Apikālā bīdes spriedze, uzlabota organisko katjonu transportēšana cilvēka OCT2/MATE

Lai iegūtu vairāk informācijas:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brekeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fisell, Deanna L. Kroetz un Shuvo Roy

Bioinženierijas un terapijas zinātņu (AJ, PS, DLK, SR) un Pediatrijas (PRB) katedras,

Kalifornijas Universitāte Sanfrancisko (UCSF), Sanfrancisko, Kalifornija;

un Medicīnas departaments, Nefroloģijas nodaļa, Vanderbiltas Universitātes Medicīnas centrs, Nešvila, Tenesī (NF, WF)

KOPSAVILKUMS

Aktīvs transports panieruproksimālajiem kanāliņiem ir nozīmīga loma zāļu dispozīcijā. Zāļu izstrādes laikā aplēses parnieruizvadīšana ir būtiska devas noteikšanai. Nieru bioreaktori, kas reproducē nieru fizioloģiskos radiniekus, piemēram, plūsmas izraisītu bīdes stresu, var labāk prognozēt zāļu uzvedību in vivo nekā pašreizējie in vitro modeļi. Šajā pētījumā mēs pētījām bīdes sprieguma lomu 4-(4-(dimetilamino)-stiril)-N-metilpiridīnija jodīda (ASP plus ) aktīvajā transportēšanā, ko veic Madin-Darby suņi.nieresšūnaseksogēniski ekspresējot cilvēka organisko katjonu transportētāju organisko katjonu transportētāju 2 (OCT2) un vairāku zāļu un toksīnu ekstrūzijas proteīnu 1 (MATE1). Šūnas, kas kultivētas paralēlā plāksnē ar nepārtrauktu barotnes perfūziju, veidoja blīvu monoslāni ar augstu barjeru pret inulīnu. Reaģējot uz pieaugošo bīdes sprieguma līmeni (0.2-2 dīni/cm), šūnas uzrādīja atbilstošu ASP plus transportēšanas pieaugumu, sasniedzot maksimālo 4.2-kārtīgo pieaugumu pie 2 dynes/cm², salīdzinot ar šūnām, kas kultivētas statiskos apstākļos. Šis transports tika kavēts ar imipramīnu, norādot, ka bīdes sprieguma apstākļos bija aktīvs transports. Šūnās, kas pakļautas bīdes spriegumam 2 dīni/cm², tika novērota arī RNS ekspresijas palielināšanās gan transfektētiem cilvēkiem, gan endogēnā OCT2 (attiecīgi 3.7- un 20- reizes). Skropstu noņemšana ar amonija sulfātu novērsa bīdes ietekmi uz ASP plus transportēšanu pie 0,5 dīniem/cm², neietekmējot ASP un transportēšanu statiskos apstākļos. Šie rezultāti liecina, ka bīdes spriegums ietekmē organisko katjonu aktīvo transportēšanunierucauruļveidaepitēlija šūnas no cilijām atkarīgā veidā.

Cistanche ir laba nieru darbībai

Ievads

Neraugoties uz lielajiem sasniegumiem preklīniskajās metodēs optimālu zāļu kandidātu atlasei, zāļu izstrāde joprojām ir ilgs un dārgs process, kurā ir ļoti zems pārdoto jaunu molekulāro vienību daudzums (Watkins, 2011). Galvenais preklīnisko modeļu trūkums ir nespēja paredzēt klīrensu un toksicitāti cilvēkiem. Aptuveni 30 procenti zāļu, kas ir veiksmīgas preklīniskajos pētījumos, cilvēkiem neizdodas neparedzētu klīrensa vērtību vai toksicitātes dēļ (Kola un Landis, 2004).

