Ar gallskābi konjugēta peptīdu preparāta (Gal2–Pep) antioksidants un pretnovecošanās potenciāls

Āda ir ļoti neaizsargāta pret priekšlaicīgu novecošanosārēja stresa dēļ, tāpēc šajā pētījumā peptīdu sastāvs (galloils)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) tika sintezēts, apvienojot TPPTTP peptīdu un gallusskābe (GA). Visi peptīdi tika sintezēti uz 2-hlortrilhlorīda sveķiem, izmantojot cietās fāzes peptīdusintēze (SPPS) un analizēta ar elektrosmidzināšanas jonizāciju (ESI)/kvadrupola laikaFLFLight (Q-TOF) tandēma masas spektroskopijas (MS) sistēma. Sākotnēji Gal2–Pep neuzrādīja toksicitāti zem koncentrācijas 100mM ar šūnu izdzīvošanas rādītāju 88 procenti keratinocītiem unfibroblasti. Thereaktīvās skābekļa sugas(ROS) attīrīšanas aktivitāte Gal2–Pep bija stabilāks, salīdzinot ar GA atsevišķi; un pēc četrām nedēļām istabātemperatūra, tāROS attīrīšanas darbībasaglabājās augstāks par 50 procentiem. Turklāt peptīdu sastāvs,Gal2–Pepam bija arī elastāzi inhibējoša iedarbība CCD{0}}Skfibroblastsšūnas. Pamatojoties uz RT-qPCR rezultātiem, šajā pētījumā tika pierādīts, ka Gal2–Peps palielināja PGC izteiksmi-1a uznovērstoksidatīvais stress, un apstiprināja tā potenciālu kāpretnovecošanās līdzeklisautorspalielinot izteiksmiI tipa kolagēnsun pēcmatricas metaloproteināzes-1 (MMP1) ekspresijas samazināšana. Theatklājumiem iegūtie rezultāti pastiprina ierosinājumu, ka šajā pētījumā sintezēto peptīdu preparātu varētu izmantot kā adabisks antioksidantsunpretnovecošanās līdzekliskosmētiskajam lietojumam.

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu vairāk informācijas par Cistanche pretnovecošanās produktiem

1. Ievads

Ādas novecošanāsrodas keratinocītu un šūnu dalīšanās pakāpeniskas samazināšanās un iespējamās apturēšanas rezultātā.sprādzieni ādā. Samazinoties šūnu skaitam, uz ādas veidojas grumbas, kā rezultātā notiek ekstracelulārās matricas denaturācija, kas izraisa sausumu un elastības zudumu.ticība ādā.1 Intracelulārās mitohondriju DNS bojājumiun notiek arī olbaltumvielu sintēzes ātruma samazināšanāsādas novecošanās procesa laikā.2 Ādas novecošanai ir divi galvenie ceļiiekšējos un ārējos veidos ar ultravioleto (UV) iedarbību

galvenais virzītājspēksārējā novecošanās. UV gaisma reaģē ar galvenajām ādas sastāvdaļām, ieskaitot lipīdus, olbaltumvielas un nukleīnskābes, lai ražotu reaktīvās skābekļa sugas (ROS), kas noved pie šūnāmnāvi.3–5 Pārmērīgs ROS līmenis arī noved pie šķelšanās unpatoloģiska kolagēna vai elastīna ķēžu saistīšanās un veicina matricas metaloproteināžu (MMP), piemēram, MMP-1, ekspresiju, kas noārda kolagēnu, izraisot ādas grumbu veidošanos unpaātrinot ādas novecošanos.6,7 Tāpēc antioksidantu terapija, lai noņemtuROS un mitohondriju potenciāla aktivizēšana palīdz aizsargāt ādu no novecošanās.

Papildus ROS elastāzei ir nozīmīga loma zudumāādas elastību, kas noārda elastīnu, svarīgu olbaltumvieluekstracelulārā matrica.8 Elastīns, pateicoties tā ievērojamajam elastīgajam atsitienamīpašības, nodrošina ādas elastību, savukārt elastāzei irspēja šķelt elastīnu un citus proteīnus.8 Tāpēc inhibiElastāzes enzīma lietošana varētu būt galvenā stratēģija ādas nokarenai novēršot ādas elastības zudumu.

