Arilogļūdeņraža receptoru aktivizēšana ar 6-formilindolo[3,2-b]karbazolu mazināja akūtu nieru bojājumu, nomācot iekaisumu un apoptozi
Mar 20, 2022
Abstract:Akūtsnieru traumas(AKI) ir dažādu etioloģiju multifaktoriāla slimība. Arilogļūdeņraža receptors (AhR) ir ligandu aktivizēts transkripcijas faktors, kas reaģē uz ligandiem, lai izraisītu vai apspiestu gēnu ekspresijas, tādējādi regulējot daudzveidīgu bioloģisko vai patofizioloģisko efektu spektru. Tomēr AhR ietekme uz AKI joprojām nav zināma. Tika veikta viena 50% glicerīna intraperitoneāla injekcija, lai izraisītu rabdomiolīzi C57BL/6J pelēm. Divpusējaisnierukātiņi tika aizsegti 30 minūtes un pēc tam noņemti, lai stimulētunieruI/R trauma. Tika izmantots 6-formilindolo[3,2-b]karbazols (FICZ), triptofāna fotooksidācijas produkts ar augstu afinitāti pret AhR. In vitro pētījums tika veikts ar HK-2 šūnām. Dzelzs mioglobīns un FICZ tika izšķīdināti barotnē dažādās šūnu grupās. Ārstēšana ar AhR agonistu FICZ ievērojami mazināja seruma kreatinīna un urīnvielas līmeņa paaugstināšanos AKI. AKI modelēšanas izraisītsnieru bojājumitika vājināts ar FICZ. AhR galvenokārt tiek ekspresēts proksimālajās cauruļveida šūnās, un to var aktivizēt, ievadot FICZ. Tikmēr AKI ievainotajiem izraisīja pro-iekaisuma citokīnu veidošanosnieres, savukārt FICZ kavēja viņu izpausmes. Turklāt FICZ efektīvi mainīja šūnu apoptozi AKI modeļos. Mehāniski AKI stimulēja NF-κB un JNK ceļu aktivizēšanunieres, savukārt FICZ ievērojami nomāca šīs atbilstošās olbaltumvielu ekspresijas. In vitro pētījumā FICZ inhibēja arī iekaisumu un apoptozi mioglobīna vai H/R stimulētajās HK-2 šūnās. Rezumējot, FICZ AhR agonisms mazināja rabdomiolīzi un I/R izraisītu AKI. FICZ inhibēja iekaisumu un apoptozi, nomācot NF-κB un JNK ceļus proksimālajās cauruļveida šūnās.
Atslēgvārdi:akūts nieru bojājums, apoptoze, arilogļūdeņraža receptors, iekaisums, nieru kanāliņu epitēlija šūna
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU
IEVADSAkūtsnieru traumas(AKI) attiecas uz strauju samazināšanosnieru funkcijadažu stundu līdz vairāku dienu laikānieruperfūzijas nepietiekamība, nefrotoksiskas zāles vai indes, urīnceļu obstrukcija un citi cēloņi.1 AKI klīniskie cēloņi galvenokārt ietver išēmijas-reperfūzijas bojājumus, nefrotoksiskas vielas (piemēram, zāles, kontrakcijas vielas un muskuļu šūnu saturu, ko izdala rabdomiolīze) un sepsi. Katru gadu pasaulē ar AKI slimo aptuveni 13,3 miljoni cilvēku.2 AKI ar savu augsto mirstību un izmaksām rada smagu slogu.3 Galvenie patofizioloģiskie mehānismi ietver ķermeņa traumas.nieruasinsvadu sistēma,4,5 endoplazmatiskā retikuluma stress,6,7 mitohondriju bojājumi,8 apoptoze,9 oksidatīvais stress un iekaisums.10 Rabdomiolīze (RM) ir sindroms, kam raksturīga muskuļu nekroze un muskuļu šūnu satura izdalīšanās asinsritē, kuras laikā AKI ir visizplatītākā komplikācija11; Išēmija-reperfūzija (I/R) ir viena no galvenajām AKI patofizioloģijām, kas veido 60 procentus no visiem AKI cēloņiem.12 Pašlaik nav efektīvas AKI ārstēšanas, ko izraisījuši abi iepriekš minētie iemesli, izņemot etioloģijas novēršanu. ārstēšana unnieruaizstājterapija.