Nieres ir īpaši svarīgs mērķis šūnu kultūras modelēšanai in vitro, jo tās ir atbildīgas par vairāk nekā trešdaļas visu zāļu un lielākās daļas metabolītu izvadīšanu (Morrissey et al., 2013). Thenieruproksimālais kanāliņš ir svarīgs zāļu testēšanai izstrādes laikā, jo tas veic lielāko daļu zāļu kandidātu aktīvās transportēšanas un ir īpaši jutīgs pret toksiskiem bojājumiem (Giacominiet al., 2010). Thenierukanāliņuir epitēlija šūnu vienslānis ar filtrātu, kas plūst pa apikālo virsmu. Pamata membrāna atrodas zem cauruļveida epitēlija, un blakus esošie peritubulārie kapilāri nodrošina ūdens reabsorbciju un sveicienus. Proksimālā kanāliņu mikrovide, īpaši šķidruma bīdes spriegums un apikobazālie onkotiskie gradienti, tiek nepilnīgi reproducēti ar parastajām šūnu kultūras metodēm. Epitēlija šūnu bioreaktori, kas uztver ievērojamu in vivo fizioloģiju, var uzlabot klīrensa un toksicitātes prognožu precizitāti, kas iegūtas no in vitro testiem (Pfaller un Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Pieaugošie pierādījumi liecina, ka proksimālo kanāliņu šūnu morfoloģija un funkcionalitāte var atšķirties atkarībā no augšanas vides, piemēram, augšanas virsmas porainības, šķidruma iedarbības abās pusēs un/vai šķidruma bīdes sprieguma. Iepriekšējais Essig un Friedlander (2003), kā arī mūsu laboratorijas darbs (Ferrell et al.2010) ir parādījis, ka cauruļveida šķidruma plūsmas izraisīta pārkārtošanās proksimālo kanāliņu šūnu apikālā aktīna citoskeletā (Ferrell et al., 2010) . Pēc tam vairāki pētījumi ir parādījuši, ka bīdes spriegums ietekmē vairāku uzņemšanas un izplūdes transportētāju, tostarp nātrija-ūdeņraža antiportera 3. Na/K-ATPāzes, glikozes transportētāju, epitēlija nātrija kanālu un endocitozes receptorus, megalīnu un tubulīnu, ekspresijas līmeni un lokalizāciju. (Duan et al., 2010; Raghavan et al., 2014; Jansen et al.. 2016; Ernandez et al., 2018). Cits darbs ir parādījis, ka bīdes plūsma cauruļveida bioreaktora sistēmā orientējas un pagarināsnierucauruļveidašūnas gar plūsmas ceļu (Venzac et al. 2018). In vitro pierādījumi liecina, ka dažas izmaiņas citoskeleta struktūrā un transportēšanas funkcijās, iespējams, ir saistītas ar skropstu mehanosensoro funkciju (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al...2014); tomēr dažos pētījumos ir ņemta vērā bīdes sprieguma ietekme uz zāļu transportētājiem nieru šūnās. Turklāt ir maz zināms par dažādu bīdes ātrumu ietekmi uz šūnu funkcionalitāti, īpaši ar ilgstošu bīdes sprieguma iedarbību. Lielākajā daļā pētījumu ir ņemts vērā viens bīdes sprieguma koeficients un ir veikti tikai īslaicīgi eksperimenti (1-6 stundas), tāpēc ir grūti atšķirt patieso bīdes ietekmi un šūnu stresa reakciju uz pēkšņām mikrovides izmaiņām (Duan et al.2010; Jang et al.2013: Maggiorani et al.2015).

Šeit tika izmantots mikrofluidiskais bioreaktors, lai pārbaudītu bīdes sprieguma pakāpeniskā līmeņa ietekmi uznieruproksimālo kanāliņu šūnu zāļu transportētāji organisko katjonu transportētājs 2 (OCT2) un vairāku zāļu un toksīnu ekstrūzijas proteīns 1 (MATE1). Mēs parādām, ka pieaugošais apikālais bīdes spriegums palielina organisko katjonu transportu un transportera ekspresiju un ka skropstas ir iesaistītas šajā šūnu reakcijā uz bīdes spriegumu.

Materiāli un metodes

Ierīces izgatavošana un montāža. Mēs jau iepriekš esam publicējuši savu paralēlo plākšņu bioreaktora dizainu, kas nodrošina regulējama augstuma šķidruma plūsmas ceļu pāri šūnu apikālajai pusei un statisku rezervuāru bazālajā pusē (Brakeman et al., 2016). Šeit aprakstītajam darbam mēs pielāgojām savu iepriekšējo dizainu, lai izveidotu multipleksētu ierīci ar četriem atsevišķiem plūsmas ceļiem, lai vienlaikus varētu pārbaudīt četrus bioloģiskos apstākļus (1. att.). Katrai ierīcei ir trīs slāņi: pamatne ar 5-ml apikālu rezervuāru, vidējā plāksne Snapwell ieliktņa turēšanai (Costar, Corning, Corning, NY) ar 1,12 cm² šūnu laukumu un augšējā plāksne ar no 1- līdz 2- ml bazolaterālais rezervuārs. Plāksnes

tika apstrādāti no polisulfona, lai varētu sterilizēt autoklāvā. Ar lāzeru izgrieztas silikona blīves ar augstumu 500- līdz 1000- um tika iestiprinātas starp katru plākšņu komplektu, lai noslēgtu šķidruma nodalījumus, un apikālajā pusē, lai noteiktu kanāla augstumu. Bioreaktors tika samontēts, izmantojot skrūves. Mediju rezervuārs un burbuļu slazds bija iebūvēti kolonnā. Ieplūdes un izplūdes atveres tika savienotas, izmantojot dzeloņveida savienotājus, ar Masterflex LS14 silikona caurulēm ar 16- mm iekšējo diametru (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Šķidruma plūsma un tādējādi apikālās bīdes spriegums tika iestatīts un kontrolēts ar peristaltisku sūkni (Cole Parmer).