Šajā pētījumā mēs izstrādājām jaunu materiālu, kas apvienoperoksisomu proliferatora aktivizēts receptoru gamma koaktivators1-alpha (PGC-1a) atvasināts peptīds TPPTTP un gallskābe (GA)lietošanai kosmētikā pret novecošanos. GA ir fitoķīmiska viela, kas atrodama dažādos augļos un dārzeņos, tostarp vīnogās, tomātos un zaļajā tējā, kam ir augsts antioksidantu un antibakteriāls efekts. eFfects.9 Lai gan GA tiek izmantots kosmētikas un pārtikas rūpniecībā, jo šīs labvēlīgās eFfects, tā formulējums mēdz būt nestabils.10 Tādējādi mēs izstrādājām (galloils)2–KTPPTTP (Gal2–Pep), lai palielinātu GA stabilitāti, saistot to ar PGC-1a-atvasināts peptīds TTPTTP.

Šajā pētījumā mēs sintezējām (galloilu)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) peptīdu formulējums konjugācijā ar gallusskābi un apstiprinātstā potenciāls kā antioksidants un pretnovecošanās līdzeklis.

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli

Dulbecco ir modificētsEagle's Medium (DMEM), penicilīns/streptomicīns, liellopu augļa serums (FBS), fosfāts-buFfradījasāls šķīdums (PBS) un tripsīns tika iegādāti no Gibco (Carls

slikti, CA). Hidroksibenzotriazols (HOBt), diizopropilkarbodiimīds (DIC), 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diizopropiletilamīns (DIEA), gallskābe unN-sukcinil-tri-alanil-pnitroanilīds tika iegūts no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L- Veido aminoskābes (Fmoc-Lys (Boc))–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH un Fmoc-Pro–OH) tika iegādāti no Bead-Tech (Seula,Koreja).

2.2. Peptīdu un ar gallskābi saistītu peptīdu sintēze

Visi peptīdi tika sintezēti uz 2-hlortrilhlorīda sveķiem (200mmola skala, aizvietošanas vērtība¼ 1,46 mmol g 1), izmantojot HOBt–DIC mediētā cietās fāzes peptīdu sintēze (SPPS).

Peptīdu sintēze, izmantojot SPPS metodi, tika veikta ar nelielu modifikācijukatjoni, kas attiecas uz iepriekšējiem pētījumiem.11–13 2-hlortrilhlorīda (CTC) sveķi tika uzbriedināti dihlorā

metānu (DCM, 8 ml) 30 minūtes. Sveķi tika mazgāti ardimetilformamīds (DMF). Visas reakcijas tika veiktas istabas temperatūrā. Fmoc aizsargāti aminoskābju atvasinājumi (2 ekvivalenti(Ekviv.), parfipirmā pievienotā aminoskābe vai 5 ekv. pārējām aminoskābēm) tika savienotas vai nu ar DIEA (5 ekv. pievienotai aminoskābei) vai HOBt/DIC (6 ekv./5 ekv.) DMF a.pēdaserFmoc aizsardzības noņemšana, izmantojot 2 procentus (v/v) DBU DMF (2 reizes, 2 minūtes laikā, 8 ml). Un visi soļi tika mazgāti 5 reizes ar DMF. Galīgā gallskābe tika savienota ar lizīnu pievienotiem peptīdiem.Pēc gallskābes savienošanas sveķi bijaafiltrēts, mazgāts,un žāvē augstā vakuumā. Šķelšanas šķīdums (TFA:dejonizēts [DI] ūdens: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, tilp./tilp. procenti ) tika apstrādāts 2 stundaslai iegūtu neapstrādātus peptīdus. Neapstrādāti peptīdi tika nogulsnēti un trīs reizes mazgāti ar aukstu dietilēteri.

Analītiskā apgrieztās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija(RP-HPLC) tika veikta ar Waters 2695 separācijasModulis ar Capcell Pak C18 kolonnu (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Mobilā fāze sastāvēja no 0,05 procentiem TFA H2O (kustīgā fāze A) un 0,05 procenti TFA acetonitrilā (kustīgā fāze B).