Aril ogļūdeņraža receptors (AhR) tiek pārrakstīts un tulkots no AHR gēna. Cilvēkiem AhR izpaužas dažādos orgānos, tostarp plaušās, aizkrūts dziedzerī,nieres,aknas, zarnas utt.13 Neligandēts AhR atrodas citozolā proteīna kompleksā, kas satur arī karstuma šoka proteīna 90 (HSP90) dimēru un ko-šaperonus AIP un p23.14 Saistoties ar ligandu, AhR tiek aktivizēts un nokļūst. kodols, kur tas saistās ar AhR kodola translokatoru (ARNT) un veicina daudzu dažādu pakārtoto gēnu transkripciju.15 AhR ligandi ir ārkārtīgi dažādi, un tos var klasificēt kā eksogēnus vai endogēnus. Ligandi ar dažādiem avotiem un struktūrām saistās ar AhR ar atšķirīgu afinitāti un var izraisīt dažādus fizioloģiskus vai patoloģiskus efektus.16 Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka AhR ar tā pakārtotajiem ceļiem bija pretiekaisuma,17 antiapoptozes,18 šūnu ciklu regulēšanas19 un regulēšanas funkcijas. imunitāte,20 kas ir svarīgas AKI patoģenēzes sastāvdaļas. AhR endogēnie ligandi galvenokārt ir no triptofāna metabolisma. 6-formilindolo[3,2-b]karbazolam (FICZ), triptofāna fotooksidācijas produktam, ir augsta afinitāte ar AhR.21 Iepriekš FICZ bija aizsargājoša iedarbība dažādos slimību modeļos.{{ 19}} Lai gan pētnieki atklāja, ka urēmisko toksīnu aktivizētajam AhR ir nelabvēlīga ietekme uz pacientiem ar hroniskunieru slimības(CKD),25 nevienā pētījumā netika noteiktas tās izteiksmes izmaiņas AKI. Nav arī skaidrs, vai FICZ ir anieruaizsargājošs efekts rabdomiolīzes un I / R izraisītas AKI gadījumā, jo AhR var aktivizēt pilnīgi atšķirīgus pakārtotos efektus.
Eksperimenti ar dzīvniekiemVisi eksperimentālie protokoli un procedūras ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Sičuaņas Eksperimentu universitātes pieņemtajiem un Sičuaņas Universitātes Dzīvnieku kopšanas un lietošanas ētikas komitejas apstiprinātajiem ētiskajiem principiem eksperimentos ar dzīvniekiem. Peļu tēviņi C57BL/6 (10-12 nedēļas, svars no 25 līdz 27 g) tika iegādāti no Sičuaņas Universitātes Dzīvnieku laboratorijas centra (Čendu, Ķīna). Peles tika turētas nemainīgā temperatūrā (23 ± 2 grādi) un gaismas/tumsas apstākļos (12/12 stundas), nodrošinot brīvu piekļuvi ūdenim un pārtikai. Peles tika pielāgotas šai videi 1 nedēļu pirms turpmākiem pētījumiem. Rabdomiolīzes modelī peles tika nejauši sadalītas četrās grupās: kontroles (n {{10}}), FICZ (n=3), glicerīns (n = 6) un glicerīns. plus FICZ (n=6). Glicerīna grupas pelēm abpusēji injicēja muguras ekstremitātēs 50 procentus glicerīna, kas izšķīdināts 0,9% normālā fizioloģiskā šķīdumā (9 μL/g ķermeņa svara), lai izraisītu rabdomiolīzi ar samazinātu AKI. Tikmēr peles kontroles grupā saņēma tādu pašu daudzumu fizioloģiskā šķīduma intramuskulāras injekcijas veidā. Kas attiecas uz glicerīna un FICZ grupu, FICZ tika izšķīdināts 2,5% PEG400 un atšķaidīts ar 0,9% normālu fizioloģisko šķīdumu, lai četras dienas pēc kārtas pirms glicerīna injekcijas ievadītu intraperitoneāli devā 100 ug/kg/d. FICZ grupas pelēm intraperitoneāli tika ievadītas tādas pašas FICZ devas četras dienas pēc kārtas, bez glicerīna injekcijas.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru mazspēju
Nieru išēmijas-reperfūzijas modelī peles tika nejauši sadalītas četrās grupās: kontrole (n=6), FICZ (n=3), I/R (n=6) un I. /R plus FICZ (n=10). Ievainojums I/R grupā tika izraisīts, 30 minūtes saspiežot nieru pedikulus ar netraumatiskiem mikrovaskulāriem skavām, kam sekoja 24 stundu reperfūzija pēc skavas noņemšanas. Oklūzija un reperfūzija tika apstiprināta ar krāsas izmaiņāmnieres. Kontroles grupas pelēm tika veiktas tādas pašas ķirurģiskas procedūras, izņemot kāju saspiešanu. Runājot par I/R plus FICZ grupu, FICZ tika ievadīts, kā minēts iepriekš, četras dienas pēc kārtas pirms I/R modelēšanas. Līdzīgi pelēm FICZ grupā četras dienas pēc kārtas tika ievadītas tādas pašas FICZ devas, un tās piedzīvoja visas ķirurģiskās procedūras kā kontroles grupai. Divas peļu partijas tika eitanāzētas attiecīgi ar pentobarbitāla nātrija injekciju (50 mg/kg, ip) un nonāvētas 24 stundas pēc modelēšanas. Serums unnieresparaugi tika savākti un uzglabāti -80 grādiem turpmākai analīzei.