Šūnu kultūra un plūsma. MDCK šūnas, kas tika transficētas ar tukšu vektoru vai uzņemšanas un izplūdes transportētāju pāri (hOCT2/hMATE1) (Konig et al.2011), nodrošināja Dr. Martin Fromm (Erlangena, Vācija) un kultivēja minimālā nepieciešamā barotne ar Ērla sabalansētu sāls šķīdumu (UCSF Cell Culture Facility) ar 10 procentiem liellopu augļa seruma (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) un 1 procentu penicilīna-streptomicīna (UCSF Cell Culture Facility). Pieci simti mikrogramu mililitrā higromicīna (UCSF Cell Culture Facility) un 100 mg/h ml geneticīna (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tika pievienoti barotnei, kas paredzēta dubulti transfektētajām šūnām. Plūsmas eksperimentiem hOCT2/hMATE1 MDCK šūna tika pārklāti Snapwell ieliktņu (Corning) apakšpusē ar blīvumu 300,{11}} šūnas/iedobē (250,000 šūnas/cm"), audzēti statiskos apstākļos līdz saplūšanai. un pēc tam ievietoti Apikālā barotnes plūsma tika palielināta 7 dienu laikā no 0,1 līdz 1-6mlmin, līdz tika sasniegts vēlamais bīdes spriegums, un pēc tam to atstāja stabilā stāvoklī 72 stundas pirms eksperimenta. Šūnas tika audzētas statiskos apstākļos tikpat ilgu laiku kā kontroles šūnas. .

Imunofluorescence. Šūnas tika fiksētas ar 4% paraformaldehīdu (Thermo Fisher Scientific), caurlaidīgas ar 0,1% Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) un bloķētas ar liellopu seruma albumīnu (Sigma-Aldrich). Pēc tam tos 60 minūtes inkubēja ar Alexa 488 iezīmētu zonula occludens-1 peles monoklonālo antivielu (Life Technologies, Carlsbad, CA) vai primāro acetilēto tubulīna peles monoklonālo antivielu (Life Technologies). Šūnas, kas apstrādātas ar a-tubulīna antivielu, pēc tam tika inkubētas ar sekundāro 561 anti-peļu kazu antivielu (Life Technologies) un faloidīnu (Thermo Fisher Scientific) F-aktīna krāsošanai. Attēlveidošana tika veikta, izmantojot Nikon (Tokija, Japāna) spektrālo konfokālo mikroskopu ar 40x eļļas objektīvu.

Barjeras veiktspēja. Inulīns, 5000 Da polimērs, ir labi zināms glomerulārās filtrācijas ātruma marķieris un proksimālo kanāliņu necaurlaidības marķieris in vivo (Sohtell et al, 1983):

Apikālajai barotnei tika pievienots FITC marķēts inulīns (Sigma-Aldrich) un ļauts plūst caur ierīcēm. Paraugi tika savākti no bazālā rezervuāra ik pēc 24 stundām un analizēti attiecībā uz inulīna saturu, izmantojot Genios Pro fluorescences plākšņu lasītāju (Tecan, Mannedorf, Šveice). Šūnu monoslāņa barjerfunkcija tika aprēķināta no inulīna līmeņiem, kas izmērīti apikālajā un bazālajā nodalījumā, kā aprakstīts vienādojumā 1. Šeit Capital ir inulīna koncentrācija apikālajā nodalījumā, un C Mal ir koncentrācija bazālajā nodalījumā. Inulīna noplūde tika aprēķināta kā koncentrācija bazālajā (donora) nodalījumā, dalīta ar šūnu laukumu pēc 24 stundām.

ASP plus transports. Transducētie transportera gēni tika inducēti ar 10 mM Na-butirātu (Sigma-Aldrich) 24 stundas pirms transportēšanas eksperimenta, kā aprakstīts iepriekš (Konig et al, 2011). Ja nepieciešams, šūnas tika inkubētas ar inhibitoru (500 μM imipramīnu vai 1 mM cimetidīnu (Sigma-Aldrich)) bazālajā pusē 30 minūtes, kam sekoja 25 μM 4-(4-dimetilamino) pievienošana. stiril-N-metilpiridīniju (ASP plus ) (Life Technologies) un inkubē 1 stundu. Paraugi tika savākti no apikālās un bazālās barotnes. Pēc tam šūnas trīs reizes izskaloja ar ledus aukstu fosfātu buferšķīdumu un lizēja, lai izmērītu ASP, kā arī uzkrāšanos un transportēšanu. Transportēšanas eksperimenti vienlaikus tika veikti šūnām bīdes spriegumā un kultivētas statiskos apstākļos. ASP plus koncentrācija tika kvantitatīvi noteikta ar Genios Pro fluorescences plākšņu lasītāju (Tecan) ar ierosmes viļņa garumu 485 nm un emisijas viļņa garumu 590 nm.

Olbaltumvielu kvantitatīva noteikšana. Šūnas tika lizētas ar 1% SDS-10 M NaOH līzes buferšķīdumu, kratot nakti. Olbaltumvielu saturs tika mērīts, izmantojot standarta Pierce BCA proteīna testa komplektu (Thermo Fisher). Vajadzības gadījumā olbaltumvielu saturs tika normalizēts līdz šūnu augšanas zonai.

RNS ekspresija. RNS tika ekstrahēta no šūnām, izmantojot RNeasy RNS ekstrakcijas komplektu (Qiagen, Hilden, Vācija), un cDNS tika ģenerēta, izmantojot skriptu komplektu (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNS tika izmantota cilvēka un suņa OCT2 un MATE1 un MATE1 noteikšanai. suņa P-glikoproteīns (P-GP) ar kvantitatīvu reversās transkriptāzes-polimerāzes ķēdes reakciju, izmantojot Tagman testu un zondes (Applied Biosystems) ar Fast Realtime PCR instrumentu (Applied Biosystems). Ribosomu proteīns S18 (RS-18) tika izmantots kā mājturības kontrole. Bīdes sprieguma ietekme uz transportera ekspresiju tika analizēta, izmantojot 4ACt metodi, izmantojot transportera līmeņus, kas izteikti attiecībā pret RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen and Livak, 2008). P-GP tika izmantots kā mērs bīdes sprieguma globālajai ietekmei uz transportera ekspresiju.

