi veicina kaulu augšanu?

Plašāka informācija:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Čonbukas Nacionālās universitātes Klīniskās medicīnas pētniecības institūts, Čonbukas Nacionālās universitātes Biomedicīnas pētījumu institūts Slimnīca, Jeonju, Chonbuk, Dienvidkoreja, 2 Ortodontijas nodaļa, Mutes biozinātņu institūts un Zobārstniecības skola, Čonbukas Nacionālā universitāte, Jeonju, Chonbuk, Dienvidkoreja, 3 Bioaktīvo materiālu zinātņu nodaļa, Bioaktīvo materiālu pētniecības centrs, Chonbuk National University, Jeonju, Čonbuka, Dienvidkoreja

Abstrakts

Daudzos pētījumos ir ziņots, ka iekaisuma citokīni ir svarīgi osteoklastoģenēzes mediatori, tādējādi izraisot pārmērīgu kaulu rezorbciju un osteoporozi.AkteozīdsRehmannia glutinosa galvenajam aktīvajam savienojumam, ko plaši izmanto tradicionālajā austrumu medicīnā, ir pretiekaisuma un antioksidanta potenciāls. Šajā pētījumā mēs atklājām, ka CTE puse ievērojami kavē osteoklastu diferenciāciju un veidošanos no kaulu smadzeņu makrofāgiem (BMM) un RAW264.7 makrofāgiem, ko stimulē kodolfaktora-kappaB (NF-kB) liganda (RANKL) receptoru aktivators. Iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu no devas atkarīgā veidā novērsa arī kaulu rezorbciju no nobriedušiem osteoklastiem. Akteozīds (10 mM) novājināja RANKL stimulētu p38 kināzes, ekstracelulāro signālu regulēto kināžu un c-Jun N-termināla kināzes aktivāciju, kā arī nomāca NF-kB aktivāciju, inhibējot p65 apakšvienības un inhibitora kBa fosforilāciju. Turklāt RANKL izraisīta c-Fos un aktivēto T-šūnu kodolfaktora, citoplazmas 1 (NFATc1) ekspresijas palielināšanās un audzēja nekrozes faktora-a, interleikīna (IL)-1b ražošanas palielināšanās. , un IL-6 acīmredzot tika inhibēta iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu. Turklāt perorālais akteozīds samazināja ovariektomijas izraisīto kaulu zudumu un iekaisuma citokīnu veidošanos līdz kontroles līmenim. Mūsu dati liecina, kaakteozīdskavē osteoklastu diferenciāciju un nobriešanu no osteoklastu prekursoriem, nomācot RANKL izraisītu mitogēnu aktivētu proteīnkināžu un transkripcijas faktoru, piemēram, NF-kB, c-Fos un NFATc1, aktivāciju. Kopumā šie rezultāti liecina, kaakteozīdsvar darboties kā pretresorbcijas līdzeklis, lai samazinātu kaulu masas zudumu, bloķējot osteoklastu aktivāciju.

Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, sazinieties ar:ali.ma@wecistanche.com