Seruma bioķīmijas testiAsins paraugus nekavējoties centrifugēja pie 1509,3 g 20 minūtes, lai izolētu serumu testēšanai. Kreatinīna (sCr), urīnvielas un kreatīnkināzes (CK) līmenis serumā tika noteikts ar automātisku bioķīmisko analizatoru (Mindray BS-240). Modelēšanas grupu sCr līmeņi, kas palielinājās līdz divām reizēm salīdzinājumā ar kontroles vērtībām, liecināja par veiksmīgu AKI modelēšanu.
Histoloģiskais novērtējumsNieru audi tika fiksēti 10% neitrālā buferētā formalīnā, iestrādāti parafīnā un sadalīti 4 μm biezumā. Pēc deparafinizācijas un rehidratācijas sekcijas tika iekrāsotas ar Šifa periodisko skābi (PAS). PAS iekrāsotās sekcijas tika pētītas gaismas mikroskopijā ar palielinājumu × 200 vai × 400. Desmit lauki tika nejauši atlasīti ar palielinājumu × 200 no katras sadaļas, un divas sadaļas tika nejauši atlasītas no katra parauga, kurā ir vismaz trīs katrā grupā, lai veiktu puskvantitatīvo analīzi. Histopatoloģiskās izmaiņas tika novērtētas pēc ievainoto/bojāto procentuālā daudzumanierukanāliņos, par ko liecina kanāliņu paplašināšanās, līze, pārrāvums un ģipša veidošanās. Audu traumas tika novērtētas skalā {{0}}, un 0, 1, 2, 3 un 4 atbilst 0 procentiem,<25%, 26%-50%,="" 51%-75%="" and="">76 procenti ievainoto/bojātonierukanāliņu attiecīgi.26
Imunofluorescences krāsošanaPele sastinganieresaudi, iegulti AZT, tika sagriezti 4- μm biezās daļās uz kriostata un uzglabāti –80 grādu temperatūrā līdz krāsošanai. Lai bloķētu nespecifiskas saistīšanās vietas, 1 stundu istabas temperatūrā uzklāja fosfātu buferšķīdumu (PBS), kas satur 5 procentus zirga seruma. Pēc tam sekcijas tika inkubētas ar primārajām antivielām mitrinātā kamerā 4 grādu temperatūrā nakti. Pēc mazgāšanas ar PBS atbilstošo sekundāro antivielu izmantoja 1 stundu, izvairoties no gaismas. Pēc tam paraugi tika mazgāti ar PBS, iekrāsoti ar DAPI (D8200, Solarbio) un visbeidzot uzstādīti ar segstikliņiem. Primārās antivielas negatīvās kontrolēs tika aizstātas ar PBS. Fluorescējošu signālu eksportēšanai tika izmantotas sekundārās antivielas (atšķaidījums 1:500; Jackson ImmunoResearch), kas saskaņotas ar primārajām antivielām. Attēli tika uzņemti un analizēti, izmantojot mikroskopijas programmatūru ZEN 2012 (zilais izdevums).
ImūnhistoķīmijaNieru audi tika fiksēti ar formalīnu, dehidrēti, iestrādāti para spurā, sadalīti 5 μm biezumā un pēc tam uzstādīti uz stikla priekšmetstikliņiem. Pēc tam priekšmetstikliņus bloķēja ar 2,5% normālu kazas serumu un inkubēja ar primārajām antivielām 4 grādu temperatūrā. Priekšmetstikliņus trīs reizes nomazgāja PBS, un krāsošanai izmantojām VECTASTAIN ABC Kit (Vector). Attēli tika uzņemti, izmantojot ZEN 2012 (blue edition) mikroskopijas programmatūru.