Decilācija. Šūnas tika audzētas līdz saplūšanai un pēc tam inkubētas bez 30 mM amonija sulfāta (Fluka AG) vai tā klātbūtnē 24 stundas pirms ASP plus transportēšanas mērīšanas (Oxergard et al 2009). Skropstu klātbūtne tika noteikta, attēlveidojot a-tubulīnu, kā aprakstīts jau šeit.

Statistika. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros, katrā eksperimentā veicot vismaz divus tehniskos atkārtojumus. Dati ir izteikti kā vidējais ± SD un attēloti kā lodziņa un ūsu diagrammas. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot nesapārotu vienvirziena vai divvirzienu dispersijas analīzi un P vērtību<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Rezultāti

Šūnu morfoloģija un barjeras funkcija. Immunofluo nesen veiktā zemplūsmas šūnu analīzē atklāja vienmērīgu monoslāņa veidošanos ar blīvu savienojumu proteīnu zonula occludens -1, kas lokalizēts ciešos savienojumos starp šūnām gan statiskos, gan plūsmas apstākļos (2. att., A–C). Kopējā proteīna satura kvantitatīvā noteikšana uzrādīja līdz pat 16-proteīna satura pieaugumu uz vienu kvadrātcentimetru monoslāņa, reaģējot uz bīdes spriegumu (2. att.). Pēc tam mēs izmērījām inulīna, proksimālās kanāliņu noplūdes marķiera, caurlaidību visā monoslānī. Ierīces saglabāja barjeras veiktspējas līmeni 97,9 procenti 6 1,42 procenti 7 dienu kultivēšanas laikā zem bīdes sprieguma līdz 2 dīniem/cm2 (2. E attēls), kā rezultātā tika iegūts galīgais inulīna noplūdes ātrums 6. dienā { {15}},13–0,69 mg/cm2 dienā.

Bīdes sprieguma ietekme uz organisko katjonu transportu. ASP plus , OCT2 un MATE1 automātiski fluorescējoša substrāta transportēšana tika mērīta 1 stundu pie dažādiem bīdes sprieguma līmeņiem (0.2-2 dynes/cm²). MDCK šūnas, kas eksogēni ekspresē hOCT2 un hMATE1, uzrādīja 4.{9}} ASP plus transportēšanas pieaugumu, reaģējot uz bīdes spriegumu 2 dines/cm², kas atspoguļojas gan šūnu uzkrāšanās (3.A att.), gan transcelulārā transporta rādītājos (Zīm. 3B). Bīdes sprieguma ietekme uz ASP plus uzkrāšanos vai transcelulāro transportu bija līdzīga pie bīdes sprieguma 0,5 un 2 dīni/cm². Lai noteiktu, vai ir palielināts aktīvais ASP plus transports, tika mērīts ASP plus pārnesums šūnās, kas pakļautas 0,2 dīni/cm bīdes spriegumam ar vai bez iepriekšējas apstrādes ar 500 uM imipramīnu, OCT{20}. } un MATE{21}}specifiskais inhibitors. Bīdes sprieguma apstākļos imipramīns inhibēja ASP plus transportēšanu par 60,3% ± 15,8%, salīdzinot ar 47,6% ±19,7% statiskos apstākļos (3.C attēls).

Lai labāk izprastu šo novērojumu, bīdes spriedzes ietekme uz cilvēka OCT2 (transfektēto), suņu OCT2 (endogēno) un suņu P-GP (endogēno) ekspresiju tika mērīta šūnās, kas pakļautas dažāda līmeņa bīdes iedarbībai 72 stundas pēc lēna bīdes palielināšanās 7 dienu laikā (4. att.). Salīdzinājumā ar šūnām, kas kultivētas statiskos apstākļos, MDCK šūnām, kas pakļautas bīdes iedarbībai, bija paaugstināta transfektētā cilvēka un endogēnā OCT2 ekspresija (attiecīgi līdz 37- un 20-reizēm), bez būtiskas ietekmes. par transfektētā MATE1 vai endogēnā P-GP ekspresiju.

Čilijas loma atbildē uz bīdi. Attēlveidošana parādīja, ka divreiz transfektētas MDCK šūnas ekspresē skropstas gan statiskos, gan plūsmas apstākļos (5. att., A un E). Šūnu pakļaušana 30 mM amonija sulfāta iedarbībai 24 stundas izraisīja pilnīgu skropstu zudumu (5. attēls, C un G). Svarīgi ir tas, ka decilācijai nebija rupjas ietekmes uz šūnu un membrānu savienojumiem, ko mēra ar F-aktīna attēlveidošanu, kas noenkuro ciešas savienojuma olbaltumvielas šūnu un membrānu savienojumos epitēlija šūnās (5. D un HD att. (Stīvensons un Begs. 1994). Lai gan šajos attēlos ir vērojama zināma F-aktīna krāsojuma sabiezēšana, tas nebija konsekvents konstatējums, un tāpēc mēs nenoteicām šo efektu kvantitatīvi. Decilācija neietekmēja statiskos apstākļos kultivētu šūnu transportēšanu. likvidēja bīdes sprieguma ietekmi uz ASP plus transportēšanu šūnās, kas pakļautas 0,5 dīniem/cm² bīdes (6. att.).