Elucija tika panākta, izmantojot lineāro gradientu mobilajām ierīcēmB fāze no 5 procentiem līdz 65 procentiem 30 minūšu laikā pie aminimālais ātrums 1.0 ml 1. Peptīdu virsotnes tika noteiktas pie viļņa garuma 230 nm. Daļēji sagatavošanās RP-HPLC tika veikta ar Waters HPLC sistēmu (Pump 600E, Detector UV-484) ar Gemini RP-C18.kolonna (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Mobilā fāze sastāvēja no 0,05 procentiem TFA H2O (mobilā fāze A)un 0,05 procenti TFA acetonitrilā (kustīgā fāze B). Elucija tika panākta, izmantojot lineāro gradientu kustīgajai fāzei B7 procenti līdz 22 procenti 15 minūtēs pie alplūsmas ātrums 10 ml min 1. Thepeptīdu virsotnes tika noteiktas spektrofotometriski pie viļņa garuma 230 nm.

Sintezētie peptīdi tika izšķīdināti 5% skudrskābē ūdenī un analizēti ar elektrosmidzināšanas jonizāciju (ESI)/četrpoles laikslight (Q-TOF) tandēma masas spektroskopija(MS) sistēma (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Paraugi tika ievadīti Q-TOF sistēmā, kas aprīkota arnano izsmidzināšanas avots pie allikme 1mL min 1. ESI jonsavota parametri bija šādi: jonu izsmidzināšanas spriegums 1,5 kV, aizkaru gāze pie 10 psi un apvalka gāze pie 5 psi. Spektri iekšāpilnas skenēšanas režīms un MS/MS tika apkopoti diapazonām/z

100–1200 Da ar uzkrāšanas laiku 25 ms uz spektru.Sadursmes enerģija tika palielināta no 10 līdz 80. Rezultātādati tika iegūti, izmantojot Analyst TF soizstrādājumi un automātiskipiešķirts ar centroīdu 80 procentiem ar minimālo maksimumu, trokšņu samazināšanu par 10 procentiem, vidēju deizotopēšanu ar 3 procentu slieksni, bez trokšņa samazināšanas un bez izlīdzināšanas. Tika identificēti sintezētie peptīdiar masas pielaidi 0.05 Da un manuāli secīgi, izmantojot MS/MS pielaidi 0.01 Da.

2.3. Šūnu kultūras un dzīvotspējas testi

Cilvēka, pieaugušā, zema kalcija, augstas temperatūras (HaCaT) šūnasun CCD{0}}Sk (normāla cilvēka ādafibroblastu) šūnas bijakultivēts DMEM ar 10% FBS un 1% penicilīna/streptomicīns. Šūnas tika inkubētas 37 ° C temperatūrā C mitrinātā gaisa kamerā ar 5 procentiem CO2.Dzīvotspējas pārbaudēm tika izmantots šūnu skaitīšanas komplekts-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Pekina, Ķīna). HaCaT un CCD-1064Sk šūnastika iesēti 96-iedobju mikroplatēs (5 103 šūnas katrā iedobē) un inkubēja 37 °C temperatūrā C 5 procentos CO2 uz 24h. Pēc tam kultūras tika pakļautas dažādām sintezēto peptīdu vai GA koncentrācijām un inkubēja 37 ° C temperatūrā. C 5 procentos CO2 uz 24h. Šūnu dzīvotspējapēc tam tika mērīts, izmantojot CCK{0}}, ievērojot ražotāja norādījumus.

2.4. Antioksidantu aktivitātes noteikšana

2.4.1. DPPH tests.Sintezētā antioksidanta aktivitātepeptīdi un GA tika novērtēti atsevišķi, izmantojot DPPH testu. DPPH testi tika veikti pēc iepriekš ziņotā

metodika ar nelielām modifikācijāmkatjonu.12,14–16 Pirmkārt, 0,12 mg ml 1 DPPH šķīdumu sagatavoja metanolā, pēc tam 100mL DPPH šķīduma un 100mL sintezēto peptīdu vai GA tika sajaukti dažādās koncentrācijās ({{0}},1 mM, 0.05 mM, 0,01 mM un 1mM) 96-iedobes mikroplāksnēs. Orbitālā kratīšanas inkubatorāmaisījumi tika reaģēti 30 minūtes 37 ° C temperatūrā C un 100 apgr./min bezgaismas. Pēc tam tika mērīta absorbcija pie 517 nm un aprēķināta antioksidanta jauda.