TUNEL krāsošanaNieru audi tika fiksēti ar formalīnu, iestrādāti parafīnā un sadalīti 4 μm biezumā. Termināla deoksinukleotidiltransferāzes mediētā dUTP nick end marķēšanas (TUNEL) krāsošana tika veikta, izmantojot DeadEnd™ Fluorometric TUNEL sistēmu (G3250, Promega). Kodolkrāsošanai sekcijas tika inkubētas ar DAPI (D8200, Solarbio) atšķaidījumā 1:500. Attēli tika parādīti ar fluorescences mikroskopiju ar palielinājumu × 400. Mēs saskaitījām pozitīvās šūnas un katrā paraugā pārbaudījām vismaz 10 laukus katrā sadaļā.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
Western blot analīzeThenieru audis vai HK{{0}} šūnas tika homogenizētas ar radioimūnās izgulsnēšanas (RIPA) līzes buferi (P0013B, Beyotime Biotechnology), kas satur 1‰ proteināzes inhibitorus (Keygen Biotech). Pēc centrifugēšanas (18 894,2 g, 4 grādi) 15 minūtes, supernatants tika savākts un olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar bicinhonīnskābes proteīna testa komplektu (Beyotime Institute of Biotechnology) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Proteīna lizāts vienādos daudzumos tika atdalīts ar 10% - 12% SDS-PAGE, kam sekoja pārnešana uz polivinilidēna difluorīda membrānu (Bio-Rad). Membrānas 1 stundu istabas temperatūrā bloķēja ar 5% beztauku sauso pienu (w/v) Tris buferšķīdumā ar 0,1% Tween-20 (TBS-T) un pēc tam inkubēja ar atbilstošām primārajām antivielām. naktī 4 grādi. Pēc trīsreizējās skalošanas ar TBS-T ar 5-minūšu intervāliem membrānas inkubēja ar HRP konjugētām sekundārajām antivielām istabas temperatūrā 1 stundu. Olbaltumvielu bloti uz membrānām tika vizualizēti ar Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrātu (Millipore Corporation) ar Bio-Rad Chemi Doc MP. Densitometrijas analīze tika veikta, izmantojot ImageJ 6.0 programmatūru (Nacionālie veselības institūti), un kā slodzes kontrole tika izmantots -aktīns.
Kvantitatīvā reāllaika PCR analīzeKopējā RNS no saldētasnieresparaugi tika izolēti ar Animal kopējās RNS izolācijas komplektu (Foregene). Izolētās mRNS koncentrācija tika noteikta, izmantojot ScanDrop 100 (Analytik Jena) noteicēju, un cDNS tika sintezētas, izmantojot PrimeScript™ RT reaģentu komplektu (Takara Bio). Kvantitatīvā reāllaika PCR tika veikta, izmantojot iTaq™ Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) PCR sistēmā (CFX Connect; Bio-Rad) pēc reversās transkripcijas. Primeru sekvences ir norādītas S1 tabulā. Relatīvie gēnu daudzumi tika aprēķināti ar 2−∆∆Ct metodi, salīdzinot ar -aktīna ekspresijas līmeņiem.
Šūnu kultūra un ārstēšanaCilvēka nieres proksimālā kanāliņu šūnu līnija (HK-2 šūna) bija laipna dāvana no prof. Xueqing Yu (Guandunas provinces tautas slimnīca) un tika kultivēta (DMEM)/F12 barotnē (SH30023. 01B, Hyclone), kas papildināta ar 10 procentiem. liellopu augļa serums (SH30084. 03, Hiklons), 37 grādos mitrā atmosfērā ar 5% CO2 un 95% gaisa Mioglobīna modelī šūnas eksponenciālās augšanas stāvoklī tika sadalītas četrās grupās: FICZ grupa, inkubēta ar 100 nmol/L FICZ 24 stundas; mioglobīna grupa, 24 stundas inkubēta ar 200 μmol/L dzelzs mioglobīnu; Mb plus FICZ grupa, inkubēta ar FICZ pie 100 nmol/L, ievadot mioglobīna ārstēšanu; un kontroles grupā šūnas tika inkubētas tikai ar pilnu barotni kontroles grupā. Dzelzs mioglobīns tika sagatavots, kā aprakstīts iepriekš.26,27 Hipoksijas/reoksigenācijas (H/R) modelī mēs sadalījām HK-2 šūnas trīs grupās. H/R grupas šūnas tika kultivētas hipoksiskos apstākļos (1% O2, 94% N2 un 5% CO2) barotnē bez seruma 12 stundas, lai izraisītu hipoksiju. Pēc tam šūnas tika pārnestas atpakaļ uz parasto barotni ar skābekli 6 stundas, lai nodrošinātu atkārtotu oksigenāciju. Kontroles šūnas tika inkubētas pilnā barotnē parastā inkubatorā. FICZ ievadīšana (100 nmol/L) H/R plus FICZ grupā tika ievadīta tieši pirms H/R operācijas.