Diskusija

Nieres spēlē galveno lomu narkotiku izvadīšanā cilvēka organismā. Ir svarīgi precīzi atdarināt nieru fizioloģijas sarežģītību in vitro zāļu testēšanai, jo īpaši attiecībā uz šķidruma plūsmu. Ir pierādīts, ka šķidruma plūsmas radītais bīdes spriegums ietekmē šūnu morfoloģiju un jonu transportētājus in vitro, taču ir maz zināms par ietekmi uz zāļu transportētājiem (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016). . Turklāt lielākajā daļā iepriekšējo pētījumu ir mērīta tikai īslaicīgas bīdes (1-6 stundas) ietekme, kas, visticamāk, pilnībā nenošķirs bīdes sprieguma ietekmi no citām šūnu stresa reakcijām (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al.. 2015). Šajos pētījumos mēs koncentrējāmies uz ilgstošas ​​(7 dienas) šķidruma plūsmas bīdes sprieguma ietekmi uz zāļu transportēšanu, lai labāk atdarinātu ilgstošu bīdes spriegumu, ko izjūtnierucauruļveidašūnas in vivo.

Izpratne par to, kā zāļu transportētāji reaģē uz ilgstošu bīdes stresu, var uzlabot in vitro prognozes par zāļu apstrādi in vivo nierēs. Precīzi izstrādāti nieru in vitro modeļi var standartizēt preklīniskos testus un samazināt zāļu neveiksmes rādītājus.

Šajā darbā tika izmantots paralēlo plākšņu mikrofluidiskais bioreaktors, lai noteiktu ilgstošas ​​bīdes sprieguma ietekmi uz organisko katjonu transportēšanu ar OCT2 un MATE1.nierukanāliņušūnu līnija. Šajos pētījumos tika ņemtas vērā vairākas šūnu līnijas, tostarp cilvēka šūnu līnijas, piemēram, cilvēka proksimālās kanāliņu šūnas no Hopfer grupas (Orosz et al, 2004) un RPTEC (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA) ( Wieser et al., 2008), bet dubulti transfektētās hOCT2 / hMATE1 MDCK šūnas tika uzskatītas par vispiemērotāko izvēli šim pētījumam vairāku iemeslu dēļ. Pirmkārt, MDCK šūnas konsekventi demonstrē spēcīgu stiprinājumu pie transwell ieliktņiem, kas ļauj tām izturēt sākotnējo šķidruma plūsmas stresu. Otrkārt, šīs šūnas veido blīvus monoslāņus, kas novērš noplūdi un ir būtiski, lai pētītu marķieru substrātu transcelulāro transportu. Visbeidzot, transportētāju eksogēnā ekspresija ļauj labāk noteikt aktīvo transportu un traucējumu ietekmi.

Šūnas, kas novietotas zem plūsmas, veidoja saplūstošu monoslāni un šūnas perifērijā lokalizēja blīvu savienojumu proteīnu. Tie arī saglabāja augstu barjeras funkciju, ko mēra ar inulīna caurlaidību. Epitēlija šūnu spēja veidot monoslāni, kas novērš šķidruma un olbaltumvielu noplūdi, ir ārkārtīgi svarīga pareizai kanāliņu darbībai. Šeit noplūde caur MDCK šūnām bija minimāla, mazāka par 1 ug/cm² dienā un ievērojami mazāka nekā caur cilvēka šūnām. Mēs jau iepriekš esam parādījuši, ka cilvēka nieru šūnu monoslāņiem ir 10-20 ug/cm² dienā inulīna noplūde (Brakeman et al., 2016), kas apstiprina secinājumu, ka hOCT2/hMATE1 MDCK šūnas veidoja spēcīgu monoslāni.