Noklikšķiniet uz Cistanche efektu produktiem

Ievads

Kaulu pastāvīgi pārveido līdzsvarota osteoklastu un osteoblastu aktivitāte [1]. Osteoklasti rodas no monocītu/makrofāgu līnijas asinsrades prekursoru šūnām, savukārt osteoblasti ir no mezenhimālās līnijas [2]. Patoloģiska osteoklastu aktivācija vai samazināta osteoblastoģenēze var izjaukt kaulu homeostāzi, galu galā izraisot tādas slimības kā osteoporoze, artrīts un kaulu vēzis [3,4]. Osteoporoze ir izplatīta kaulu slimība, kas palielina lūzumu risku. Visbiežāk sastopamo osteoporozes veidu izraisa estrogēna deficīts sievietēm menopauzes periodā. Tādi medikamenti kā kortikosteroīdi un pretepilepsijas līdzekļi var izraisīt arī nelīdzsvarotību starp kaulu rezorbciju un veidošanos, kas var izraisīt osteoporozi [5]. Osteoporozes ārstēšanai ir izmantoti daudzi anti-rezorbcijas inhibitori, tostarp bisfosfonāti, kalcitonīns, estrogēns un selektīvie estrogēnu receptoru modulatori. Šie inhibitori uztur kaulu masu, inhibējot osteoklastu funkciju [6]. Estrogēnu aizstājterapija ir vispopulārākais līdzeklis pēcmenopauzes osteoporozes profilaksei un ārstēšanai. Tomēr ilgstoša estrogēnu aizstājterapija var palielināt endometrija un krūts vēža risku. Tāpēc daudzi pētnieki ir koncentrējuši savus centienus uz jauna pretresorbcijas līdzekļa izstrādi, kam nav blakusparādību [7–10]. Tā kā osteoklasti darbojas kaulu rezorbcijā, daudzos pētījumos par galveno mērķi tika uzskatīta specifiska osteoklastu inhibīcija. Osteoklasti ir daudzkodolu milzu šūnas, ko veido monocītu/makrofāgu dzimtas mononukleārie priekšteči, secīgi proliferējot, diferencējot un saplūstot hematopoētiskās prekursoru šūnas [11]. Makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (M-CSF) un kodolfaktora (NF)-kB (RANK) liganda (RANKL) receptoru aktivators ir būtiski faktori osteoklastu diferenciācijai[12]. Turklāt vairāki iekaisuma citokīni, piemēram, audzēja nekrozes faktors (TNF) un interleikīns (IL)-1b, veicina osteoklastoģenēzi, modulējot RANKL, osteoprotegerīna un M-CSF indukciju [7,13]. RANKL saistīšanās ar šūnu virsmas RANK receptoru rada RANKL/RANK/TNFR saistīto faktoru (TRAF) kompleksus, kas secīgi aktivizē NF-kB un mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK), tostarp c-Jun N-termināla kināzi (JNK), p38. kināze un ar ekstracelulāro signālu saistītā kināze (ERK) [14]. Šai aktivācijai ir galvenā loma osteoklastu diferenciācijas, aktivācijas un izdzīvošanas starpniecībā. RANKL aktivizē arī tādu transkripcijas faktoru ekspresiju kā aktivēto T-šūnu kodolfaktors, citoplazmas 1 (NFATc1) un-Fos, kas ir būtiski osteoklastu attīstībai. 7,9]. Tāpēc RANKL signalizācija tiek uzskatīta par galveno antiresorbcijas līdzekļu mērķi, kas nomāc osteoklastu aktivāciju un kaulu zudumu.

Akteozīdsir galvenais Rehmannia glutinosa aktīvais savienojums, ko plaši izmanto tradicionālajā austrumu medicīnā [15,16]. Akteozīds ir spēcīgs antioksidants, un tam ir antihepatotoksiska, pretiekaisuma un antinociceptīva iedarbība [17–20]. Mēs to atradām iepriekšakteozīdssamazina tirozināzes aktivitāti un melanīna biosintēzi, regulējot ERK signālu pārraidi [21], aizsargā pret reaktīvo skābekļa sugu (ROS) izraisītiem smaganu bojājumiem[22] un nomāc mikotoksīnu izraisītus šūnu bojājumus [23]. Šīs sekas ir cieši saistītas arakteozīdsspēja noņemt ROS un regulēt MAPK mediētu signalizāciju. Jo īpaši ROS ir ierosināts kā mediators RANKL izraisītos signalizācijas ceļiem un šūnu notikumiem osteoklastos. Iepriekšēja apstrāde ar antioksidantiem inhibēja RANKL izraisītu NF-kB, ERK un IkBa aktivāciju, tādējādi nomācot osteoklastoģenēzi [24]. Šie atklājumi stingri liecināja, ka papildus pretiekaisuma aktivitātei antioksidanta aktivitātei ir izšķiroša nozīme pretresorbcijas līdzekļa darbībā, tādējādiakteozīdsvar nomākt RANKL izraisītu osteoklastoģenēzi.

Šajā pētījumā mēs izpētījām, vaiakteozīdsir terapeitiska iedarbība uz kaulu zudumu. Mēs pārbaudījām sekasakteozīdspar osteoklastu diferenciāciju un kaulu rezorbciju un saistītajiem šūnu mehānismiem, izmantojot in vitro un in vivo eksperimentālās sistēmas.

Materiāli un metodes

Ētikas paziņojums

Dzīvnieku kopšanas un izmantošanas praksi apstiprināja Čonbukas Nacionālās universitātes laboratorijas dzīvnieku kopšanas un izmantošanas ētikas komiteja (atļaujas Nr. CBU 2010-0007). Visi eksperimenti šajā pētījumā tika veikti saskaņā ar Universitātes Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komitejas vadlīnijām.