2.4.2. ROS attīrīšanas darbība.

Intracelulārā ROS attīrīšanas aktivitāte tika novērtēta, izmantojot 20,70-dihlorfluoresceīna diacetāta komplektu(DCF-DA, Abcam, ASV). HaCaT šūnas tika iesētas 96-iedobju mikroplatēs (5 103 šūnas katrā iedobē) un inkubēja 37 °C temperatūrā C 24 stundas.Apēdasinkubācijas laikā kultūras tika pakļautas sintezētajiem peptīdiem vai GA (100mM) un inkubēja 37 ° C temperatūrā C 24 stundas. Pēc tam šūnas tika pakļautas 10mM DCF-DA šķīdumu un inkubēja 30 minūtes. ApēdasPēc inkubācijas šķīdums tika mazgāts ar PBS. Thešūnas tika analizētas, izmantojot mikroplašu lasītāju ierosināšanas laikā un

emisijas viļņu garumi attiecīgi 485 nm un 530 nm.

1. attPeptīdu sintētiskais solis un secības apstiprināšana, izmantojot kvadrupola laikulidojums(Q-TOF) masas spektrometrija: (a) detalizēta sintētiskā procedūra (b) TPPTTP, (c) galloils–TPPTTP un (d) (galoils)2–KTPPTTP.

2.5. Mitohondriju membrānas potenciāla pārbaude

Mitohondrijiem tika izmantota krāsviela JC-1 (Thermo Fisher, ASV).membrānas potenciāla (MmP) tests. CCD-1064Sk un HaCaT šūnas tika iesētas 96-iedobes mikroplatēs (5 10 3šūnas vienā iedobē)

un inkubēja 37 C un 5% CO2 uz 24h. Aftvai inkubācija,kultūras tika pakļautas dažādām sintezēto peptīdu koncentrācijām un inkubētas 37 °C temperatūrā C 5 procentos CO2 uz 24h.JC-1 krāsviela tika pievienota CCD-1064Sk un HaCaT šūnām, lairažot a galīgā koncentrācija 10mM. Apēdas10 minūšu inkubācijas laikā šūnas divas reizes mazgāja ar 37 C PBS. Zaļa un sarkanaFluorescencestika mērīti, izmantojot Varioskan LUXDaudzmodu mikroplašu lasītājs (ThermoFisher, ASV)tācija (lPiem)/emisija (lEm) 475/530 nm un alPiem/lEmno 475/attiecīgi 590 nm.

2.6. Elastāzes inhibējošās aktivitātes tests

CCD{0}}Sk šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs un inkubētas 37 °C temperatūrā C 5 procentos CO2 uz 24h. Pēc tam kultūras tika pakļautas 100 koncentrācijāmM sintezēto peptīdu vai GA un inkubēts 37 °C temperatūrā C 5 procentos CO2 uz 24h. Šūnas divas reizes mazgāja ar dPBS, un mēs savācām katru šūnu, izmantojot šūnu skrāpi. Aer pievienojot 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) ar 0,1 procentiem Triton-X uz savāktošūnas tika homogenizētas ar ultraskaņas aparātu. Homogenizēto šķīdumu centrifugēja 20 minūtes ar ātrumu 3000 apgr./minun 4 C. Pēc tam apēdaser ņemot supernatantu, olbaltumvielu kvantitāti-katjons tika veikts, izmantojot BCA proteīna testu. Proteīns katramparaugs tika izsniegtsfigalīgā koncentrācija 100mgmL 1, unN-sukcinil-tri-alanil-p-nitroanilīds tika pievienotsgalīgā koncentrācija 1,6 mM un reaģēja 36 °C temperatūrā C 1 stundu.Pēc tam absorbcija tika mērīta pie 405 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju.

2.7. RT-qPCR

Pretnovecošanās marķieru mRNS līmenis CCK{1}}Sk šūnāstika novērtēti, izmantojot RT-qPCR. Kopējā RNS tika savākta, izmantojot TRIzol reaģentu (Life Technologies, Carlsbad, CA) un apgriezti.

transkribēts, izmantojot PrimeScript RT reaģentu komplektu (Takara BioInc., Kusatsu, Japāna). CFX96 sistēma (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) un iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tories) tika izmantoti RT-qPCR.b-Aktīns tika izmantots, lai normalizētu I tipa kolagēna, MMP{1}} un PGC-1 mRNS līmeni.a. 

2.8. Statistiskā analīze

 Dati tiek parādīti kā vidējie standarta novirze notrīs neatkarīgi mērījumi un analizēti, izmantojot Studenta mērījumust-testi, ar ap < 0.05 considered to be a signinevar atšķirties.

Jautājiet vairāk:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950