ASP plus transportēšana tika ievērojami palielināta hOCT2 / hMATE1 MDCK šūnās, kas bija pakļautas dažāda līmeņa bīdes spriegumam 72 stundas, salīdzinot ar statiskām kontrolēm. ASP plus uzņem OCT2 (SLC22A2) un izplūst MATE1 (SLC47A1), divi organisko katjonu transportētāji, kas darbojas saskaņoti, lai atvieglotunierubieži lietotu zāļu, piemēram, metformīna un cisplatīna, sekrēciju (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). Ir ziņots par līdzīgu bīdes sprieguma ietekmi uz proksimālajiem kanāliņu jonu transportieriem. Ir ziņots par albumīna uzņemšanas, jonu reabsorbcijas, kā arī megalīna un tubulīna ekspresijas un funkcijas palielināšanos, reaģējot uz palielinātu bīdes spriegumu (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). Iedarbībanieruproksimālās kanāliņu šūnas pret bīdes stresu ir saistītas arī ar samazinātu apoptozi un ātrāku atveseļošanos pēc akūtas cisplatīna toksicitātes un pastiprinātu organisko anjonu transporta inhibīciju (Jang et al.2013). Tā kā bīdes spriegums no šķidruma plūsmas pastāvīgi atrodas proksimālajā kanāliņā, šie atklājumi kopumā atbalsta fizioloģiskāku in vitro modeļu sistēmu izmantošanu, lai prognozētu zāļu izplatību un toksicitāti nierēs. Jāatzīmē, ka starp bīdes spriegumu 0.5 un 2.0 nav būtiskas atšķirības transportētāja funkcijās. Iepriekšējie Essig un Friedlander (2003) pētījumi atklāja, ka ir nepieciešams minimālais bīdes līmenis 0,17 dīni/cm2, lai izraisītu izmaiņas šūnu morfoloģijā, un citos pētījumos ir noteikta ietekme uz fizioloģija līdz 1 dinam/cm² (Duan et al., 2010). Šis ir pirmais pētījums, lai izpētītu vairāku augstāku un ilgstošu bīdes sprieguma līmeņu ietekmi uz nieru zāļu transportētāju funkcionalitāti, un ir iespējams, ka bioloģiskās atšķirības lielums starp bīdes spriegumu 0,5 un 2,0 dīniem/cm² ir tāds, kāds mums ir. novērtētais nebija pietiekami liels, lai mūsu testos varētu identificēt atšķirības starp šiem bīdes sprieguma līmeņiem. Lai gan ir nepieciešama turpmāka izmeklēšana, mūsu rezultāti atklāj nepieciešamos apstākļus fizioloģiski nozīmīgiem modeļiem un slimības izraisītā paaugstināta bīdes sprieguma līmeņa ietekmi uz nieru zāļu apstrādi.

Viens no mūsu eksperimentālo metožu ierobežojumiem ir tas, ka mēs apskatījām transportēšanu tikai pie pH 7,4, izmantojot barotnes ar pH 7,4 gan apikālajā, gan bazālajā pusē, atdarinot eksperimentālās metodes, kas iepriekš aprakstītas hOCT2/hMATE1 MDCK šūnām (Konig et al..2011). Apikāls līdz bazālajam pH gradientam var ietekmēt OCT2 un MATE1 funkciju, un fizioloģiskos apstākļos parasti ir pH gradients (Muller et al., 2013). Tāpēc mūsu metodes ierobežoja mūsu spēju novērtēt mijiedarbību starp apikālo un bazālo pH gradientu un bīdes spriegumu uz OCT2 un MATE1 funkciju. Tā kā visos eksperimentālajos apstākļos mēs izmantojām konsekventu pH 7, 4, šis pH gradienta trūkums, visticamāk, nav ietekmējis mūsu rezultātus, taču tas potenciāli ierobežo mūsu atklājumu piemērojamību OCT2 un MATE1 transportēšanai apikāla līdz bazālā pH gradienta klātbūtnē.

Pārsteidzoši, ka transfektētā cilvēka un endogēnā OCT2 mRNS ekspresija palielinājās šūnās, kas pakļautas visiem bīdes sprieguma līmeņiem, salīdzinot ar statiskām kontrolēm. Šī transportera ekspresijas regulēšana bija specifiska, bez izmērāmas ietekmes uz endogēno P-GP ekspresiju vai transfektēto MATE1. Transportera ekspresijas regulēšana sniedz ieskatu palielinātā transporta mehānismā un var būt uzlabotas mRNS stabilitātes vai palielinātas mRNS transkripcijas rezultāts. Interesanti atzīmēt, ka gan transfektētie, gan endogēnie transportētāji tika regulēti, kas ir negaidīti, jo transfektētais OCT2 tika ekspresēts zem citomegalovīrusa promotora, un to nevajadzētu pakļaut endogēno gēnu ekspresijas regulēšanas mehānismiem. Lai arī šis novērojums ir pārsteidzošs, tas nav bezprecedenta. Ir ziņots par līdzīgu ietekmi uz OAT1 transfektētajām proksimālajām kanāliņu šūnām, kas pakļautas perfūzijai, taču palielinātās ekspresijas mehānisms joprojām nav skaidrs (Jansen et al., 2016). Citā pētījumā tika konstatēts, ka Nrf2 signalizācijai ir nozīme endogēnās MATE2-K ekspresijas palielināšanā, reaģējot uz bīdes spriegumu (Fukuda et al., 2017). Turpmāka izpēte šajā jautājumā ir pamatota, un tā būs turpmāko pētījumu priekšmets.