Peles, ķimikālijas un laboratorijas izstrādājumi

Četras nedēļas vecas ICR peļu mātītes tika iegādātas no OrientBio Inc. (Seula, Koreja) un tika izmitinātas 2261 uC un 5565 procentu mitruma apstākļos 12 stundu gaismas/tumsas ciklā ar brīvu piekļuvi pārtikai un ūdenim. Akteozīds (3,4-dihidroksi-b-fenetil-Oa-ramnopiranoze-Syl-(1R3)-4-O-kafeoil-bD-glikopiranozīds; C29H36O15) (S1. att.) tika izolēts no Rehmannia glutinosa. Pirms lietošanas akteozīds tika izšķīdināts ar fosfātu buferšķīdumā (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 un M-CSF tika iegādāti no pētniecības un attīstības sistēmām (Mineapolisa, MN, ASV). Antivielas, kas raksturīgas c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa un b-aktīnam, tika iegūtas no Santa Cruz Biotechnology (Santakrusa, CA, ASV). ). Antivielas pret p-p38 un p38 tika iegādātas no Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ASV). Lai noteiktu seruma bioķīmiskos parametrus, CalciumAssay un Osteocalcin (OC) EIA komplekti tika iegādāti attiecīgi no BioAssay Systems (Hayward, CA, ASV) un Biomedical Technologies (Stoughton, MA, ASV). Lai noteiktu TRAP5b līmeni serumā, tika izmantots arī peles tartrāta rezistences skābes fosfatāzes (TRAP) testa komplekts (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, ASV). Ja vien nav norādīts citādi, papildu ķīmiskās vielas tika iegūtas no Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ASV), bet laboratorijas izstrādājumi tika iegūti no SPL Life Sciences (Pochun, Dienvidkoreja).

Šūnu kultūras

Kaulu smadzeņu šūnas tika iegūtas no 6 nedēļas vecu mātīšu ICR peļu stilba kauliem un augšstilba kauliem saskaņā ar iepriekš aprakstītajām metodēm [25]. Kaulu smadzeņu suspensija tika inkubēta 100-mm kultivēšanas traukā 50 ng/ml M-CSF klātbūtnē. Pēc 3 dienām pielipušās šūnas tika izmantotas kā kaulu smadzeņu makrofāgi (BMM), lai izraisītu osteoklastisko diferenciāciju. Dažas kaulu smadzeņu šūnas arī tika inkubētas 48 stundas bez M-CSF, un pielipušās šūnas tika kultivētas osteoblastu diferencējošā barotnē, kā aprakstīts citur [25]. RAW264.7 makrofāgu šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (DMEM), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (FBS), 2 mM L-glutamīnu un antibiotikām. Šīs šūnas tika izmantotas kā līdzvērtīga šūnu līnija BMM, lai izpētītu akteozīda ietekmi uz osteoklastoģenēzi.

Osteoklastiskā diferenciācija un TRAP krāsošana

BMM tika iepriekš apstrādāti ar dažādu koncentrāciju (0–50 mM) akteozīdu 2 stundas pirms stimulēšanas ar 100 ng/ml RANKL. Barotne tika aizstāta ar svaigu barotni 2. un 5. dienā. Pēc 7 dienu inkubācijas kultūras tika fiksētas 4% ar PBS buferētā paraformaldehīdā un iekrāsotas ar TRAP, izmantojot sigma Aldrich komplektu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. TRAP pozitīvās šūnas tika skaitītas, izmantojot optisko mikroskopiju, un šūnas, kas satur 3 vai vairāk kodolus, tika uzskatītas par osteoklastiem. RAW 264.7 šūnas tika pakļautas arī 100 ng/ml RANKL iedarbībai pēc 2 stundu ilgas pirmapstrādes ar akteozīdu un pēc 7 dienu inkubācijas, šūnas tika apstrādātas TRAP krāsošanai.

Šūnu dzīvotspējas mērīšana

Šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot ūdenī šķīstošo tetrazolija sāli (WST)-8 reaģentu. Īsāk sakot, BMM vai RAW264.7 šūnas, kas kultivētas augšanas barotnē, kas satur 10 procentus FBS un antibiotikas, tika apstrādātas ar 10 mM akteozīdu vai fenola savienojumu, piemēram, kvercetīnu, luteolīnu, apigenīnu vai epigallokatehīna -3-galātu (EGCG). WST-8 reaģents tika pievienots kultūrām pēc 48 h inkubācijas. Pēc papildu 4 stundu inkubācijas WST{10}}īpatnējā absorbcija tika mērīta pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, ASV).

Kaulu rezorbcijas tests

BMM (16 105 šūnas/ml) tika suspendēti a-MEM, kas satur 50 ng/ml M-CSF un 100 ng/ml RANKL, pēc tam sadalīti pa 24-iedobes plāksni, kas pārklāta ar kalcija fosfāta nanokristāliem (OAAS{{6}). }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Dienvidkoreja) ar blīvumu 26104 šūnas/cm2 ar un bez akteozīda. Pēc 7 dienu inkubācijas šūnas tika izņemtas no plāksnēm ar 5% nātrija hipohlorītu, un informācija tika novērota optiskā mikroskopā. Resorbētais laukums tika mērīts arī ar attēla analizatoru un izteikts procentos no kontroles vērtības.