Aneksīna V-FITC/propīdija jodīda testsMēs izmantojām anneksīna V-FITC apoptozes analīzes komplektu (AO2001- 02PH, SUNGENE). HK-2 šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs. Pēc tam, kad 24 stundas tika pakļautas dažādām barotnēm, pielipušās šūnas tika atdalītas ar tripsīnu. Pēc tam šūnas tika atkārtoti suspendētas saistošā buferšķīdumā un iekrāsotas ar 5 μL aneksīna V-FITC un 5 μL propīdija jodīda (istabas temperatūra, 15 minūtes, izvairoties no tumsas). Apoptotiskās šūnas tika identificētas ar plūsmas citometru.
Statistiskā analīzeDati tika norādīti kā vidējais ± SD. Statistiskās vērtības vairāku grupu salīdzinājumiem tika analizētas ar vienvirziena ANOVA, un salīdzinājums pa pāriem tika veikts ar SNK testu. Visas statistiskās analīzes tika veiktas SPSS 21.0. P < 0,05="" tika="" uzskatīts="" par="" statistiski="">
REZULTĀTI
AhR agonists FICZ novājināja AKILai pārbaudītu, vai FICZ nodrošina renoprotektīvu efektu, mēs izveidojām rabdomiolīzes un išēmijas/reperfūzijas (I/R) izraisītus AKI modeļus. Pēc tam mēs novērtējām nieru darbību un patoloģiskās izmaiņas nieru audos. Nav būtisku traucējumu seruma kreatinīna, urīnvielas, CK, aknu enzīmu metabolisma aktivitātēs
FICZ grupā tika novēroti (1A-C attēls; S3 tabula). Kā parādīts 1A-B attēlā, FICZ ievadīšana ievērojami samazināja seruma kreatinīna un urīnvielas līmeņa paaugstināšanos 24 stundas pēc glicerīna injekcijas vai I/R operācijas, neietekmējot seruma CK līmeni rabdomiolīzes pelēm (1.C attēls). Tikmēr PAS krāsojumi uzrādīja FICZ efektīvi mazināja patoloģiskos bojājumus, kam raksturīga cauruļveida paplašināšanās, pietūkums, lējuma veidošanās un otas robežas zudums, salīdzinot ar AKI modeļiem abos modeļos (1D-E attēls). Imunofluorescences krāsošana un reāllaika PCR rezultāti parādīja, ka FICZ lietošana ievainotajiem ievērojami samazināja ar neitrofilu želatināzi saistītā lipokalīna (NGAL), kas ir nieru bojājumu biomarķieris, ekspresiju un transkripciju.nieres(2.A–D attēls). Līdzīgi FICZ arī inhibēja glicerīna izraisīto mRNS līmeninieru traumasmolekula 1 (KIM1) pēc glicerīna injekcijas (2.A attēls).
Tālāk mēs pētījām AhR transkripciju un ekspresijunieresaudus. 3. attēlā rt-PCR, Western blotēšanas, imūnhistoķīmijas un imunofluorescences krāsošanas rezultāti kavēja AhR mRNS un olbaltumvielu līmeni ievērojami samazināt abās AKI modelēšanas grupās. FICZ intraperitoneāla injekcija ievērojami stimulēja tās transkripciju un ekspresiju glicerīna plus FICZ un I / R plus FICZ grupās. Tā kā nieru kanāliņu epitēlija šūnām ir būtiska loma AKI, mēs pārbaudījām, vai AhR var ekspresēt cauruļveida epitēlija šūnās. Imūnķīmijas rezultāti parādīja, ka AhR galvenokārt tika ekspresēts nieru kanāliņos (3.C-D attēls). Turklāt nieru audu sekcijas tika iekrāsotas ar lektīnu, proksimālo cauruļveida epitēlija šūnu marķieri, AhR un DAPI kodoliem. Kā parādīts 3E-F attēlā, AhR apvienojās ar lektīnu, tādējādi norādot, ka AhR galvenokārt tiek ekspresēts proksimālajās cauruļveida epitēlija šūnās. Kopumā FICZ aizsargāja pret rabdomiolīzi un I/R izraisītu AKI, aktivizējot AhR ievainotajiemnieres.