Mēs arī noskaidrojām, ka apikālās bīdes plūsmas ieviešana palielināja olbaltumvielu saturu uz kvadrātcentimetru šūnu. Šis efekts bija vienāds gan 0.5, gan 2dīniem/cm² bīdes, līdzīgs efektam, kas novērots mRNS ekspresijai un ASP plus transportēšanai. Ir daži pierādījumi, ka bīdes spriegums palielina garumunieruepitēlija šūnas, kas radītu lielāku šūnu tilpumu uz kvadrātcentimetru un tādējādi, iespējams, palielinātu olbaltumvielu daudzumu uz kvadrātcentimetru; tomēr šī iepriekš publicētā parādība bija tikai neliels novērojums plašākā datu kopumā un netika kvantificēts (Long et al., 2017). Kopējā proteīna palielināšanās šūnās, kas audzētas apikālās bīdes plūsmas klātbūtnē, var atspoguļot normālu olbaltumvielu saturu veseliemnierucauruļveidaepitēlija šūnas, ko var sasniegt, tikai pakļaujot šūnas apikālajai bīdes plūsmai. Tāpēc zemāks proteīna satura līmenis šūnās, kas audzētas statiskā kultūrā, var liecināt par patoloģisku šūnu stāvokli, kas klīniski varētu rasties situācijās, kad ir zema apikālā filtrāta plūsma, piemēram, akūts nieru bojājums. Šī parādība ir pelnījusi turpmāku izpēti.

Ir zināms, ka cilijām ir mehanosensoras lomas proksimālajā kanāliņā (Raghavan and Weisz, 2016). Tāpēc, lai noteiktu, vai tiem ir izšķiroša nozīme šeit aprakstītajā palielinātajā OCT2 un MATE{2}}mediētajā transportā, tika mērīta skropstu noņemšanas ietekme uz transportētāja funkciju. Pilnīga no bīdes atkarīgā ASP un transporta palielinājuma bloķēšana, noņemot skropstas mūsu pētījumos, ir līdzīga Raghavan et al pētījumos konstatētajam efektam. (2014), kuri demonstrēja no skropstiņiem atkarīgu endocitozes regulēšanu, reaģējot uz šķidruma plūsmu. Amonija sulfātam, iespējams, ir cita neraksturīga ietekme uz šūnu uzvedību un funkcionalitāti, kas var netieši ietekmēt izšķīdušās vielas transportēšanu. Neraugoties uz iespējamiem ārpusmērķa efektiem, šī atdalīšanas metode pārbauda ciliārās noteikšanas lomu organisko izšķīdušo vielu transportētājā kustībā. Signalizācijas mehānisms starp mehāniski sensorajiem proteīniem ciliā un transportētāju pašlaik nav zināms. Viena hipotēze ir tāda, ka organisko katjonu transportētāju funkcijas maina mainīts jonu transports. Ir zināms, ka skropstu noņemšana maina izšķīdušās vielas kustīgumu proksimālajās kanāliņu šūnās, īpaši samazinot Nat/K plus . ATPāzes membrānas lokalizācija un paracelulārā transporta modificēšana (Overgaard et al., 2009). Iespējams, ka tas izraisa izmaiņas MATE1 funkcijā, antiporterā, kas ir atkarīgs no H gradienta. Vēl viena hipotēze ir tāda, ka bīdes sprieguma noteikšana ietekmē organisko katjonu transportētāju ekspresiju. Bīdes spriegums modulē MATE{11}}K funkciju, izmantojot signālu Nrf2 (Fukuda et al., 2017). Citi organisko katjonu transportētāji var reaģēt līdzīgi uz bīdes spriegumu, kas tiktu novērsts, kad tiek noņemtas mehanosensorās skropstas. Liela daļa no tā nav zināma un prasa turpmāku izpēti. Interesanti, ka skropstu noņemšana būtiski neietekmēja ASP plus transportēšanu ar šūnām, kuras bija pakļautas bīdes spriegumam 0, 2 dīni / cm², bet spēcīga ietekme tika novērota, kad bīdes spriegums tika palielināts līdz 0, 5 dynes / cm2. Tas liek domāt, ka skropstas sajūt sliekšņa bīdes sprieguma līmeni; savukārt skropstas signalizē par izmaiņām transportētāja izteiksmē un funkcijās, pirms ir sagaidāma izmērāma ietekme uz transportu. Kopumā organisko katjonu transporta atkarība no bīdes sprieguma ciliārās uztveršanas sniedz ieskatu iesaistītajā mehanosensorajā signalizācijas ceļā un minimālajā sprieguma līmenī, kas varētu būt nepieciešams, lai izraisītu spēcīgu reakciju uz bīdi.

Kopumā šie dati parāda, ka šķidruma plūsmas radītais bīdes spriegums būtiski ietekmē organisko katjonu transportera funkciju un ekspresiju MDCK šūnās. Turklāt organisko katjonu transporta regulēšana bija atkarīga no skropstu klātbūtnes. Mēs ierosinām, ka apikālais bīdes spriegums ir svarīga jebkuras in vitro modelēšanas sastāvdaļanierucauruļveidašūnām un, iespējams, ir svarīga sastāvdaļa, modelējot zāļu nieru sekrēcijas klīrensu un nefrotoksicitāti. Īpašais mehānisms, ar kuru mehāniskie sprieguma signāli palielina transportētāja aktivitāti un ekspresiju, joprojām ir neskaidrs, un tas prasa turpmāku izpēti.