Western Blot analīze

Veseli olbaltumvielu lizāti tika sagatavoti līzes buferšķīdumā, kā aprakstīts citur [26]. Citosola un kodolproteīni tika sagatavoti, kā aprakstīts iepriekš [25]. Vienāds daudzums olbaltumvielu ekstrakta tika atdalīts ar 12–15% SDS-PAGE un blotēts uz polivinildifluorīda membrānām. Bloti tika pārbaudīti ar primārajām antivielām nakti 4 ° C temperatūrā pirms inkubācijas ar sekundāro antivielu bloķēšanas buferšķīdumā 1 stundu. Bloti tika izstrādāti ar pastiprinātu hemiluminiscenci (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Bekingemšīra, Apvienotā Karaliste) un pakļauti rentgena plēvei (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, ASV).

MAPK aktivitātes tests

Šūnas tika iepriekš apstrādātas ar akteozīdu 2 stundas un pēc tam stimulētas ar RANKL vēl -30 min. MAPK aktivitātes tika noteiktas, izmantojot imunometrisko testu komplektus, piemēram, p-p38kināzes testu komplektu (Assay Designs, Inc., MI, ASV), p-ERK enzīmu testa komplektu (Assay Designs) un p-SAPK/JNK sendviča ELISA komplektu ( Šūnu signalizācijas tehnoloģija, MA, ASV). Visas procedūras ievēroja ražotāja norādījumus, un absorbciju mēra ar mikroplašu lasītāju.

Elektroforētiskās mobilitātes maiņas tests (EMSA)

DNS-olbaltumvielu saistīšanās reakcijas tika veiktas 30 minūtes istabas temperatūrā ar 10–15 mg proteīna 20 ml buferšķīdumā, kas satur 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 procentus glicerīna. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM [a-32P] dCTP iezīmēto oligonukleotīdu un Klenova fragmenta DNS polimerāzes. Paraugi tika atdalīti uz 6 procentu poliakrilamīda gēliem, kas tika žāvēti un pakļauti rentgena plēvei (Eastman Kodak Co.) 12–24 stundas 270 ° C temperatūrā. NF specifiskās oligonukleotīdu praimeru sekvences bija 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 un 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB luciferāzes tests

RAW264.7 makrofāgi 24-iedobju plāksnēs tika transficēti ar 0,8 mg kB-luciferāzes reportiera vektoru, izmantojot 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. 24 stundas pēc transfekcijas šūnas tika stimulētas ar RANKL akteozīda klātbūtnē un bez tā 24 stundas. Šūnas tika atkārtoti suspendētas 100 ml reportiera līzes buferšķīdumā (Promega, Madison, WI, ASV). Vienādos daudzumos olbaltumvielu paraugi tika ievietoti 96-iedobju mikroplatēs un sajaukti ar luciferāzes substrātu. Luminescence tika mērīta, izmantojot mikroplates luminometru (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Vācija). Šajā eksperimentā kā pozitīvs kB inhibitors tika izmantots caurlaidīgs NF-B inhibitora peptīds (BIOMOL, Butler Pike, PA, ASV).

Citokīnu mērīšana

BMM vai RAW264.7 šūnas tika stimulētas ar RANKL klātbūtnēakteozīds24-akas kultūras plāksnēs. Pēc 48 h inkubācijas kultūras supernatanti tika savākti un novērtēti ar ELISA metodi, izmantojot TNF-a-, IL-1b- un IL-6- specifiskus OptEIATM komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Reāllaika reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcija (RT-PCR)

Osteoklastisko marķieru, piemēram, c-Fos, NFATc1 un TNF-a, mRNS ekspresija tika noteikta ar reāllaika RT-PCR. Īsumā, kopējā RNS tika ekstrahēta no makrofāgiem ar Trizolreagent saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Invitrogen). cDNS tika sintezēta ar 1 mg kopējās RNS, izmantojot SuperScriptReverse Transcripatase II un praimerus (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, ASV) tika izmantots, lai noteiktu PCR produkta uzkrāšanos cikliskuma laikā ar ABI 7500 sekvences noteikšanas sistēmu (pielietots, izmantojot četrdesmit 3-pakāpju denaturēšanas ciklus 95 uC temperatūrā. 15 sek., atkvēlināšana 60 uC 1 sek. un pagarināšana pie 72 uC 30 s. Visas PCR reakcijas tika veiktas vismaz trīs eksemplāros, un ekspresijas līmeņi tika normalizēti atbilstoši mājturības gēnamHPRT tajā pašā reakcijā. Šajā pētījumā tika izmantotas tās pašas aprakstītās praimeru sekvences. citur [7].