FICZ samazināja iekaisuma citokīnu veidošanos AKI peļu nierēsLai novērtētu, vai FICZ spēja novērst AKI izraisīto iekaisumu, q-PCR tika izmantots, lai noteiktu pro-iekaisuma faktoru transkripcijas līmeni nierēs. IL-1, IL-6 un TNF- mRNS līmenis nieru audos ievērojami palielinājās pēc glicerīna injekcijas vai I/R traumas, savukārt FICZ ievadīšana ievērojami samazināja šīs gēnu transkripcijas (4.A attēls). Konsekventi AKI modelēšanas izraisītā IL-1, IL-6 un TNF līmeņa paaugstināšanās tika efektīvi vājināta ar FICZ ārstēšanu (4.B-C attēls). Šie rezultāti liecināja, ka FICZ var mazināt nieru iekaisumu AKI modelēšanā.
FICZ samazināja šūnu apoptozi AKI peļu nierēsPapildus iekaisumam šūnu apoptoze ir vēl viena svarīga iezīme AKI patoģenēzē. Mēs izmantojām TUNEL krāsošanu, lai izpētītu FICZ ietekmi uz nieru apoptozi I / R izraisītām pelēm. Kā parādīts 5.B attēlā, FICZ ievērojami samazināja TUNEL pozitīvo šūnu skaitunieresI/R pelēm. Turklāt,
imūnhistoķīmiskās krāsošanas rezultāti liecināja, ka šķeltās kaspāzes -3, vitāli svarīga izpildītāja, kas modificē ar apoptozi saistītus proteīnus, ekspresija tika ievērojami samazināta, FICZ ievadot rabdomiolīzes modelī (5.A attēls). Tikmēr FICZ varēja samazināt kaspāzes-3 mRNS līmeni gan rabdomiolīzes, gan I/R izraisītos AKI modeļos. Turklāt Western blot rezultāti parādīja, ka FICZ var pazemināt šķeltās kaspāzes -3 un Baksa ekspresiju un paaugstināt Bcl-2 līmeninieresAKI pelēm (5.C attēls). Kopumā šie atklājumi norādīja, ka FICZ uzrādīja anti-apoptotisku iedarbībunieresno AKI pelēm.
FICZ nomāca NF-κB un JNK signālu pārraidi AKI peļu nierēs
Signalizācijas ceļu aktivizēšana tika tālāk pārbaudīta ar Western blot analīzi, lai noskaidrotu FICZ pretiekaisuma un anti-apoptotisko mehānismu.nieresno AKI pelēm. Kā parādīts 6. attēlā, IκB un P65 fosforilācijas līmeņi AKI peļu nierēs bija acīmredzami augstāki nekā ar FICZ ārstētajām grupām. Turklāt iepriekšējos pētījumos tika noskaidrots, ka JNK signalizācija var modulēt apoptozi un mijiedarboties ar NF-κB signalizāciju.29 Mēs atklājām, ka JNK fosforilācija bija ievērojami augstāka, salīdzinot ar attiecīgajām kontroles grupām, bet FICZ terapija tos efektīvi mainīja. Iepriekš minētie rezultāti nozīmēja, ka NF-κB un JNK ceļi veicināja FICZ pretiekaisuma un anti-apoptotisko aktivitāti AKI peļu nierēs.