Atsauces

Astashkina A, Mann B un Grainger DW (2012) In vitro šūnu kultūras modeļu kritisks novērtējums augstas caurlaidības zāļu skrīningam un toksicitātei. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, and Ciarimboli G (2006) Cilvēka organisko katjonu transportētāja regulējošo mehānismu un stāvokļu raksturojums 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH un Ferrell N (2016) Modulārs mikrofluidisks bioreaktors ar uzlabotu caurlaidspēju polarizētu nieru epitēlija šūnu novērtēšanai. Biomikrofluidika 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S un Wang T (2010) Bīdes stresa izraisītas izmaiņas membrānas transportera lokalizācijā un ekspresijā peles proksimālajās kanāliņu šūnās. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY un Feraille E (2018) Savienības nefrektomija un apikālā šķidruma bīdes spriegums samazina ENaC pārpilnību kanālu galveno šūnu savākšanā. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M un Friedlander G (2003) Cauruļveida bīdes spriegums un nieru proksimālo cauruļveida šūnu fenotips. J Am Soc Nephrol 14 (1. pielikums): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD un Fissell WH (2010) Mikrofluidisks bioreaktors ar integrētiem transepiteliālās elektriskās pretestības (TEER) mērīšanas elektrodiem nieru epitēlija šūnu novērtēšanai. Biotechnol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT un Fissell WH (2012) Albumīna apstrāde ar nieru kanāliņu epitēlija šūnām mikrofluidiskā bioreaktorā. Biotechnol Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT un Fissell WH (2012) Mikrofluidisks bioreaktors epitēlija šūnu pētījumiem šķidruma bīdes sprieguma apstākļos. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M un Kawamata Y (2017) Šķidruma bīdes spriegums stimulē MATE2-K ekspresiju, aktivizējot Nrf2 ceļu. Biochem Biophys Res Commun 484:358–364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM u.c.; International Transporter Consortium (2010) Membrānas transportētāji zāļu izstrādē. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY un Ingber DE (2013) Cilvēka nieres proksimālais kanāliņos uz mikroshēmas zāļu transportēšanai un nefrotoksicitātes novērtēšanai. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansens J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF u.c. (2016) Bioinženierijas nieru kanāliņi efektīvi izvada urēmiskos toksīnus. Sci Rep 6:26715.

Kola I un Landis J (2004) Vai farmācijas nozare var samazināt nodiluma rādītājus? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C un Fromm MF (2011) Divkārši transfektētas MDCK šūnas, kas ekspresē cilvēka OCT1/MATE1 vai OCT2/MATE1: organisko katjonu uzņemšanas un transcelulārās translokācijas noteicošie faktori. Br J Pharmacol 163:546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ un Weisz OA (2017) Proksimālo kanāliņu apikālo endocitozi modulē šķidruma bīdes spriegums, izmantojot mTOR atkarīgu ceļu. Mol Biol Cell 28:2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL u.c. (2015) Bīdes stresa izraisītas epitēlija organizācijas izmaiņas cilvēka nieru kanāliņu šūnās. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L un Giacomini KM (2013) Nieru transportieri zāļu izstrādē. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K un Fromm MF (2013) Organisko katjonu transportētāja OCT2 un vairāku zāļu un toksīnu ekstrūzijas proteīnu MATE1 un MATE2-K loma pretvīrusu lamivudīna transportēšanā un zāļu mijiedarbībā. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI u.c. (2004) Normālu pieauguša cilvēka proksimālo kanāliņu šūnu augšana, iemūžināšana un diferenciācijas potenciāls. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A un Yeaman C (2009) Deciliation ir saistīta ar dramatisku epitēlija šūnu savienojumu un virsmas domēnu pārveidošanu. Mol Biol Cell 20:102–113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR, and Day MJ (2007) Vairāku iekšējo atsauces (mājsaimnieces) gēnu testu izstrāde un pielietošana suņu gēnu ekspresijas pētījumu precīzai normalizēšanai. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W un Gstraunthaler G (1998) Nefrotoksicitātes pārbaude in vitro{1}}ko mēs zinām un kas mums jāzina. Environ Health Perspect 106 (2. papildinājums): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD un Weisz OA (2014) No bīdes stresa atkarīgā apikālās endocitozes regulēšana nieru proksimālajās kanāliņu šūnās, ko mediē primārās skropstas. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V un Weisz OA (2016) Mehanosensorās lomas noteikšana proksimālo kanāliņu funkcijas regulēšanā. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD un Livak KJ (2008) Analizējot reālā laika PCR datus ar salīdzinošo C(T) metodi. Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B un Ulfendahl H (1983) FITC-inulīns kā nieru kanāliņu marķieris žurkām. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stīvensons BR un Begs DA (1994) No koncentrācijas atkarīgā citohalazīna D ietekme uz ciešiem savienojumiem un aktīna pavedieniem MDCK epitēlija šūnās. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S u.c. (2018) Mazu cauruļu ar diametra izmaiņām projektēšana nieru šūnu organizācijas izpētei. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Zāļu drošības zinātnes un vājās vietas zāļu izstrādē. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J un Grillari-Voglauer R (2008) hTERT vien iemūžina nieru proksimālo kanāliņu epitēlija šūnas, nemainot to funkcionālās īpašības. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y un Giacomini KM (2013) Spēcīgu, selektīvu vairāku zāļu un toksīnu ekstrūzijas transportera 1 (MATE1, SLC47A1) inhibitoru atklāšana izmantojot recepšu medikamentu profilēšanu un skaitļošanas modelēšanu. J Med Chem 56:781–795.