Intracelulārās ROS mērīšana

29,79-dihlordihidrofluoresceīna diacetāta (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmštate, Vācija) izejas šķīdumu sagatavoja DMSO un uzglabāja 220 uC tumsā. Īsāk sakot, BMM (106 šūnas/ml 6-iedobju plāksnēs) tika kultivēti ar 50 ng/MLM-CSF 24 stundas un pēc tam apstrādāti ar dažādu koncentrāciju (0–10 mM) akteozīdu 2 stundas pirms stimulēšanas ar 100 ng/mlRANKL. Pēc 1 stundas ilgas inkubācijas šīs šūnas pēc tam 30 minūtes inkubēja ar 25 mM DCFH-DA. 29,79-dihlorfluoresceīna (DCF) zaļā fluorescence tika reģistrēta pie 515 nm (FL 1), izmantojot FACS VantageH sistēmu (Becton-Dickinson, Sanhosē, CA, ASV), un 10,000 notikumus. tika skaitīti katram paraugam

Ovariektomijas izraisītas osteoporozes indukcija

Šajā pētījumā tika izmantotas ICR peļu mātītes (6 nedēļas vecas). Pelēm anestēzijā tika veikta fiktīva operācija (Sham, n=10) vai ķirurģiska olnīcu izņemšana (OVX, n=20). Nedēļu pēc operācijas OVX peles tika nejauši sadalītas 2 grupās pa 10 pelēm katrā: divpusējs OVX un divpusējs OVX, kas papildināts ar 200 ml PBS, kas satur 1 mM akteozīda iekšķīgi (AC grupa). Mutiskiakteozīdstika ievadīts reizi 3 dienās 8 nedēļas pēc operācijas, un tāds pats daudzums PBS tika ievadīts viltus un OVX grupām. Pēc 1 dienas pēc pēdējās ievadīšanas peles tika nogalinātas un pēc tam tika analizēti bioķīmiskie parametri serumā un 3-dimensiju kaulu struktūra.

Seruma bioķīmisko parametru noteikšana

Asins paraugi tika savākti ar sirds punkciju, un serums tika savākts ar centrifugēšanu. Seruma paraugi tika uzglabāti 280 uC bioķīmisko parametru analīzei. IL-1b un IL-6 līmenis serumā tika noteikts, izmantojot ELISA komplektu, kā aprakstīts iepriekš, savukārt sārmainās fosfatāzes (ALP) aktivitāte tika noteikta, izmantojot bioķīmisko kolorimetrisko testu, kas mēra p daudzumu. -nitrofenols, kas ražots no p-nitrofenola fosfāta substrāta, kā aprakstīts citur [27]. Lai novērtētu kaulu veidošanās un rezorbcijas biomarķierus, saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika noteikts arī seruma OC, kalcija un TRAP5b līmenis.

Kaulu struktūras un morfometrisko parametru analīze

Peļu augšstilba kauls (Sham, OVX un AC grupas) tika izgriezts un piepildīts ar fizioloģisko fizioloģisko šķīdumu mehāniskai pārbaudei. Ciskas kaula mehāniskā izturība tika mērīta, kā aprakstīts citur [28]. Lūzuma slodze tika reģistrēta kā maksimālais spēks ņūtonos vietā, kur labā augšstilba kaula lūzuma vidusdaļa. Turklāt katra dzīvnieka gaismas augšstilba kauls tika histomorfometriski analizēts, izmantojot mikrodatortomogrāfijas (mikro-CT) sistēmu (SkyScan 1076 mikrofokusa rentgena sistēma, Kontich, Beļģija). Īsāk sakot, kauli 4% formaldehīda krātuvē tika virspusēji žāvēti uz papīra salvetēm, pirms tie tika ietīti plastmasas "pielipšanas plēvē" vai paraplēvē, lai novērstu izžūšanu skenēšanas laikā. Katrs plastmasas iesaiņotais kauls tika ievietots plastmasas / putupolistirola caurulēs, kas tika uzstādītas vertikāli horizontāli 1076 skenera parauga kamerā mikro-CT attēlveidošanai. Skenēšana tika veikta, izmantojot 100 kV avota spriegumu un 140 mA avota strāvu ar 35 mm izšķirtspēju. Ciskas kaula trabekulāro kaulu trīsdimensiju modeļi tika rekonstruēti, izmantojot SkyScan CT Analyzer versiju 1.11. Strukturālie parametri, piemēram, trabekulārā kaula minerālais blīvums (KMB, g/cm3), kaula tilpuma procenti (kaulu tilpums (BV)/audu tilpums (TV), procenti), biezums (Tb.Th, mm), atdalīšanās (Tb.Sp) , mm) un skaits (Tb.N, 1/mm) tika izmērīts.