FICZ aizsargāja HK-2 šūnas no mioglobīna stimulācijas un H/R bojājumiem, kavējot iekaisumu un apoptoziMēs pierādījām, vai AhR aktivizēšana ar FICZ var nomākt iekaisumu un apoptozi mioglobīna stimulētās cilvēka proksimālās kanāliņu epitēlija (HK-2) šūnās. Pirmkārt, mēs apstiprinājām, ka AhR ekspresijas in vitro mioglobīna stimulētajās vai H/R ievainotajās šūnās tika ievērojami samazinātas, bet FICZ tās apvērsa (7.B-D attēls). Katras grupas šūnu apoptozes ātrums mioglobīna modelī tika noteikts ar plūsmas citometriju (7.A attēls). Salīdzinot ar kontroles grupu, FICZ grupā nepalielinājās HK-2 šūnu apoptoze un nekroze. Turpretim pēc mioglobīna stimulācijas HK-2 šūnās bija liels skaits apoptotisku šūnu, kas veidoja 12,3 procentus . Lai gan Mb plus FICZ grupā bija ievērojami mazāk apoptotisko šūnu. Turklāt FICZ samazināja šķeltās kaspāzes-3 un Bax izpausmes mioglobīna stimulētajās vai H/R ievainotajās HK-2 šūnās (7.BD attēls). Turklāt FICZ ievērojami mainīja mioglobīna vai H/R izraisīto pro-iekaisuma faktoru paaugstināšanos (7.B-D attēls). Konsekventi P65 un JNK fosforilācijas līmeņi bija ievērojami augstāki pēc mioglobīna stimulācijas vai H / R traumas, turpretim FICZ ārstēšana tos efektīvi mazināja (7.B-D attēls). Tādējādi šie rezultāti liecināja, ka AhR agonists FICZ aizsargā HK-2 šūnas pret mioglobīnu un H/R, inhibējot iekaisumu un apoptozi.
DISKUSIJA
Pašreizējā pētījumā mēs atklājām, ka FICZ AhR agonisms var mazinātiesnieru bojājumirabdomiolīzes un išēmijas/reperfūzijas izraisītas AKI gadījumā. AhR galvenokārt bija proksimālajās cauruļveida epitēlija šūnās, savukārt AhR agonists FICZ varēja aizsargāt proksimālās cauruļveida epitēlija šūnas pret AKI, regulējot iekaisumu un šūnu apoptozi caur NF-κB un JNK signālu ceļiem. Iepriekšējie pētījumi atklāja, ka urēmiskie toksīni, piemēram, indoksilsulfāts, bija AhR agonisti.30 Pacienti ar hronisku nieru slimību tika pakļauti šiem urēmiskajiem toksīniem, tāpēc AhR ir aktivizējis gan stacionāros pacientus, gan peles ar HNS.25,31 Nesenie pētījumi atklāja, ka endogēnie metabolīti no zarnu mikrobiotas32 vai urēmiskais metabolisms varētu aktivizēt AhR33,34 CKD peļu un žurku nierēs, kam bija atšķirīgas tendences no mūsu konstatējumiem AKI pelēm. Tomēr atšķirīgi AhR ligandi var ietekmēt dažādus pakārtotos signālu ceļus.35 Turklāt iepriekšējie pētījumi par AKI parādīja, ka leflunomīds var aktivizēt AhR I/R izraisītā AKI un uzlabot nieru patoloģiskos bojājumus, regulējot imunitāti un kavējot iekaisumu.36 MiR{{ 11}}b aktivizēja AhR, inhibējot AhR represoru, un pasargāja nieres no cisplatīna izraisītiem bojājumiem.37 Baicalīns uzlaboja aristolohskābes I izraisīto ietekminieru traumascaur AhR atkarīgu CYP1A1/2 indukciju aknās.38 Mūsu rezultāti saskanēja ar šiem iepriekšējiem atklājumiem par AKI. Turklāt AhR agonists FICZ radīja aizsargājošu efektu dažādos slimību modeļos, piemēram, metaboliskā sindroma,39 autoimūna uveīta,22kolīta,23psoriāzes,24 utt.