Osteogēnās diferenciācijas un mineralizācijas tests

Kaulu smadzeņu šūnas, kas kultivētas 6-iedobju kultūras plāksnēs, tika apstrādātas ar DAG (10 nM deksametazons, 50 mM askorbīnskābe un 20 mM b-glicerofosfāts) 10 mM klātbūtnē.akteozīds. Pēc 2 nedēļu diferenciācijas šūnas 1 stundu fiksēja ar ledusaukstu 70 procentu (tilp./tilp.) etanolu un 30 minūtes telpā krāsoja ar 0,2 procentiem alizarīna sarkanā Sin destilētu ūdeni. temperatūra. Pēc tam, kad šūnas tika attīrītas un žāvētas gaisā, šūnu kultūras plāksnes tika novērtētas ar gaismas mikroskopiju, izmantojot apgrieztu mikroskopu (Nikon TS100, Japāna). Lai kvantitatīvi noteiktu sarkanās krāsas daudzumu, traipu eluēja ar 10% acetilpiridīnija hlorīdu, kratot 20 minūtes, un absorbcija tika mērīta pie 560 nm. Arī šūnu slāņos nogulsnētā kalcija daudzums tika mērīts, izmantojot Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japāna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Turklāt kaulu specifisko mRNS marķieru, piemēram, ar runtu saistītā transkripcijas faktora -2(Runx2), osterix, kaulu sialoproteīna (BSP) un OC, ekspresija tika noteikta ar reāllaika RT-PCR. Šo marķieru oligonukleotīdu praimeri tika izstrādāti ar produktu izmēriem, kas mazāki par 200 bp, izmantojot PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems), kā aprakstīts citur[27].

Statistiskā analīze

Ja nav norādīts citādi, visi dati ir izteikti kā 3 vai vairāku neatkarīgu eksperimentu vidējā6 standartnovirze (SD). Vienvirziena ANOVA tika izmantota vairākiem salīdzinājumiem, izmantojot SPSS versiju 12.0 programmatūru. P vērtība 0,05 tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.

Rezultāti

Akteozīds inhibē makrofagezīna izraisītu osteoklastu veidošanos atkarībā no devas

Lai pārbaudītu akteozīda ietekmi uz BMM diferenciāciju par osteoklastiem, šūnas tika kultivētas ar dažādām akteozīda koncentrācijām (0–20 mM) 7 dienas 50 ng/ml M-CSF un 100 ng/ml klātbūtnē. RANKL. Akteozīds samazināja osteoklastu skaitu atkarībā no devas. Kad šūnas tika iepriekš apstrādātas ar 10 mM akteozīdu 2 stundas, osteoklastu skaits samazinājās par 43 procentiem, salīdzinot ar šūnām, kas papildinātas ar M-CSF un RANKL (1. att.). 1.B attēlā parādīta RANKL mediētā osteoklastu diferenciācija un tās inhibīcija, kombinējot ārstēšanu ar akteozīdu. Atbilstoši šim rezultātam iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu samazināja RANKL stimulēto RAW264.7 šūnu diferenciāciju un osteoklastu veidošanos (1.C un D attēls). Salīdzinot akteozīda antiosteoklastisko potenciālu uz BMM ar vairāku fenola savienojumu anti-osteoklastu potenciālu vienā un tajā pašā koncentrācijā (10 mM), luteolīns uzrādīja vislielāko aktivitāti (2.A att.). Tomēr pats luteolīns, kvercetīns vai apigenīns samazināja šūnu dzīvotspēju (2.B att.). Visi savienojumi inhibēja osteoklastisko diferenciāciju ar RAW264.7 makrofāgiem ar šādām relatīvajām aktivitātēm: luteolīns. kvercetīns=apigenīns .EGCG=akteozīds (2. att. C). Luteolīns, kvercetīns vai pats apigenīns arī uzrādīja samazinātu šūnu dzīvotspēju (2. D attēls). Turpretim apstrāde ar kvercetīnu tikai izraisīja būtisku dzīvotspējas samazināšanos gan BMM, gan RAW264.7 šūnās, kad šīs šūnas tika pakļautas 10 mM katra savienojuma 2 dienas ar 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, vai abi (dati nav parādīti). Kad šo savienojumu koncentrācija ir nepieciešama, lai inhibētu 50 procentus no

osteoklastu veidošanās BMM (IC50) tika aprēķināta, izmantojot koncentrācijas-aktivitātes līknes, IC50akteozīds, kvercetīns, luteolīns, apigenīns un EGCG bija attiecīgi 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 un 6,6 mM (2. E attēls). Šis rezultāts bija līdzīgs gadījumam, kad tika pārbaudīti RAW264.7 makrofāgi. Šie dati liecināja, ka luteolīnam un kvercetīnam bija augstākas antiklastogēnas aktivitātes nekā akteozīdam. Turpretim kvercetīnam pie IC50 bija arī viegla toksiska iedarbība uz šūnām (dati nav parādīti).

Akteozīds inhibē makrofāgu kaulu rezorbciju

Akteozīds arī novērsa RANKL izraisītu kaulu rezorbciju atkarībā no devas, ko mēra ar in vitro modeļa sistēmu (3.A att.). Kaulu rezorbcija tika ievērojami kavēta, kad BMM inkubēja ar 1 mM akteozīdu (3.B att.). A 10 mMakteozīdsārstēšana gandrīz pilnībā vājināja RANKL izraisīto informāciju ar BMM. Līdzīgi akteozīds samazināja kaulu rezorbciju RANKL stimulētajās RAW264.7 šūnās (S2A un B att.). Akteozīda spēja kavēt kaulu rezorbciju bija atkarīga no ārstēšanas laika, salīdzinot ar RANKL stimulāciju. Akteozīds (10 mM), kas pievienots 4 dienas pēc RANKL stimulācijas, nesamazināja informāciju KMM, bet nomāca izveidoto osteoklastu skaitu (3. C attēls). Šis atšķirīgais rezultāts daļēji bija saistīts ar bedres laukumu, kas jau izveidojās pēc 4 dienām ilgas RANKL stimulācijas veidošanās (3. att.).

Acteoside Down-regulē agrīnos RANKL signalizācijas ceļus

RANKL izraisa 3 labi zināmu MAPK un NF-kB aktivāciju osteoklastu prekursoros, un šī aktivizēšana ir nepieciešama agrīnai osteoklastu diferenciācijai. Lai saprastu iespējamos mehānismus, ar kuriem akteozīds inhibē osteoklastoģenēzi, mēs pētījāmakteozīdspar MAPK un NF-B aktivāciju makrofāgos. BMM un RAW264.7 šūnas tika iepriekš apstrādātas ar 10 mM akteozīdu 2 stundas un pēc tam stimulētas ar 100 ng / ml RANKL 30 minūtes. MAPK fosforilācija tika pārbaudīta ar Western blotēšanu un imunometrisko analīzi. RANKL izraisīja p38, ERK un JNK fosforilāciju BMM (4.A att.) un RAW264.7 šūnās (4.B att.). Akteozīds novērsa šo RANKL izraisīto p-p38, p-ERK un p-JNK pieaugumu. Šo rezultātu apstiprināja imunometriskā analīze, kas iepriekš apstrādāja ar 10 mMakteozīdsbūtiski inhibēja fosforilēto MAPK līmeni šajos makrofāgos (4.C att.). Ārstēšana ar RANKL palielināja NF-kB saistīšanos ar DNS, bet akteozīds inhibēja RANKL izraisītu NF-kB-DNS saistīšanās aktivāciju (5.A attēls). Šī inhibīcija bija izteiktāka BMM nekā RAW264.7 šūnās. Akteozīds arī mazināja RANKL stimulēto p65 un IkBa fosforilāciju BMM un RAW264.7 šūnās (5.B un C att.). 10 mMakteozīda pievienošana gandrīz pilnībā kavēja gan IkBa noārdīšanos, gan aktivizēšanos BMM (5.B att.). Lai vēl vairāk apstiprinātu, ka NF kB aktivācija ir iesaistīta akteozīda darbībā, kB promotora-luciferāzes konstrukcijas tika īslaicīgi transfekētas RAW264.7 šūnās. Šūnām, kas inkubētas ar 100 ng/ml RANKL, bija 3- reizes lielāka kB promotora aktivitāte, ko ievērojami vājināja 10 mM akteozīds (5. att.).

Akteozīds nomāc iekaisuma citokīnu veidošanos un TNF-a, c-Fos un NFATc1 ekspresiju RANKL stimulētos makrofāgos

TNF-a, IL-1b un IL-6 ir svarīgas osteoklastu veidošanā un funkcijās, ko mediē NF-kB signalizācija RANKL stimulētos makrofāgos. RANKL stimulēja šo citokīnu veidošanos, un šī ražošana tika ievērojami samazināta par 10 mMakteozīdspirmapstrāde BMM (6.A att.). Līdzīgi akteozīds mazināja RANKL izraisīto citokīnu, izņemot IL-6, ražošanu RAW264.7 makrofāgos (S3. att.). Lai izprastu akteozīda iedarbības molekulāros mehānismus osteoklastoģenēzē, mēs tālāk pētījām akteozīda ietekmi uz TNF-a, c-Fos un NFATc1 ekspresiju. RANKL regulēja šo faktoru mRNS ekspresiju BMM un RAW264.7 šūnās (6.B un C att.). Iepriekšēja apstrāde ar 10 mM akteozīdu ievērojami kavēja RANKL izraisīto šo faktoru ekspresiju abos gadījumos

BMM un RAW264.7 šūnas. Iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu arī ievērojami samazināja c-Fos un NFATc1 proteīna līmeni RANKL stimulētajos BMM (6. D attēls). Šie rezultāti liecina, ka akteozīds samazina RANKL inducējošos osteoklastu veidošanās mediatorus gēnu un olbaltumvielu līmenī.