Saskaņā ar jaunākajiem Huang et al rezultātiem22 eksperimentālā autoimūnā uveīta modelēšana aktivizēja NF-κB un STAT1/3 ceļus un regulēja pakārtoto iekaisuma veicinošo faktoru IL-1, IL-6 un TNF izpausmes. - . Tikmēr palielinājās šūnu apoptoze. Ar AhR agonistu ārstēšanu tika konstatēta samazināta pro-iekaisuma citokīnu ekspresija un NF-κB ceļa inhibīcija. AhR aktivācija arī izraisīja šūnu apoptozes inhibīciju. Šie rezultāti atbilda mūsu eksperimentam. Viņi arī atklāja, ka AhR aktivācija mainīja makrofāgu polarizāciju no M1 uz M2. Tas ierosināja, ka AhR varētu piedalīties imūnregulācijā, kas bija vēl viens iespējamais izskaidrojums pakārtoto iekaisuma citokīnu regulēšanai. Bija vairāki ziņojumi par negatīvu korelāciju starp AhR un NF-κB ekspresijas RelA (P65) apakšvienību dažādās šūnās. Kopimunoprecipitācija tika veikta ar kopējiem Hepa1c1c7 šūnu šūnu ekstraktiem. Tā kā gan AhR, gan NF-κB var tikt pakļauti no signāla atkarīgai kodola translokācijai, un netika konstatēts, ka ARNT ir saistīts ar P65, tāpēc tika pieņemts, ka AhR un P65 saistība galvenokārt bija citoplazmas nodalījumā.40 AhR un NF-κB modulē transkripcijas koaktivatori. Kā ziņots iepriekš, starp to koaktivatoriem bija daļēja pārklāšanās. Līdz ar to ir iespējams, ka var pastāvēt konkurence par koaktivatora saistīšanos, proti, kad tiek aktivizēts viens ceļš, otrs ceļš tiks nomākts, konkurējot par koaktivatora pieejamību.41 Negatīvā korelācija tika vēlreiz pārbaudīta epigenētikas pētījumos.42 Pa to laiku NF -κB ietekmē JNK, iespējams, izmantojot reaktīvās skābekļa sugas (ROS).29 Mitohondriju ROS var veicināt NF-κB aktivāciju, un JNK veicina ROS veidošanos, kas savukārt stimulē JNK aktivāciju. Lai gan detalizētajam mehānismam ir nepieciešama turpmāka izpēte, varētu pieņemt, ka pastāv pozitīva korelācija starp NF-κB un JNK ceļiem.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIERES SĀPES
Iepriekšējie pētījumi 43, 44 atklāja, ka rabdomiolīzes un I / R izraisītas AKI gadījumā modelēšanas grupās ievērojami palielinājās iekaisums un šūnu apoptoze, tikmēr tika aktivizēti NF-κB un JNK ceļi. Šie atklājumi atbilda mūsu rezultātiem. Galvenie AKI mehānismi bija hipoksija, oksidatīvā stresa reakcija un iekaisums. Tie varētu veicināt šūnu nāvi (apoptozi, autofagiju, nekrozi) vai audu remodelāciju. Šūnu ievainojumi vai nāve atbrīvoja vielas ar bojājumiem asociētiem molekulāriem modeļiem (DAMP) un ar patogēniem saistītiem molekulāriem modeļiem (PAMP), kas vēl vairāk saasināja iekaisumu.45 DAMP un PAMP mijiedarbība ar iedzimtas imūnsistēmas sensoriem arī pastiprināja iekaisuma reakciju.46 pa to laiku AKI patoģenēzē bija iesaistīta arī šūnu nāve, ieskaitot apoptozi. Kaspāžu ģimenes izpausmes tiek regulētas, un AKI laikā mainās vairāki ar mitohondrijiem saistītie anti-apoptotiskie un proapoptotiskie regulatori.26,47,48 Kopumā iekaisums un šūnu apoptoze veicina viens otru, un abiem ir būtiska loma AKI. Mēs noskaidrojām, ka AhR aktivācija ar FICZ mazināja iekaisumu un apoptozi, inhibējot NF-κB un JNK ceļus.
Tomēr vēl ir jāizpēta vairākas problēmas. Mūsu pētījumā galvenokārt tika pētīta FICZ AhR aktivācijas renoprotektīvā iedarbība un tās iespējamais mehānisms rabdomiolīzes un I / R izraisītas AKI gadījumā. Turklāt pirms AKI modelēšanas mēs izmantojām profilaktisku FICZ ievadīšanu pelēm. Lai gan ievadīšanas veids tika plaši izmantots iepriekšējos pētījumos,{1}} pastāvēja atšķirības starp eksperimentiem ar dzīvniekiem un klīnisko praksi. Nākotnē ir jāturpina pētīt, kā AhR ekspresija mainās pēc AKI attīstības un konkrētāk AhR intracelulāras lokalizācijas. Lai gan NF-κB un JNK fosforilēšanās samazināšanās FICZ darbības rezultātā ir skaidra, ir nepieciešami turpmāki attiecīgo bloķējošo līdzekļu eksperimenti. Turklāt, lai labāk izskaidrotu mehānismu, in vivo pētījumam ir nepieciešamas AhR nokaušanas un pārmērīgas ekspresijas peles, savukārt in vitro pētījumam ir nepieciešama AhR pārmērīga ekspresija un klusēšana. Turklāt ir nepieciešams daudz vairāk izpētīt, kā dažādi ligandi ietekmē dažādus AhR signalizācijas ceļus.