Akteozīds samazina intracelulāro ROS ģenerāciju BMM atkarībā no devas Tā kā ir zināms, ka intracelulārā ROS ražošana ir saistīta ar RANKL stimulētu osteoklastoģenēzi, mēs pētījām, vai akteozīds kavē ROS veidošanos RANKL mediētās osteoklastu diferenciācijas laikā, izmantojot šūnu oksidējošo caurlaidību. , DCFH-DA. Plūsmas citometrijas analīze parādīja, ka vidējais fluorescences signāls, kas raksturīgs DCF BMM, pēc stimulācijas ar RANKL bija acīmredzami nobīdīts pa labi, salīdzinot ar neapstrādātajām kontroles šūnām (7.A att.). Šī maiņa bija līdzīga gadījumam, kad pēc RANKL stimulācijas tika novēroti RAW264.7 makrofāgi (dati nav parādīti). BMM apstrāde ar akteozīdu samazināja DCF signāla intensitāti atkarībā no devas. Iepriekšēja apstrāde ar 10 mM akteozīdu gandrīz pilnībā samazināja intracelulāro ROS līmeni, kas radās osteoklastu diferenciācijas laikā, līdz neapstrādātajiem kontroles līmeņiem (7.B att.).

Perorāla akteozīda ievadīšana kavē osteoporozes bioķīmisko marķieru izmaiņas un kaulu zudumu pelēm ar olnīcu izņemšanu

Lai izpētītu akteozīda ietekmi uz kaulu masas zudumu, mēs sagatavojām osteoporozes dzīvnieku modeli ar ovariektomiju. Eksperimenta periodā bija ievērojama ķermeņa svara atšķirība starp OVX un Shammice (dati nav parādīti). Grupai bija ievērojami augstāks IL{0}}b un IL-6 līmenis serumā nekā viltus grupā (8. attēls). Ovariektomijas izraisīto šo iekaisuma citokīnu palielināšanos mazināja perorāla akteozīda ievadīšana (AC grupa). OVX grupā ievērojami palielinājās kaulu apmaiņas marķieru, piemēram, ALP, kalcija, TRAP5b un OC, līmenis serumā. No šiem osteoporozes marķieriem paaugstināts kalcija, TRAP5b un OC līmenis OVX pelēm acīmredzami tika inhibēts ar akteozīdu, bet ALP līmenis serumā ārstēšanas rezultātā netika mainīts. Vidējā maksimālā lūzuma slodze līdz labā augšstilba kaula vidum bija ievērojami zemāka OVX grupā nekā Sham grupā (9.A att.). Ārstēšana ar akteozīdu palielināja maksimālo lūzumu skaitu līdz fiktīvu grupai. Kad augšstilba kaula kortikālais kauls tika izgriezts un novērots ar optisko mikroskopiju, OVX grupā parādītās osteoporozes pazīmes bija gandrīz pilnībā izzudušas AC pelēm (9.B att.). Lai pārbaudītu akteozīda ietekmi uz OVX izraisīto osteoporozes modeli, ar mikro-CT tika analizēti KMB un kaulu morfoloģiskie parametri vieglā proksimālā augšstilba kaula trabekulārā. Kā parādīts 9.C attēlā, OVX pelēm tika konstatētas izmaiņas augšstilba kaula trabekulārajā arhitektūrā, bet šīs izmaiņas mazināja ārstēšana ar akteozīdu. Mikro-CT analīzes rezultāti atklāja, ka KMB, kas ir kaulu stipruma rādītājs, ir ievērojami samazināts OVX pelēm (9. D attēls). Salīdzinot ar Sham grupu, OVX pelēm bija arī būtiskas izmaiņas BV / TV, Tb. Sp un Tb. N, bet ne Tb.Th. OVX peles perorāla ārstēšana ar akteozīdu būtiski novērsa KMB, kā arī BV/TV un Tb.N izmaiņas.

Akteozīds neietekmē osteoblastoģenēzi kaulu smadzeņu šūnās

Akteozīda loma osteoblastiskajā diferenciācijā tika tālāk pētīta, izmantojot kaulu smadzeņu šūnas. Kā parādīts 10.A attēlā, DAG apstrāde palielināja ar alizarīna sarkano iekrāsoto šūnu skaitu, un to nemainīja pirmapstrāde ar 10 mM akteozīdu. Krāsas daudzums liecināja, ka kombinētā apstrāde ar akteozīdu un DAG nemainīja mineralizāciju (10.B att.). Līdzīgi DAG izraisīto intracelulārā kalcija satura (10. att. C) un mRNS līmeņa (10. D att.) palielināšanos kauliem specifiskos marķieros, piemēram, Runx2, osterix, BSP un OC, neietekmēja pirmapstrāde arakteozīds.